【摘要】目的 探討植物同源域指蛋白6(PHF6)對肝癌Hep-G2細(xì)胞遷移能力的影響,為臨床診療提供參考。方法 根據(jù)癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫分析PHF6在人正常肝臟和肝癌組織的表達(dá)情況,以及其表達(dá)對300余例肝癌患者近十年生存率的影響。比較siNC組(轉(zhuǎn)染PHF6無義序列)和siPHF6組(轉(zhuǎn)染siRNA-PHF6)細(xì)胞PHF6 RNA表達(dá)水平,利用劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測兩組細(xì)胞遷移能力,通過實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測兩組細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)基因表達(dá)情況。結(jié)果 PHF6在肝癌患者中存在明顯過表達(dá)現(xiàn)象,高表達(dá)PHF6患者存活率降低。轉(zhuǎn)染48 h后,siPHF6組細(xì)胞中PHF6 RNA表達(dá)水平低于siNC組(P=0.0016)。劃痕后12、24、48、72 h,siPHF6組細(xì)胞劃痕距離均大于siNC組,siPHF6組細(xì)胞遷移數(shù)量小于siNC組。與siNC組相比,siPHF6組細(xì)胞神經(jīng)鈣黏蛋白(CDH2)、纖連蛋白(FN1)的表達(dá)水平均降低,CDH1的表達(dá)水平升高(Plt;0.0001、Plt;0.0001、P=0.0018)。結(jié)論 沉默PHF6可顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移和EMT進(jìn)程,靶向PHF6治療肝癌具有應(yīng)用前途。
【關(guān)鍵詞】植物同源域指蛋白6;肝癌;Hep-G2;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化
【中圖分類號】R394 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2096-2665.2025.02.0045.04
DOI:10.3969/j.issn.2096-2665.2025.02.014
肝癌是全球死亡率排名第三的癌癥,肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是原發(fā)性肝癌的主要類型,占85%~90%[1-2]。目前,肝切除手術(shù)和肝移植能顯著延長早期HCC患者的生存時間,但晚期患者復(fù)發(fā)率高、預(yù)后較差[3-4]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有遷移能力的間充質(zhì)細(xì)胞的過程。在這一過程中,上皮細(xì)胞逐漸失去黏附性,并明顯表現(xiàn)出間充質(zhì)細(xì)胞的特征,即細(xì)胞角蛋白Cytokeratins、上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(CDH1)等上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)下調(diào),神經(jīng)鈣黏蛋白(CDH2)、波形蛋白(Vimentin)、纖連蛋白(FN1)等間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)增強(qiáng)[6]。癌癥分子靶向治療對治療肝細(xì)胞癌具有重要臨床意義。植物同源域指蛋白6(PHF6)是一種位于細(xì)胞核的染色質(zhì)結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白,具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。該基因位于人類染色體Xq26.3,屬于X連鎖基因,其突變在B?rjeson-Forssman-Lehmann綜合征中被發(fā)現(xiàn)[7-8]。 PHF6幾乎表達(dá)于所有組織,對神經(jīng)發(fā)育和造血很重要。在造血干細(xì)胞中敲除PHF6,可增加細(xì)胞自我更新能力,驅(qū)動血癌發(fā)生,因此PHF6被認(rèn)為是一種抑癌基因[9-10]。敲除PHF6損害細(xì)胞增殖使其停滯在G(2)/M期,表明PHF6缺乏導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷的積累[11]。然而, PHF6是否影響肝癌生長和轉(zhuǎn)移及作用機(jī)制尚未報道?;诖耍狙芯刻骄縋HF6對肝癌細(xì)胞Hep-G2遷移能力的影響。
1 材料和方法
