摘 要：【目的】鋅指蛋白（ZFP，Zinc Finger Proteins）是植物中的一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在植物生長發(fā)育、逆境脅迫應(yīng)答等方面具有重要的作用。通過分析剛毛檉柳Tamarix hispida鋅指蛋白基因ThZFP3的耐鹽、抗旱功能，為林木抗逆遺傳改良提供了理論基礎(chǔ)?！痉椒ā吭谕ㄟ^蘸花法獲得過表達(dá)ThZFP3轉(zhuǎn)基因擬南芥；在NaCl和Mannitol（甘露醇）脅迫下，觀察轉(zhuǎn)基因和對照擬南芥的萌芽成活率、根長、鮮質(zhì)量和表型變化；在利用農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)化體系獲得瞬時過表達(dá)（OE）、抑制表達(dá)（RNAi）和對照（Control）轉(zhuǎn)基因剛毛檉柳，脅迫下分別對三種轉(zhuǎn)基因檉柳進(jìn)行組織化學(xué)染色和抗逆相關(guān)生理指標(biāo)測定，鑒定ThZFP3基因的抗旱、耐鹽能力?！窘Y(jié)果】在脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌芽成活率、根長、鮮質(zhì)量和長勢均優(yōu)于野生型，表明ThZFP3基因可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱耐鹽能力；過表達(dá)ThZFP3基因顯著增強(qiáng)了剛毛檉柳中POD和SOD的活性，從而減少活性氧（ROS）的積累；過表達(dá)ThZFP3基因可以減少剛毛檉柳中MDA的積累、降低電解質(zhì)滲透率，保護(hù)細(xì)胞膜的完整。【結(jié)論】過表達(dá)ThZFP3基因可以提高剛毛檉柳體內(nèi)ROS清除能力，降低細(xì)胞損傷程度，從而提高剛毛檉柳的抗旱耐鹽能力。

關(guān)鍵詞：剛毛檉柳；CCCH型鋅指蛋白；耐鹽；抗旱

中圖分類號：S718.43 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-923X（2024）08-0139-11

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31870665）；黑龍江省自然科學(xué)基金項目（LH2021C013）。

Salt tolerance and drought resistance function of ThZFP3 gene in Tamarix hispida

HAN Gang， JIA Yuanyuan， ZHU Zhenyu， ZHAO Xin， NIU Yi， WANG Xiaodong， CUI Tianxiang， WANG Chao

（College of Forestry， Northeast Forestry University， State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Harbin 150040， Heilongjiang， China）

Abstract：【Objective】Zinc finger proteins are a major class of important transcription regulatory factors in plants， playing important roles in plant growth and development， and stress response. The salt tolerance and drought resistance function of ThZFP3 of Tamarix hispida zinc finger protein gene was analyzed to provide a theoretical basis for genetic improvement of tree resistance.【Method】Arabidopsis thaliana was transformed with ThZFP3 using the floral dip method. The germination survival rate， root length， fresh mass， and phenotypic changes of the transgenic and control A. thaliana were observed under NaCl and mannitol stress. Transient overexpression（OE）， inhibited expression （RNAi） and control transgenic Tamarix were obtained using the Agrobacterium transient transformation system. Three transgenic Tamarix plants were histochemically stained and stress-related physiological indexes were measured to identify the drought resistance and salt tolerance of the ThZFP3 gene.【Result】Under stress conditions， the germination survival rate， root length， fresh mass， and growth vigor of transgenic Arabidopsis were superior to wild-type strains， indicating that the ThZFP3 gene improved the drought and salt tolerance of transgenic Arabidopsis. Overexpression of the ThZFP3 gene significantly enhanced the activities of POD and SOD in T. hispida， thereby reducing the accumulation of reactive oxygen species （ROS）； Overexpression of the ThZFP3 gene reduced the accumulation of MDA and electrolyte permeability in T. hispida， protecting the integrity of cell membranes.【Conclusion】Overexpression of the ThZFP3 gene can improve the ROS scavenging ability within the body of T. hispida， reduce the degree of cell damage， and thus improve its drought resistance and salt tolerance.

