摘要：為研究染色體分離樣蛋白1（chromosomesegregation 1-like，CSE1L）在小鼠骨骼肌發(fā)育中的作用，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建CSE1L 基因敲除的C2C12細(xì)胞系。針對小鼠 CSE1L 的第3外顯子設(shè)計3組sgRNA，構(gòu)建sgRNA表達(dá)質(zhì)粒（連接綠色熒光蛋白，green fluorescent protein，GFP）和Cas9質(zhì)粒（連接紅色熒光蛋白，red fluorescent protein，RFP）共轉(zhuǎn)染C2C12 細(xì)胞，篩選高切割效率的sgRNA；將轉(zhuǎn)染該sgRNA 和Cas9 的C2C12細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分選，獲取共表達(dá)紅、綠雙色熒光蛋白的細(xì)胞，并用DNA測序進(jìn)行鑒定。通過實時熒光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白免疫印跡（Western-blot）鑒定其分子特征。最后分別利用CCK-8、細(xì)胞周期以及凋亡實驗對CSE1L 敲除細(xì)胞系活力和凋亡進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，小鼠成肌細(xì)胞中CSE1L 基因mRNA和蛋白水平表達(dá)量都顯著降低（Plt;0.01），提示CSE1L 基因敲除成功。該基因缺失導(dǎo)致C2C12細(xì)胞變細(xì)長、細(xì)胞活力在72 h顯著下調(diào)，細(xì)胞周期停滯、凋亡增加。成功構(gòu)建了CSE1L 基因敲除的細(xì)胞系，并研究了小鼠骨骼肌細(xì)胞生長發(fā)育相關(guān)功能，為探索CSE1L 基因功能提供細(xì)胞模型，并為后續(xù)基因編輯敲除鼠制備奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：CRISPR-Cas9；CSE1L；基因敲除；骨骼肌發(fā)育

doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0250

中圖分類號：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：10080864（2024）11022509

染色體分離樣蛋白1（chromosomesegregation1-like，CSE1L）基因，又稱為細(xì)胞凋亡易感基因（cllular apoptosis susceptible，CAS），由25 個外顯子組成，編碼972 個氨基酸，蛋白分子量為100 kD。該蛋白首次在人MCF-7乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在維持細(xì)胞增殖與凋亡的平衡中扮演著重要的角色[12]。CSE1L 參與多種細(xì)胞機(jī)制的調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞周期檢查點以及細(xì)胞增殖和凋亡[34]。CSE1L 作為細(xì)胞周期檢查點的一部分，參與有絲分裂過程中染色體的精確分離[5]。CSE1L 缺失會導(dǎo)致有絲分裂后期染色體分離異常[6]。CSE1L 在多種實體瘤中高表達(dá)，包括肺癌、乳腺癌、胃癌等[1，78]，CSE1L 基因缺失會導(dǎo)致檢查點的紊亂，使細(xì)胞分裂不穩(wěn)定，導(dǎo)致癌癥高發(fā)，因此在臨床醫(yī)學(xué)中也作為腫瘤診斷標(biāo)志物檢測[9]。CSE1L 也與細(xì)胞的增殖和凋亡相關(guān)，在增殖細(xì)胞中高表達(dá)，在靜止細(xì)胞中低表達(dá)[10]。近年來的研究多是針對CSE1L 在癌癥上的研究， CSE1L 在骨骼肌生長發(fā)育中的作用機(jī)制未見報道。本團(tuán)隊前期研究證實，CSE1L基因參與豬骨骼肌的生長發(fā)育[11]。小鼠成肌細(xì)胞系C2C12 細(xì)胞是研究骨骼肌生物學(xué)過程的通用模型。因此，構(gòu)建CSE1L 敲除的C2C12細(xì)胞系可為進(jìn)一步研究CSE1L 基因在骨骼肌發(fā)育過程中的調(diào)控作用提供可靠的體外細(xì)胞模型。

CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)通過人工設(shè)計的向?qū)gRNA引導(dǎo)Cas9核酸酶在基因組特定位點進(jìn)行靶向精準(zhǔn)編輯，具有效率高、成本低、操作簡便等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于基因敲除、基因篩選、基因治療以及分子育種等多個領(lǐng)域，尤其在構(gòu)建敲除細(xì)胞和（或）敲除動物/植物模型方面具有不可替代的作用，為動植物分子設(shè)計育種提供技術(shù)和理論支持[12-15]。本研究運用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在小鼠成肌細(xì)胞C2C12中構(gòu)建CSE1L基因敲除細(xì)胞系，探討CSE1L 對細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響，為進(jìn)一步研究CSE1L蛋白在骨骼肌生長發(fā)育中的作用提供細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒

小鼠成肌細(xì)胞C2C12購自國家模式與特色實驗細(xì)胞資源庫/中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，YP152-GFP 和Cas9-P2A-mcherry 質(zhì)粒載體由本實驗室保存，感受態(tài)細(xì)胞購自深圳康體生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 試劑

細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基（YEASEN，41401ES76）、FBS（BI，04-001-1ACS） 、Pen-strep（YEASEN，60162ES76）、PBS（YEASEN，41403ES76）、胰酶（YEASEN，40127ES60）培養(yǎng)；電轉(zhuǎn)用Cell LineNucleofector Kit V 轉(zhuǎn)染試劑盒（Lonza，VCA-1003）；FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit 、高保真酶（Vazyme，P515）、熒光定量PCR（Vazyme，Q711）試劑均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（TIANGEN，DP117）購自天根生化科有限公司；RNA提取用TRIZOL（Thermo Fisher，15596018CN）、反轉(zhuǎn)錄（Thermo Fisher，K1622）、Pierce?BCA蛋白檢測試劑盒（Thermo Fisher，23227），購自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司。CCK-8 試劑（YEASEN，40203ES76）、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（YEASEN，40302ES50）、細(xì)胞周期檢測試劑（BDPharmingen，550825） 和CSE1L 抗體（Abcam，ab151546）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，Actin（Sangon，D190826）、二抗（Sangon，LF102）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。引物（表1）由廣州金唯智生物科技公司合成。

1.3 靶向小鼠CSE1L 基因的sgRNA 設(shè)計

通過 NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索小鼠CSE1L（ NM_023565.3）基因序列 。在NC_000068.8 序列的第3個外顯子區(qū)域，按照CRISPR Cas9靶點設(shè)計原則，利用 sgRNA 在線設(shè)計工具（https：//chopchop. cbu. uib. no/）針對CSE1L第3外顯子序列設(shè)計3對sgRNA（表1），且預(yù)測其在基因組內(nèi)無其他靶點。在靶序列正義鏈的5’端前部添加 CACCG，同時合成 sgRNA 互補(bǔ)的寡核苷酸，并在5’端添加AAAC，3’端添加C，合成的正反向oligo DNA序列。

同時，依據(jù)目的基因的序列，利用NCBI工具設(shè)計CRISPR-Cas9敲除鑒定引物（表1）進(jìn)行PCR。

1.4 靶向小鼠CSE1L 基因的sg 載體的構(gòu)建

將合成的3對反向互補(bǔ)的sgRNA oligo DNA單鏈退火，形成帶有粘性末端的短雙鏈DNA。將正反向sgRNA序列以10 μmol·L?1溶于 ddH2O，配制以下反應(yīng)體系：4.5 μL Forward oligo，4.5 μL Reverse oligo，1 μL T4 Ligation buffer，95～25 ℃梯度連接，每間隔5 min下降5 ℃。將短雙鏈DNA與經(jīng) BpiⅠ酶切后的質(zhì)粒YP152-GFP 連接，4 μL sgRNA 變性產(chǎn)物、1 μL 10×T4 Ligation buffer、1 μL T4 DNA連接酶，加ddH2O至10 μL，22 ℃連接30 min。連接成功后加入50 μL DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，混勻后冰浴放置25～30 min，在42 ℃金屬浴中熱激60 s，置于冰上2～3 min，然后將其均勻涂抹在氨芐抗性的固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落送廣州金唯智生物科技公司測序鑒定。