1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 取Hep-G2肝癌細(xì)胞株(購自美國模式培養(yǎng)保藏中心),在飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(5% CO2、 37 ℃),培養(yǎng)基含有10%胎牛血清(FBS)(購自Sigma公司)和1%青鏈霉素的DMEM(購自Gibco公司)。細(xì)胞融合率達(dá)≥80%時用0.25%的胰酶(購自Gibco公司)37 ℃消化1 min后傳代。實(shí)驗(yàn)分為siNC組(轉(zhuǎn)染 PHF6無義序列)、 siPHF6組(轉(zhuǎn)染siRNA-PHF6),每組使用的細(xì)胞數(shù)均為8×104個/ml細(xì)胞,每組設(shè)置3組重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
1.2 轉(zhuǎn)染PHF6基因 將8×104個/ml Hep-G2細(xì)胞接種于6孔板,每孔2 mL培養(yǎng)液,培養(yǎng)8~12 h,融合率達(dá)40%進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine ? RNAiMAX Reagent (購自Invitrogen公司)9 μL稀釋于150 μL Opti-MEM? Medium中,同時將2 μL(30 pmol)siRNA 儲存液加入150 μL opti-MEM? Medium中混合,室溫孵育5 min 后將二者混勻, 4 ℃ 孵育15 min后滴加到對應(yīng)孔中,培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)液, 24~48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 siRNA-PHF6核酸序列如下:正義鏈, 5'-GGCCUACAAGACAGCGCAATT3'-;反義鏈:5'-UUGCGCUGUCUUGUAGGCCTT3'-,由金拓思(武漢)生物科技有限公司進(jìn)行設(shè)計(jì)并合成。
1.3 劃痕實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的siNC組和siPHF6組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),細(xì)胞融合度≥90%時用10 μl槍頭垂直劃痕,隨后用磷酸鹽緩沖液(購自Gibco公司)清洗細(xì)胞,去除雜質(zhì)和脫落的細(xì)胞,于培養(yǎng)0、 12、 24、 48、 72 h拍照記錄相同位置細(xì)胞的遷移變化,統(tǒng)計(jì)不同組別間細(xì)胞遷移差異。
1.4 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 在6孔板的每孔Hep-G2細(xì)胞中添加500 μl Trizol裂解液(購自TAKARA)以提取RNA,隨后測定提取RNA的濃度,并通過凝膠電泳實(shí)驗(yàn)對其質(zhì)量進(jìn)行檢測。利用PrimeScriptTMII cDNA Synthesis Kit(購自TAKARA)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,稀釋反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA,以此作為實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板。檢測兩組細(xì)胞基因表達(dá)變化,實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物序列,見表1。反應(yīng)條件:起始95 ℃、 5 min;隨后變性溫度為95 ℃,維持 15 s,退火溫度為60 ℃,維持30 s,此過程共進(jìn)行40個循環(huán)。根據(jù)2-△△CT方法計(jì)算基因表達(dá)差異, 18S作為內(nèi)參。
1.5 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 使用Transwell小室(孔徑8 μm,購于Corning公司)進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞重懸于200 μL不含血清的DMEM溶液中,然后接種于上室。下室加入500 μL含10 % FBS的DMEM培養(yǎng)基作為催化劑。 37 ℃孵育24 h后,將已遷移至下室的細(xì)胞用100%甲醇在室溫下固定30 min,利用0.5%結(jié)晶紫溶液進(jìn)行30 min染色。對染色細(xì)胞進(jìn)行觀察,顯微鏡拍照。
1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 使用GraphPad Prism 9軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪圖,數(shù)據(jù)表示為(mean±SEM);兩組間比較進(jìn)行Student t-test分析;對癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中患者生存率進(jìn)行對數(shù)秩檢驗(yàn)分析。0.01lt;Plt;0.05標(biāo)記為*, 0.001lt;Plt;0.01標(biāo)記為**, Plt;0.001標(biāo)記為***,Plt;0.0001標(biāo)記為****。