Keywords： Tamarix hispida； CCCH zinc finger protein； salt tolerance； drought resistance

植物在生長過程中會受到干旱、鹽堿等多種非生物逆境脅迫的影響[1-2]。在長期進(jìn)化過程中，植物已經(jīng)形成了有效的保護(hù)機(jī)制，大量抗逆基因構(gòu)成精密的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同參與調(diào)節(jié)植物的抗逆性。轉(zhuǎn)錄因子作為主要的調(diào)控因子，通過調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)植物的抗逆反應(yīng)，從而使植物感知并適應(yīng)逆境脅迫。目前，一些轉(zhuǎn)錄因子，如AP2/EREBP、bZIP、MYB、NAC、bHLH等，已經(jīng)被證實在植物逆境脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用[3]。因此，挖掘并鑒定抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，對于利用基因工程進(jìn)行植物抗逆遺傳改良具有重要意義。

鋅指蛋白是包含鋅指結(jié)構(gòu)域的一類轉(zhuǎn)錄因子。鋅指結(jié)構(gòu)域的特征是肽鏈中氨基酸殘基通過結(jié)合Zn2+后自我折疊形成的穩(wěn)定的、短的“手指狀”空間結(jié)構(gòu)。鋅指蛋白通常由一系列鋅指結(jié)構(gòu)組成，具有重復(fù)結(jié)構(gòu)的氨基酸模式，相隔特定距離的胱氨酸結(jié)合鋅指，能與某些DNA、RNA、DNARNA結(jié)合，以及與自身或其他鋅指蛋白結(jié)合[4]。由于其自身的結(jié)構(gòu)特點，可以選擇性地結(jié)合特異的靶結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控基因的表達(dá)，在植物細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、應(yīng)激響應(yīng)等生命過程中發(fā)揮重要作用[4]。鋅指蛋白家族成員數(shù)量龐大，根據(jù)ZFP結(jié)構(gòu)中半胱氨酸（Cys）和組氨酸（His）殘基的序列和數(shù)量，ZFP轉(zhuǎn)錄因子分為九個亞家族，即C2H2、C2HC、C2HC5、C3H、C3HC4、C4HC3、Cys4、C6和C8[5]。不同種屬間鋅指蛋白在鋅指結(jié)構(gòu)數(shù)量和分布上存在很大差異，這也預(yù)示著鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子在功能上的多樣性和調(diào)控機(jī)制上的復(fù)雜性。

大量研究表明，多種鋅指蛋白可以被高鹽、干旱、低溫以及病原菌等逆境脅迫誘導(dǎo)，參與植物的生物和非生物抗逆脅迫過程[6]。Sun等[7]通過水稻微陣列分析確定了一個含有兩個典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白基因（ZFP179），該基因被高鹽、干旱等脅迫誘導(dǎo)，說明ZFP179基因參與了植物逆境脅迫的響應(yīng)過程。與非轉(zhuǎn)基因水稻相比，過表達(dá)水稻C2H2鋅指蛋白基因OsCTZFP8的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出耐低溫表型[8]。擬南芥C2H2型鋅指蛋白AtZAT6通過直接結(jié)合防御相關(guān)基因（EDS1、PAD4、PR1、PR2和PR5）的啟動子區(qū)域中的TACAAT基序，正調(diào)控擬南芥對丁香假單胞桿菌Pseudomonas syringae的抗性[9]。以上研究表明，鋅指蛋白在植物應(yīng)答環(huán)境脅迫的過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。目前，對植物鋅指蛋白的研究主要集中在C2H2型，其他類型的鋅指蛋白受到的關(guān)注相對較少，而在木本植物中相關(guān)信息更是十分有限。

剛毛檉柳Tamarix.hispida是一種鹽生木本植物，可在荒漠、鹽堿地上生長，是優(yōu)良的防風(fēng)固沙植物[10]。剛毛檉柳具有極強(qiáng)的抗逆能力，其體內(nèi)蘊(yùn)藏著大量的抗逆基因資源，是分離抗旱、耐鹽基因的理想物種。在前期研究中，本課題組從剛毛檉柳中鑒定了一條響應(yīng)鹽和干旱脅迫的CCCH型鋅指蛋白基因ThZFP3[11]。為了進(jìn)一步明確ThZFP3的生物學(xué)功能，本研究將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥和剛毛檉柳中，通過比較轉(zhuǎn)基因植株和對照植株在鹽和干旱脅迫下的表型及生理指標(biāo)的差異，探究ThZFP3基因在剛毛檉柳抗旱、耐鹽過程中的作用及其參與的生理調(diào)節(jié)途徑。本研究為林木抗逆分子育種提供了理論依據(jù)和有效的基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料