測序結(jié)果顯示，3對sgRNA序列均正確插入載體骨架上，表示載體構(gòu)建成功，將其命名為CSE1LsgRNA1、CSE1L-sgRNA2和CSE1L-sgRNA3，按照天根無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒說明書提取質(zhì)粒，備用。

1.5 C2C12 細(xì)胞培養(yǎng)

C2C12細(xì)胞采用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素，在37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時即可傳代。

1.6 sgRNA 切割效率的測定

將質(zhì)粒稀釋到1 μg·μL?1，待10 cm培養(yǎng)皿中細(xì)胞密度為80%時消化細(xì)胞并計數(shù)，具體電轉(zhuǎn)步驟如下：取4管15 mL離心管，分別加入1.5×106個細(xì)胞，離心后棄上清。取3個1.5 mL EP管，加入100 μL細(xì)胞核轉(zhuǎn)染液，分別加入構(gòu)建好的質(zhì)粒各5 μL，并加入5 μL Cas9-P2A-mcherry 質(zhì)粒，混勻后加入含有細(xì)胞的15 mL離心管中，充分混勻。其中3管細(xì)胞電轉(zhuǎn)，剩余1管細(xì)胞作為平行對照。使用Lonza 2b電轉(zhuǎn)儀，電轉(zhuǎn)程序為T-020，電轉(zhuǎn)完成室溫靜置5 min，加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并放入6孔板中培養(yǎng)48 h。用胰酶消化細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀篩選并收集具有紅綠雙色強(qiáng)陽性熒光的細(xì)胞，提取基因組DNA 用于PCR。PCR 體系：2 × Phanta Max MasterMix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 1 μL，無菌水7 μL。PCR程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物送至廣州金唯智生物有限公司進(jìn)行DNA測序鑒定。

1.7 CSE1L-/-敲除細(xì)胞株篩選

選擇Cas9蛋白切割效率最高的sgRNA質(zhì)粒，與Cas9-P2A-mcherry 質(zhì)粒一同電轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法按照 Cell Line Nucleofector Kit V 轉(zhuǎn)染試劑盒說明進(jìn)行。電轉(zhuǎn)48 h后通過流式細(xì)胞儀篩選出具有紅綠雙色強(qiáng)陽性熒光的細(xì)胞，收集細(xì)胞并培養(yǎng)在6孔板細(xì)胞中。6孔板細(xì)胞長滿時，取一半細(xì)胞用于提取DNA，另一半細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)[16]。細(xì)胞基因組DNA 提取和PCR 擴(kuò)增方法同1.6，PCR產(chǎn)物送至廣州金唯智生物有限公司進(jìn)行DNA測序。

1.8 RT-qPCR

將對照組C2C12細(xì)胞和CSE1L-/-細(xì)胞系分別鋪至6孔板中，待細(xì)胞密度長至80%左右時使用電動移液器吸棄培養(yǎng)基，PBS 清洗3 遍后加入Trizol，用傳統(tǒng)氯仿法提取RNA，再將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA 作為熒光定量的模板，按照諾唯贊熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行RT-qPCR，引物序列見表1。

1.9 Western blot

將對照組C2C12細(xì)胞和CSE1L-/-細(xì)胞系分別鋪至6孔板中，待細(xì)胞密度長至80%左右時收獲細(xì)胞，裂解獲得蛋白，進(jìn)行Western blot。步驟如下：用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞沉淀，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，冰上孵育30 min；4 ℃、12 000 r·min?1離心30 min。吸取上清液，按照Thermo Fisher 公司BCA 蛋白檢測試劑盒說明書測定蛋白含量。加入5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（YEASEN，20315ES05），100 ℃金屬浴加熱10 min使蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。230 mA 恒流條件下轉(zhuǎn)膜80 min。用5%脫脂牛奶緩沖液將膜室溫封閉1～2 h，用TBST 緩沖液洗滌3 次，每次10 min。稀釋CSE1L（1∶ 2 500）和ACTIN（1∶3 000）抗體，4 ℃ 孵育過夜。第2 天用TBST緩沖液洗膜3次，再用HRP 標(biāo)記親和純化羊抗兔IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，用TBST緩沖液洗滌 3次后置于蛋白印跡成像系統(tǒng)下觀察條帶。