2 結(jié)果
2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫肝癌患者存活率分析 PHF6在肝癌患者中存在明顯過表達(dá)現(xiàn)象,見圖1-A;高表達(dá)PHF6患者存活率降低,見圖1-B、圖1-C。
2.2 兩組細(xì)胞PHF6 RNA表達(dá)水平比較 轉(zhuǎn)染48 h后, siPHF6組細(xì)胞PHF6 RNA表達(dá)水平低于siNC組(P=0.0016),見圖2。
2.3 劃痕、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 劃痕后12、 24、 48、 72 h, siPHF6組細(xì)胞劃痕距離均大于siNC組,見圖3-A、圖3-B。 siPHF6組細(xì)胞遷移數(shù)量小于siNC組,見圖3-C。
2.4 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析結(jié)果 與siNC組相比, siPHF6組細(xì)胞CDH2、 FN-1的表達(dá)水平降低, CDH1的表達(dá)水平升高(Plt;0.0001、 Plt;0.0001、 P=0.002),見圖4。
3 討論
PHF6的體細(xì)胞功能突變在T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。═-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)中非常普遍,也存在于急性骨髓白血?。╝cute myeloid leukemia,AML)中,且敲除PHF6基因的造血干細(xì)胞(HSC)的重建和自我更新能力增強(qiáng),這均表明PHF6可能是一種抗癌基因[12-14]。然而,PHF6在乳腺癌和結(jié)直腸癌中顯著高表達(dá),提示PHF6可能參與其他惡性腫瘤,本研究將探討其在肝癌中的作用機(jī)制。
本研究結(jié)果顯示,PHF6在肝癌患者中存在明顯過表達(dá)現(xiàn)象,高表達(dá)PHF6患者存活率降低;轉(zhuǎn)染48 h后,siPHF6組細(xì)胞中PHF6的RNA表達(dá)水平低于siNC組;劃痕后12、24、48、72 h,siPHF6組細(xì)胞劃痕距離均大于siNC組,siPHF6組細(xì)胞遷移數(shù)量小于siNC組;與siNC組相比,siPHF6組細(xì)胞CDH2、FN-1的表達(dá)水平降低,CDH1的表達(dá)水平升高。分析原因?yàn)?,EMT是指上皮細(xì)胞失去相互連接和極性,轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的現(xiàn)象。這一過程的激活是上皮癌細(xì)胞獲得惡性表型的核心機(jī)制,也是癌癥轉(zhuǎn)移和侵襲的重要環(huán)節(jié)[15]。因此,抑制EMT會干擾腫瘤的進(jìn)展。敲低PHF6可能通過上調(diào)E-cadherin和下調(diào)N-cadherin和Fibronectin-1來抑制EMT過程,繼而肝癌細(xì)胞Hep-G2細(xì)胞的遷移能力減弱。
此外, PHF6能招募組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1至rDNA(核糖體DNA)區(qū)域,并借助SUV39H1的三甲基化酶活性來提升rDNA區(qū)域組蛋白H3的9位賴氨酸殘基甲基化(H3K9me3)的水平,從而抑制rDNA轉(zhuǎn)錄。敲低PHF6則能夠通過促進(jìn) rDNA的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞增殖和腫瘤生長[16]。但在T-ALL和AML的小鼠動物模型中,敲低PHF6后腫瘤增長速率卻加快;而在小鼠的急性B細(xì)胞淋巴白血?。˙-cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)模型中,通過慢病毒技術(shù)敲低PHF6后,觀察到腫瘤的增長速率顯著減緩[17]。本研究證明敲低PHF6可抑制肝癌細(xì)胞的遷移,進(jìn)而起到治療肝癌的作用,但這是否也是PHF6作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控表觀遺傳進(jìn)程來實(shí)現(xiàn)的,仍需進(jìn)一步研究。
綜上所述,沉默PHF6可顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移和EMT進(jìn)程,靶向PHF6治療肝癌具有應(yīng)用前途。通過基因編輯技術(shù)降低PHF6的表達(dá)或開發(fā)PHF6的小分子抑制劑,特異性地降低PHF6的表達(dá)或功能,從而抑制肝癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移,可作為肝癌治療的新思路。
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