收稿日期：2024-01-09；修回日期：2024-03-26

基金項(xiàng)目：（財(cái)政資金）四種特色蒙藥材種植技術(shù)集成配套與示范項(xiàng)目（RZ1900001339）;興安盟鄉(xiāng)土植物種質(zhì)資源收集、保存及評(píng)價(jià);內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金（2019MS03052）;六種特色蒙藥材原生態(tài)種植關(guān)鍵技術(shù)研究（2021GG0327）資助

作者簡(jiǎn)介：

穆贏通（1997-），男，漢族，河南駐馬店人，碩士研究生，主要從事藥用植物資源鑒定研究，E-mail：2911426494@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：bagenna123@aliyun.com

摘要：芍藥（Paeonia lactiflora）種子層積過(guò)程中形態(tài)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、酶活性、內(nèi)源激素及關(guān)鍵基因的表達(dá)，為其休眠機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。研究種子的形態(tài)變化，測(cè)定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、酶活性、激素及關(guān)鍵基因的表達(dá)。休眠解除過(guò)程分為下胚軸生長(zhǎng)、胚芽膨大和上胚軸生長(zhǎng);初始儲(chǔ)藏物質(zhì)以脂肪為主，約28%。休眠解除過(guò)程脂肪、淀粉、蛋白質(zhì)和可溶性糖整體下降，為萌發(fā)提供物質(zhì)。脂肪在休眠解除中消耗最多，為主要供能物質(zhì)。休眠解除過(guò)程分解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的酶活性變化符合營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化趨勢(shì)，抗氧化酶活性整體增強(qiáng);休眠解除過(guò)程中GA含量呈現(xiàn)上升-下降，ABA含量和GA/ABA比值顯著下降，關(guān)鍵基因變化符合內(nèi)源激素含量變化。芍藥種子休眠解除須滿足暖溫-低溫的變化，酶活性增強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解為休眠解除提供能量，ABA含量顯著下降是抑制萌發(fā)的主要激素。芍藥種子休眠的解除需要能量代謝和激素共同調(diào)控。

關(guān)鍵詞：芍藥種子；休眠；種子形態(tài)；生理生化指標(biāo)

中圖分類號(hào)：S567.239""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）11-3451-11

Study on Physiological and Biochemical Changes of Paeonia lactiflora

Seed During Dormancy Breaking

MU Ying-tong1， LYU Li-juan2， LI Xiao-jie1， WANG Jun-jie1， LU Jing-shi1，

JIA Jun-ying3， QING Ge-le4， SANG Hao5， ZHANG Xiao-ming^1*

（1.Inner Mongolia Autonomous Region Sino-Mongolia Medicinal Materials Breeding Engineering Technology Research Center，

College of Grassland， Resources and Environment， Inner Mongolia Agricultural University， Huhhot， Inner Mongolia 010019， China;

2.Hohhot Forestry and Grassland Bureau， Hohhot， Inner Mongolia 010019， China; 3.Universities Engineering Research Center of Chinese

（Mongolia） Ecological Planting Medicinal Materials （Nurture） in Inner Mongolia Autonomous Region， College of Agronomy， Inner Mongolia

Minzu University， Tongliao， Inner Mongolia 028000， China; 4.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，

Hohhot Inner Mongolia 010031， China; 5.Inner Mongolia Academy of Forestry， Hohhot， Ineer Mongolia 010031， China）