野生型擬南芥和剛毛檉柳組培苗取自東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種全國重點實驗室，在人工氣候室內(nèi)（溫度22±2 ℃，光照時間16 h/d，光照強(qiáng)度400 μmol·m-2·s-1，相對濕度（65%～75%）培養(yǎng)。

1.2 植物表達(dá)載體與菌株

植物過表達(dá)載體pROKⅡ、植物抑制表達(dá)載體pFGC5941、大腸桿菌感受態(tài)DH5α和根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105保存于東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種全國重點實驗室。

1.3 檉柳ThZFP3基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)植物過表達(dá)載體pROKⅡ和目的基因ThZFP3的融合特性引入了限制性內(nèi)切酶SmaⅠ位點，設(shè)計引物pROKⅡ-ThZFP3-F和pROKⅡ-ThZFP3-R（表1），以pMD18-T-ThZFP3為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增ThZFP3基因，將目的基因連接到經(jīng)SmaⅠ酶切后的pROKⅡ載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對陽性克隆進(jìn)行測序鑒定。將測序成功的質(zhì)粒命名為pROKⅡ-ThZFP3，并利用電擊法轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌EHA105中備用。

根據(jù)植物抑制表達(dá)載體pFGC5941和目的基因ThZFP3的融合特性分別設(shè)計引物pFGC5941-Cis-ThZFP3-F和pFGC5941-Cis-ThZFP3-R（表1），選擇AscⅠ作為酶切位點，用上述方法將ThZFP3正義鏈基因片段連接到pFGC5941載體上，對陽性克隆進(jìn)行測序鑒定。將測序成功的質(zhì)粒命名為pFGC5941-Cis-ThZFP3。設(shè)計引物pFGC5941-AntiThZFP3-F和pFGC5941-Anti-ThZFP3-R（表1），選擇XbaⅠ作為酶切位點，用上述方法將ThZFP3反義鏈基因片段連接到pFGC5941-ThZFP3-Cis載體上，對陽性克隆進(jìn)行測序鑒定。將測序成功的質(zhì)粒命名為pFGC5941-ThZFP3，并利用電擊法轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌EHA105中備用。

1.4 ThZFP3轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

當(dāng)擬南芥大量開花時用蘸花法侵染盛花期的擬南芥植株，約1個月時收集種子（即為T0代種子）。將種子消毒后在含50 mg/L卡那霉素的抗性培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周左右，篩選能夠發(fā)芽長出真葉并正常生長的陽性轉(zhuǎn)基因幼苗，記為T1代。將T1代擬南芥在人工土壤中培養(yǎng)4周左右，對T1代各轉(zhuǎn)基因擬南芥株系提取DNA進(jìn)行驗證，選取鑒定成功的陽性植株并繼續(xù)進(jìn)行T2和T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥的培養(yǎng)與篩選，收取T3代純合種子用于后續(xù)試驗。

1.5 ThZFP3轉(zhuǎn)基因擬南芥的脅迫處理

首先對野生型和T3代純合擬南芥種子進(jìn)行消毒處理，隨后在1/2MS固體培養(yǎng)基上播種培養(yǎng)。為了明確擬南芥種子在不同處理條件下的萌芽成活率，分別在含100 mmol/L NaCl及含150 mmol/L Mannitol的抗性培養(yǎng)基上播種培養(yǎng)，每次試驗大約用90粒種子，第6天統(tǒng)計擬南芥在不同處理條件下的萌芽成活率。為了進(jìn)一步對擬南芥各轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行觀察，將在1/2 MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d左右且長勢相同的各株系的幼苗分別轉(zhuǎn)移到上述抗性培養(yǎng)基和人工土壤中豎直培養(yǎng)，7 d后對抗性培養(yǎng)基中各株系在不同處理條件下的根長和鮮質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計。4周左右分別對人工土壤中的擬南芥土培苗進(jìn)行250 mmol/L NaCl和350 mmol/L Mannitol脅迫處理，并以清水處理作為對照，第7天觀察處理后的不同株系的脅迫表型并拍照。