1.10 細(xì)胞增殖曲線繪制

取對數(shù)生長期的對照組C2C12 細(xì)胞和CSE1L-/-細(xì)胞系接種到96孔板中，每孔含約1×104個細(xì)胞，每24 h取1組細(xì)胞，每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度值并繪制細(xì)胞增殖曲線，每組設(shè)8個重復(fù)。

1.11 細(xì)胞周期測定

將對照組C2C12細(xì)胞和CSE1L-/-細(xì)胞系分別鋪至6孔板中，待細(xì)胞密度長至約80%時用胰酶消化細(xì)胞，收集到的細(xì)胞1 000 r·min?1離心5 min，吸棄上清液，加入3 mL PBS重懸細(xì)胞，1 000 r·min?1離心5 min后吸棄上清液，固定在預(yù)冷的75% 乙醇中， ?20 ℃儲存過夜。次日，細(xì)胞用PBS洗滌后，加入500 μL PI/RNase溶液，室溫避光孵育15 min，通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化。

1.12 細(xì)胞凋亡

提前將C2C12細(xì)胞和CSE1L-/-細(xì)胞系分別鋪至6孔板中，待細(xì)胞密度長至約80%時按照1.11方法收集對照組C2C12細(xì)胞和CSE1L-/-細(xì)胞系，PBS洗滌后加入100 μL FITC結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，最低密度為1×106 cell·mL?1，在4 ℃ 下加入5 μLAnnexin V-FITC 和10 μL PI Staining Solution，混勻后在室溫下避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀及FlowJo軟件分析細(xì)胞變化。

1.13 數(shù)據(jù)分析

采用Image J軟件分析凝膠電泳條帶灰度值并計算敲除效率；RT-qPCR以及CCK-8結(jié)果使用GraphPad prism 8.0分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶向小鼠CSE1L 的sgRNA 切割效率分析

3 種sgRNA 質(zhì)粒（CSE1L-sgRNA1、CSE1LsgRNA2和 CSE1L-sgRNA3）分別攜帶有不同的靶標(biāo)序列，為了篩選出Cas9蛋白切割活性最高的靶標(biāo)序列，將構(gòu)建好的3 種質(zhì)粒分別和Cas9-P2Amcherry質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染到C2C12細(xì)胞中，檢測Cas9蛋白對該打靶位點的敲除效率。測序結(jié)果顯示，sgRNA打靶位置出現(xiàn)雜峰，說明轉(zhuǎn)染sgRNA質(zhì)粒后細(xì)胞基因組DNA 發(fā)生編輯。sgRNA-1 測序峰值最紊亂， Cas9蛋白對該位點靶標(biāo)序列切割活性最高。后續(xù)實驗選取sgRNA-1進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2.2 流式分選獲得CSE1L-/-細(xì)胞系

將構(gòu)建好的CSE1L-sgRNA1 和Cas9-mcherry共轉(zhuǎn)C2C12細(xì)胞，48 h后通過熒光流式細(xì)胞分選技術(shù)收集GFP和RFP強(qiáng)信號細(xì)胞群，結(jié)果如圖1所示，檢測CSE1L-/-細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率為5.81%。收集該部分細(xì)胞群，并將收集到的細(xì)胞裂解PCR產(chǎn)物進(jìn)行一代測序。測序結(jié)果顯示，與對照組C2C12細(xì)胞相比，CSE1L-/-細(xì)胞系在sgRNA配對位置出現(xiàn)復(fù)合峰，提示該位置出現(xiàn)序列變異，成功獲得CSE1L-/-細(xì)胞系。