Abstract：The accumulation process of Paeonia lactiflora seed lays the foundation for studying its dormancy mechanism by exploring its morphological changes，nutrient substances，enzyme activity，endogenous hormones，and the expression of key genes. The study investigated the morphological changes of seeds and measured the levels of nutrient substances，enzyme activity，hormones，and key genes expression. The process of dormancy release was divided into lower embryo axis growth，embryo bud swelling，and upper embryo axis growth;initial storage materials were primarily composed of fats，accounting for about 28%. During the dormancy release process，fats，starch，proteins，and soluble sugars decreased overall，providing substances for germination. Fats were consumed the most during dormancy release，serving as the main source of energy substances. The changes in enzyme activity during the process of dormancy release reflected the trend of nutrient changes，with an overall enhancement in antioxidant enzyme activity. During dormancy release，there was an initial increase，followed by a decrease in gibberellic acid （GA） content，while the content of abscisic acid （ABA） and the GA/ABA ratio significantly decreased. Changes in key genes aligned with changes in endogenous hormone levels. The release of dormancy in Paeonia lactiflora seeds required fluctuations of temperature from warm to cold conditions，enhanced enzyme activity，and the breakdown of nutrients to provide energy for dormancy release. The significant decrease in ABA content was the main hormone inhibiting germination. Releasing dormancy in Paeonia lactiflora seeds required coordinated regulation of energy metabolism and hormones.

Key words：Paeonia lactiflora seeds;Seed dormancy;Seed morphology;Physiological and biochemical index

芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）為芍藥科（Paeoniaceae）芍藥屬（Paeonia）芍藥組（Sect. Paeonia）多年生草本植物^［1］。芍藥組分布在歐亞大陸的溫帶地區(qū)，大約有22種^［2］。芍藥具有極高的觀賞價(jià)值，同時(shí)也有極高的油用價(jià)值和藥用價(jià)值，其干燥根可以作為重要藥材赤芍（Paeonia Rubra Radix）和白芍^［3］?，F(xiàn)代藥理表明芍藥主要含有芍藥苷、黃酮類及其苷、有機(jī)酸、揮發(fā)油及糖類等多種化學(xué)成分在保肝抗消炎抗腫瘤發(fā)揮重要作用^［4］。藥用芍藥主要分布在內(nèi)蒙古，東北等地。目前藥用芍藥的繁殖方式主要有兩種類型，種子繁殖和分根繁殖。分根繁殖盡管可以很好地保留母本的優(yōu)良性狀，但繁殖率卻很低，3—5年才可分株，種子繁殖雖然繁殖系數(shù)較高，但芍藥種子具有獨(dú)特的發(fā)芽特性，即上胚軸和下胚軸同時(shí)休眠^［5］。并對(duì)解除休眠過(guò)程的環(huán)境溫度需求不同，早期的胚根生長(zhǎng)過(guò)程需要相對(duì)高溫條件，而胚芽的生長(zhǎng)過(guò)程需要低溫誘導(dǎo)。該萌發(fā)特性成為芍藥種子繁殖過(guò)程的主要障礙。