1.6 ThZFP3瞬時表達(dá)剛毛檉柳的獲得

為了研究ThZFP3基因在瞬時表達(dá)剛毛檉柳中的表達(dá)情況，取EHA105-pROKⅡ-ThZFP3（OE）、EHA105-pFGC5941-ThZFP3（RNAi）和陽性對照EHA105-pROKⅡ（Control）菌種瞬時侵染4周左右、大小和生長狀態(tài)一致的剛毛檉柳組培苗，用CTAB法分別在0、12、24、48、72 h對侵染后的過表達(dá)（OE）、抑制表達(dá)（RNAi）和對照（Control）瞬時轉(zhuǎn)化植株提取總RNA（每個株系植株不少于3株），并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計ThZFP3基因定量引物RTThZFP3-F和RT-ThZFP3-R（表1），選取剛毛檉柳Actin（GenBank登錄號：FJ618517）和β-tubulin（GenBank登錄號：FJ618519）為內(nèi)參基因[12]，引物序列見表1。將cDNA稀釋十倍作為模板，進(jìn)行實時熒光定量RT-PCR，每個樣品重復(fù)3次，用2-ΔΔCT方法進(jìn)行基因的相對定量分析[13]。

1.7 非生物脅迫下ThZFP3瞬時表達(dá)剛毛檉柳的組織化學(xué)染色

根據(jù)實時熒光定量RT-PCR的分析結(jié)果，在含150 mmol/L NaCl及200 mmol/L Mannitol的抗性培養(yǎng)基上對瞬時浸染后共培養(yǎng)24 h的剛毛檉柳脅迫處理0、1和2 h，以1/2 MS固體培養(yǎng)基上的剛毛檉柳作為對照處理。用蒸餾水將處理后的剛毛檉柳洗涮干凈，各處理各時間點各株系各取3棵剛毛檉柳分別放入含100 mL DAB、NBT和Evans blue化學(xué)染色液的200 mL錐形瓶中，25 ℃過夜染色。用75%乙醇加醋酸進(jìn)行過夜脫色、拍照[14]。

1.8 非生物脅迫下ThZFP3瞬時表達(dá)剛毛檉柳的生理生化指標(biāo)測定

根據(jù)實時熒光定量RT-PCR的分析結(jié)果，在含150 mmol/L NaCl及200 mmol/L Mannitol的抗性培養(yǎng)基上對瞬時侵染后共培養(yǎng)24 h的剛毛檉柳脅迫處理48 h，以1/2 MS固體培養(yǎng)基上的剛毛檉柳作為對照處理。對處理后的剛毛檉柳的生理生化指標(biāo)如：過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量及電解質(zhì)滲透率進(jìn)行測定[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物表達(dá)載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

將重組質(zhì)粒pROKⅡ-ThZFP3和pFGC5941-ThZFP3轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105。選取陽性克隆，分別用載體引物進(jìn)行PCR驗證，電泳條帶長度與預(yù)期長度一致（圖1）。提取陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序，經(jīng)比對，測序結(jié)果與ThZFP3基因序列相同，說明過表達(dá)載體pROKⅡ-ThZFP3和抑制表達(dá)載體pFGC5941-ThZFP3構(gòu)建成功。

2.2 ThZFP3轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗逆能力分析

2.2.1 過表達(dá)ThZFP3轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

用蘸花法將植物過表達(dá)載體EHA105-pROKⅡ-ThZFP3轉(zhuǎn)化至野生型擬南芥，即為T0代擬南芥，收取種子。隨后在含卡那霉素的1/2MS固體培養(yǎng)基上篩選T1代陽性植株（圖2）。選取鑒定成功的陽性植株（OE3和OE15）繼續(xù)培養(yǎng)到T3代，收取T3代種子用于后續(xù)試驗。