2.3 CSE1L 敲除細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化分析

由圖2 可知，與正常C2C12 細(xì)胞相比，CSE1L-/-細(xì)胞系在形態(tài)上差別明顯。正常C2C12細(xì)胞形狀飽滿，呈梭形，而敲除CSE1L 基因后的C2C12 細(xì)胞出現(xiàn)多個突觸，細(xì)胞形狀呈放射狀。可能是CSE1L 基因敲除后，細(xì)胞骨架不穩(wěn)定，導(dǎo)致細(xì)胞縮小，突觸增加。

2.4 敲除細(xì)胞CSE1L 蛋白水平分析

將構(gòu)建好的CSE1L-sgRNA1 和Cas9-mcherry共轉(zhuǎn)C2C12細(xì)胞，48 h后通過熒光流式細(xì)胞分選技術(shù)收集EGFP和RFP強(qiáng)信號的細(xì)胞群，利用RTqPCR和Western blot檢測CSE1L mRNA 和蛋白水平變化。結(jié)果表明，相對于對照組C2C12細(xì)胞，CSE1L-/-細(xì)胞系中該基因在mRNA水平（圖3A）和蛋白水平上（圖3 B）都極顯著下調(diào)（Plt;0.001）。

2.5 CSE1L 基因敲除對細(xì)胞活力的影響

用CCK-8 檢測法檢測CSE1L 基因敲除對C2C12 細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖4 所示，CSE1L-/-細(xì)胞系的增殖活力在48 h內(nèi)無顯著差異，從72 h 開始細(xì)胞活力較C2C12 細(xì)胞極顯著降低（Plt;0.01），96 h開始細(xì)胞活力較對照組細(xì)胞極顯著降低（Plt;0.001）。

2.6 CSE1L 基因敲除對細(xì)胞周期的影響

為探究CSE1L 基因敲除對C2C12細(xì)胞周期的影響，用PI法對細(xì)胞進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞術(shù)分析處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞比例，結(jié)果如圖5所示。CSE1L-/-細(xì)胞系G0/G1期和G2/M期細(xì)胞比例均顯著高于對照組，而S期細(xì)胞比例則顯著低于對照組，提示細(xì)胞DNA合成受到抑制，進(jìn)一步印證了CSE1L敲除導(dǎo)致C2C12細(xì)胞的增殖水平降低。

2.7 CSE1L 基因敲除對細(xì)胞凋亡的影響

為探究CSE1L 基因敲除對C2C12細(xì)胞凋亡的影響，用FITC/PI雙染法對細(xì)胞進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡比例，結(jié)果如圖6所示。與對照組細(xì)胞相比，CSE1L-/-細(xì)胞系早期凋亡細(xì)胞比例增加，晚期凋亡細(xì)胞比例極顯著增加（Plt;0.01），說明敲除CSE1L基因能夠顯著促進(jìn)C2C12細(xì)胞凋亡。

3 討論

微管是細(xì)胞骨架的架構(gòu)主干，與微絲、中間絲一同構(gòu)成細(xì)胞骨架。細(xì)胞骨架主要在維持細(xì)胞形態(tài)、承受外力、保持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)中發(fā)揮作用[17]。微管在所有哺乳動物細(xì)胞中存在，除紅細(xì)胞外，所有微管均由α-微管蛋白和β-微管蛋白組成。α-微管蛋白和β-微管蛋白通常以頭尾相連的方式形成二聚體，也被稱為微管蛋白。微管也是一些細(xì)胞器的主體，如中心粒就由9 組3 聯(lián)微管組成[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，CSE1L 基因敲除后會導(dǎo)致C2C12細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，正常C2C12細(xì)胞形態(tài)圓潤飽滿，CSE1L-/-細(xì)胞偏細(xì)長瘦小，且CSE1L-/-細(xì)胞從胞體向四周分散出多條“ 細(xì)絲”與相鄰細(xì)胞連接，整體呈放射狀。有研究表明，CSE1L 可以與細(xì)胞微管相聯(lián)系[19]。CSE1L 與α-微管蛋白和β-微管蛋白相關(guān)，可以增強(qiáng)兩者之間的關(guān)聯(lián)[20]。CSE1L 的缺失導(dǎo)致微管蛋白的結(jié)合能力下降，微管結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，細(xì)胞整體形態(tài)變小、萎縮。

紡錘體由微管組成，CSE1L 也與紡錘體的形成密切相關(guān)，條件性敲除CSE1L 的突變體出現(xiàn)染色體分離缺陷，細(xì)胞無法降解細(xì)胞周期蛋白B[1]。紡錘體是細(xì)胞分裂過程中的一種特殊結(jié)構(gòu)，主要負(fù)責(zé)染色體的運動和分配。在有絲分裂的后期，CSE1L 與組蛋白結(jié)合，幫助組蛋白從微管中組裝到紡錘體的極板上。隨后CSE1L 與紡錘體微管的相互作用力降低，導(dǎo)致紡錘體微管的解聚，從而促進(jìn)染色體的分離[10]。

在細(xì)胞周期中，CSE1L也扮演著極為重要的作用，CSE1L 基因敲除會阻滯細(xì)胞周期，抑制DNA合成并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。CSE1L 缺乏可誘導(dǎo)TCam-2細(xì)胞的G1/G0阻滯并延遲G2/M期，CSE1L蛋白含量降低會引起周期相關(guān)蛋白cyclin D1和c-Myc表達(dá)水平降低[21]。在THP-1細(xì)胞中，敲減CSE1L 可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)水平降低，Bax蛋白表達(dá)水平升高[4]。本研究觀察到類似的結(jié)果，CSE1L 基因敲低的C2C12細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變，微管骨架紊亂，細(xì)胞呈細(xì)長狀，胞體周圍出現(xiàn)細(xì)小突觸，細(xì)胞周期阻滯，抑制DNA合成并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

CSE1L 基因定位于染色體20q13 上，該區(qū)域與多種癌癥密切相關(guān)，在大多數(shù)癌癥中高度表達(dá)[22]，包括肺癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、淋巴癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌等[12，23-30]，CSE1L 的表達(dá)與高水平癌癥分期和分級呈正相關(guān)[30]，CSE1L 對細(xì)胞的存活至關(guān)重要，CSE1L 耗盡會導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3132]。CSE1L 作為多功能基因，目前大部分研究都是針對其在癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移以及癌癥的進(jìn)展等方面，有望成為腫瘤治療的潛在靶點。但是，目前關(guān)于CSE1L 在哺乳動物細(xì)胞系中尤其是骨骼肌細(xì)胞生長發(fā)育的影響還沒有報道。本研究通過建立CSE1L 基因缺失的C2C12細(xì)胞系，篩選高切割效率的sgRNA；將sgRNA 和Cas9共轉(zhuǎn)C2C12細(xì)胞系并進(jìn)行流式細(xì)胞分選，通過實時熒光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白免疫印跡（Western-blot） 鑒定CSE1L 分子特征。最后分別利用CCK-8、細(xì)胞周期以及凋亡實驗對CSE1L 敲除細(xì)胞系進(jìn)行活力和凋亡檢測。本研成功構(gòu)建了CSE1L 基因敲除的小鼠成肌細(xì)胞系，CSE1L 基因mRNA和蛋白水平表達(dá)量都顯著下調(diào)， CSE1L 基因缺失導(dǎo)致C2C12細(xì)胞活力在72 h顯著下調(diào)，細(xì)胞周期停滯、凋亡增加，為進(jìn)一步深入研究CSE1L基因在骨骼肌生長發(fā)育中功能提供了細(xì)胞模型，并為后續(xù)基因編輯小鼠的制備奠定基礎(chǔ)。

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