2.2.2 鹽和干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子萌芽成活率

在1/2MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因擬南芥（OE3和 OE15）與野生型擬南芥（WT）種子的萌芽成活率基本相同。在含有NaCl和Mannitol的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥種子都能夠萌發(fā)。但野生型種子萌發(fā)后子葉變黃，逐漸死亡，而轉(zhuǎn)基因擬南芥OE3和OE15兩個株系的種子萌芽成活率較高，明顯高于WT（圖3），表明ThZFP3基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在鹽和干旱脅迫下的萌芽成活能力。

2.2.3 鹽和干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長表型

在正常生長條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的根長、鮮質(zhì)量以及植株長勢均無顯著區(qū)別。在NaCl和Mannitol脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系OE3和OE15兩個株系的植株長勢、根長及鮮質(zhì)量明顯強(qiáng)于WT（圖4）。研究結(jié)果表明，過表達(dá)ThZFP3基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽和干旱脅迫的耐受性。

2.3 ThZFP3在剛毛檉柳中的抗逆生理功能分析

2.3.1 瞬時表達(dá)ThZFP3轉(zhuǎn)基因剛毛檉柳的獲得

為了進(jìn)一步研究ThZFP3基因在剛毛檉柳中的抗逆功能，利用瞬時轉(zhuǎn)化技術(shù)將pROKⅡ空載體、ThZFP3基因過表達(dá)載體和抑制表達(dá)載體轉(zhuǎn)入剛毛檉柳中，并以轉(zhuǎn)空pROKⅡ載體的剛毛檉柳植株作為對照。利用實時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測過表達(dá)（OE）、抑制表達(dá)（RNAi）和對照（Control）植株中ThZFP3基因的表達(dá)情況。相對于對照剛毛檉柳植株，ThZFP3在過表達(dá)植株中的相對表達(dá)量隨著瞬時轉(zhuǎn)化后時間的延長逐漸上升，在24 h達(dá)到最高；抑制表達(dá)植株中的相對表達(dá)量則隨時間的延長逐漸降低，在24 h時降至最低（圖5）。結(jié)果表明，ThZFP3基因在瞬時過表達(dá)植株中可實現(xiàn)過量表達(dá)，在抑制表達(dá)植株中成功被抑制，三種瞬時轉(zhuǎn)化剛毛檉柳植株可作為分析轉(zhuǎn)基因剛毛檉柳抗逆功能的材料。同時，在瞬時轉(zhuǎn)化后24 h，是進(jìn)行抗逆功能分析的理想時間點，后續(xù)試驗中在瞬時轉(zhuǎn)化24 h后進(jìn)行脅迫處理，抗逆生理指標(biāo)測定。

2.3.2 鹽和干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因剛毛檉柳ROS水平檢測

DAB、NBT染色能夠反映出剛毛檉柳體內(nèi)的過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O2·-）的含量，進(jìn)而反映出植株體內(nèi)ROS積累情況。在正常生長條件下，過表達(dá)、抑制表達(dá)和對照植株基本上沒有顏色差異，說明3種株系中的H2O2和O2·-含量幾乎相同，細(xì)胞內(nèi)沒有過量積累ROS。但在鹽、干旱脅迫條件下，相比于對照植株，過表達(dá)植株上的顏色相對較淺，抑制表達(dá)植株上的顏色相對較深，且隨著脅迫時間的延長3種株系上的顏色逐漸變深（圖6）。結(jié)果表明，過表達(dá)ThZFP3基因降低了植株內(nèi)的H2O2和O2·-含量。

進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)基因和對照剛毛檉柳在鹽、干旱脅迫下的過氧化物酶（POD）以及超氧化物歧化酶（SOD）活性。在正常生長條件下，過表達(dá)、抑制表達(dá)和對照株系的POD、SOD活性基本相同。在鹽、干旱脅迫下，3種轉(zhuǎn)基因株系的POD、SOD活性顯著提高，相比于對照植株，過表達(dá)植株的POD、SOD活性相對較高（圖6）。結(jié)果表明，過表達(dá)ThZFP3基因使剛毛檉柳體內(nèi)POD、SOD活性增加，ROS清除能力增強(qiáng)，降低了剛毛檉柳由ROS過度積累所導(dǎo)致的氧化損傷。

2.3.3 鹽和干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因剛毛檉柳的細(xì)胞膜受損程度分析

Evans blue染色、丙二醛（MDA）含量和電解質(zhì)滲透率可以反映細(xì)胞膜受損傷情況進(jìn)而反映植物遭受逆境傷害的程度。在正常生長條件下，3種轉(zhuǎn)基因株系染色區(qū)別較小，植株中的MDA含量及電解質(zhì)滲透率基本相同。在鹽和干旱脅迫下，過表達(dá)植株上Evans blue染色的藍(lán)色斑點較對照植株上的藍(lán)色斑點少，且顏色較淺（圖7）；MDA含量及電解質(zhì)滲透率明顯增加，且3種株系中的MDA含量及電解質(zhì)滲透率差異較大，過表達(dá)植株的MDA含量及電解質(zhì)滲透率明顯低于對照植株（圖7）。結(jié)果表明，過表達(dá)ThZFP3基因能夠降低逆境脅迫對細(xì)胞膜造成的損傷，從而增強(qiáng)剛毛檉柳耐鹽、抗旱能力。

3 討 論

鋅指蛋白是植物中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，不僅在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用，也參與調(diào)控植物對生物和非生物脅迫的應(yīng)答過程。Wang等[15]研究了68個擬南芥CCCH型鋅指蛋白基因在多種環(huán)境刺激下的表達(dá)，其中11個IX亞家族基因能夠參與植物不同的逆境脅迫響應(yīng)，如鹽、干旱、冷及ABA等。劉佳麗等[16]研究發(fā)現(xiàn)水稻中過表達(dá)OsZFP6的水稻轉(zhuǎn)基因植株在進(jìn)行NaHCO3脅迫處理時表現(xiàn)更強(qiáng)耐受性，并且在株高、鮮質(zhì)量生理指標(biāo)上過表達(dá)OsZFP6植株高于野生型植株。Jan等[17]研究發(fā)現(xiàn)水稻基因OsTZF1的表達(dá)受高鹽和干旱脅迫的誘導(dǎo)，過表達(dá)OsTZF1能顯著地增強(qiáng)水稻對高鹽和干旱的耐性。這些研究結(jié)果表明，鋅指蛋白家族中部分成員在植物逆境脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮了重要作用。剛毛檉柳是一種具有很強(qiáng)抗逆性的木本植物，已在其體內(nèi)鑒定了多個具有抗逆功能的轉(zhuǎn)錄因子，如ThWRKY、ThbZIP、ThNAC、ThbHLH等[18-21]；但是，ZFP轉(zhuǎn)錄因子在剛毛檉柳脅迫應(yīng)答中的功能及作用機(jī)制尚不明確。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，剛毛檉柳ThZFP3基因高度響應(yīng)鹽和干旱脅迫，猜測其可能參與剛毛檉柳的抗逆過程。為了進(jìn)一步解析ThZFP3基因的生物學(xué)功能，本研究成功構(gòu)建了ThZFP3基因的過表達(dá)載體pROKⅡ-ThZFP3并轉(zhuǎn)入擬南芥植株中。在NaCl和Mannitol脅迫處理后，相比于野生型擬南芥，過表達(dá)植株的萌芽成活率、根長、鮮質(zhì)量及長勢明顯提高，說明ThZFP3基因能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽和抗旱能力。

逆境脅迫會導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧（ROS）過度積累，造成組織的氧化損傷。因此，調(diào)節(jié)體內(nèi) ROS平衡對于維持植物在逆境下的正常生長至關(guān)重要。抗氧化酶的酶促系統(tǒng)是生物體內(nèi)清除活性氧的一條有效途徑。研究發(fā)現(xiàn)，非生物脅迫會誘導(dǎo)過量活性氧（ROS）的產(chǎn)生，植物通過激活酶促和非酶促清除劑，如SOD、POD和CAT等，以清除過量的ROS[22-25]。許多抗逆基因可以通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性來清除植物中過度積累的ROS，從而提高植物對逆境脅迫的適應(yīng)性。過表達(dá)ThCBL4基因通過增加POD、SOD酶活性來增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因剛毛檉柳細(xì)胞內(nèi)活性氧清除能力，從而提高轉(zhuǎn)基因剛毛檉柳的耐鹽能力[26]。過表達(dá)ZmEREB20的擬南芥中抗氧化酶如SOD、CAT表現(xiàn)出了更高的活性，這有助于植物清除過量積累的ROS，從而減輕了鹽脅迫造成的損害[27]。在鹽脅迫下，過表達(dá)TaZFP1轉(zhuǎn)基因植株的POD、SOD等抗氧化酶活性增加，ROS水平降低，表明轉(zhuǎn)基因植株通過調(diào)節(jié)細(xì)胞ROS穩(wěn)態(tài)來提高植物的耐鹽性[28]。本研究利用DAB、NBT染色分析了逆境脅迫下瞬時表達(dá)剛毛檉柳體內(nèi)的ROS水平。鹽、干旱脅迫下，相較于對照植株和抑制表達(dá)植株，過表達(dá)植株內(nèi)的H2O2含量和O2·-含量相對最低，而POD和SOD活性相對最高，說明過表達(dá)ThZFP3可以促進(jìn)剛毛檉柳體內(nèi)抗氧化酶活性，降低ROS的積累，提高剛毛檉柳對鹽、干旱脅迫的耐受性。

MDA是膜脂過氧化分解的終產(chǎn)物之一，其含量能夠反映細(xì)胞膜脂過氧化的程度。例如在鹽脅迫下，過表達(dá)GmMYB84的轉(zhuǎn)基因大豆Glycine max耐鹽能力更強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因植株MDA含量顯著低于野生型，表明對細(xì)胞膜的損傷程度較低[29]。Cui等[30]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)番茄MYB49基因的擬南芥株系與野生型擬南芥相比MDA含量較低，MYB49基因通過抑制細(xì)胞膜損傷增強(qiáng)植株對干旱和鹽的耐受性。同樣，細(xì)胞膜損傷后，細(xì)胞膜透性會發(fā)生改變，大量電解質(zhì)滲出導(dǎo)致電解質(zhì)滲透率發(fā)生變化。例如過表達(dá)BpGRAS1基因可以降低白樺在鹽脅迫下的電解質(zhì)滲透率，說明BpGRAS1基因能夠保護(hù)細(xì)胞膜，避免膜損傷[31]。過表達(dá)BpHSFA4株系細(xì)胞膜受損程度低、電解質(zhì)外滲少，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性較高[32]。因此，MDA含量和電解質(zhì)滲透率可以作為細(xì)胞膜損傷程度的衡量指標(biāo)，也間接反映出植物在脅迫下的抗逆能力。本研究通過過表達(dá)剛毛檉柳ThZFP3基因發(fā)現(xiàn)剛毛檉柳體內(nèi)MDA含量、電解質(zhì)滲透率和Evans blue染色強(qiáng)度顯著降低，說明過表達(dá)ThZFP3基因降低了逆境脅迫對剛毛檉柳細(xì)胞膜的損傷，增加了剛毛檉柳的抗旱耐鹽能力。以上研究表明，鋅指蛋白能夠通過提高ROS清除能力以及減少膜脂損傷程度來提高植物在非生物脅迫下的抗逆功能。

本研究通過異源轉(zhuǎn)化擬南芥和瞬時轉(zhuǎn)化檉柳，初步明確了ThZFP3基因的功能。然而，基因在異源表達(dá)和同源表達(dá)情況下，其功能可能會存在差異；另外，瞬時轉(zhuǎn)化與穩(wěn)定轉(zhuǎn)化相比，在基因功能研究中也存在一定的局限性。因此，后續(xù)研究中將ThZFP3基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化剛毛檉柳，進(jìn)一步驗證ThZFP3的抗逆功能，并深入研究其調(diào)控檉柳耐鹽、抗旱的分子機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究將ThZFP3基因轉(zhuǎn)入擬南芥和剛毛檉柳中，對其耐鹽、抗旱功能進(jìn)行了鑒定。過表達(dá)ThZFP3基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽和干旱脅迫的耐受性。鹽和干旱脅迫下，ThZFP3基因能夠調(diào)節(jié)剛毛檉柳體內(nèi)POD、SOD活性，增強(qiáng)ROS清除能力，降低細(xì)胞膜脂過氧化損傷，從而提高剛毛檉柳的耐鹽和抗旱能力。本研究為進(jìn)一步解析檉柳ZFP的抗逆調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，并為林木抗逆基因工程育種提供了候選基因。

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[本文編校：羅 列]