大量學(xué)者對(duì)芍藥種子休眠解除方法和休眠解除過(guò)程中的生理變化進(jìn)行了探究，如陶新宇等采用了切破種皮的方法，把芍藥種子的萌發(fā)率從33%提升到了63.7%，與對(duì)照比讓芍藥種子萌發(fā)縮短了5 d^［6］。雷慧霞等采用200 mg·L^-1 GA3浸種＋機(jī)械破皮處理芍藥種子，讓芍藥種子18 d萌發(fā)且生根率提高至100%^［7］，孫曉梅等發(fā)現(xiàn)在沙藏前使用濃度為500 mg·L^-1赤霉素浸種并結(jié)合80%濃硫酸處理2 min，芍藥種子生根率最高^［8］。此外孫曉梅等發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性和過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）活性與種子萌發(fā)過(guò)程中下降，過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）活性與萌發(fā)中升高^［9］。關(guān)雪蓮等研究發(fā)現(xiàn)芍藥種子可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)含量在GA3處理+沙藏處理下呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，且GA3處理+沙藏處理下的芍藥種子中可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)的增加量高于沙藏處理^［10］。金彪等發(fā)現(xiàn)露地播種條件下，芍藥種子下胚軸開(kāi)始伸長(zhǎng)時(shí)ABA含量迅速下降，GA1+3含量在上胚軸生長(zhǎng)前最高，上胚軸生長(zhǎng)后下降。在胚芽生長(zhǎng)時(shí)IAA和ZR含量均呈上升趨勢(shì)^［11］。李雪婷等發(fā)現(xiàn)ABA含量的下降促進(jìn)芍藥種子休眠解除，且胚和胚乳中的ABA是芍藥種子休眠的主要原因^［12］。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，采用本團(tuán)隊(duì)前期選取的層積處理方法對(duì)層積過(guò)程中種子形態(tài)變化、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、酶活性、內(nèi)源激素和基因表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。旨在深入探究芍藥種子休眠解除的生理機(jī)制，包括種子形態(tài)變化、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、酶活性、內(nèi)源激素水平和相關(guān)基因表達(dá)，以揭示芍藥種子休眠解除的內(nèi)在機(jī)制。通過(guò)系統(tǒng)地研究芍藥種子在不同環(huán)境條件下的生理變化，可以為解決芍藥種子萌發(fā)過(guò)程中的障礙提供科學(xué)依據(jù)，為芍藥種子的種子貯藏和繁殖技術(shù)提供理論支持和實(shí)踐指導(dǎo)。這對(duì)于促進(jìn)芍藥資源的合理利用、提高種子繁殖效率、保護(hù)和傳承芍藥品種具有重要的科學(xué)意義和實(shí)踐價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的野生芍藥種子為2020年6月于呼倫貝爾采集，千粒重120.03 g，含水量12.3%。

1.2 芍藥種子休眠解除過(guò)程中胚的形態(tài)變化

下胚軸生長(zhǎng)過(guò)程觀察：恒溫沙藏（20℃，水分約為16.5%）下觀察，種子露白前每隔7 d觀察一次芍藥種子生長(zhǎng)狀態(tài)，露白后，每隔3 d觀察一次，觀察60 d。

上胚軸生長(zhǎng)過(guò)程觀察：選取根長(zhǎng)3～4 cm種子600粒，300粒種子20℃沙藏培養(yǎng)，每重復(fù)100粒種子，每隔5 d觀察芍藥種子生長(zhǎng)狀態(tài)，觀察60 d；300粒種子4℃沙藏培養(yǎng)，每重復(fù)100粒種子。每隔5 d觀察芍藥種子生長(zhǎng)狀態(tài)，觀察60 d。

1.3 芍藥種子休眠解除過(guò)程生理生化變化

下胚軸生長(zhǎng)過(guò)程生理指標(biāo)測(cè)定：根據(jù)2.3研究結(jié)果，選取沙藏0 d，14 d，28 d，35 d，40 d，45 d的芍藥種子下胚軸用于生理指標(biāo)的測(cè)定。上胚軸生長(zhǎng)過(guò)程生理指標(biāo)測(cè)定：根據(jù)2.3研究結(jié)果，沙藏溫度分別在4℃、20℃環(huán)境下，選取沙藏55 d，75 d，80 d，90 d的芍藥種子上胚軸用于生理指標(biāo)的測(cè)定。具體指標(biāo)如下：

采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法進(jìn)行超氧化歧化酶（SOD）活性測(cè)定；采用愈創(chuàng)木酚比色法進(jìn)行過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定；采用紫外吸收法進(jìn)行過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定；采用蒽酮比色法進(jìn)行可溶性糖和淀粉含量測(cè)定；采用考馬斯亮藍(lán)G-250法進(jìn)行可溶性蛋白含量測(cè)定；采用索氏抽提法進(jìn)行粗脂肪含量測(cè)定；采用比色法進(jìn)行α-淀粉酶和β-淀粉酶活性測(cè)定；采用Folin-酚法進(jìn)行蛋白酶活性測(cè)定^［13-19］。

1.4 芍藥種子休眠解除過(guò)程內(nèi)源激素測(cè)定

根據(jù)上述研究結(jié)果，選取沙藏總時(shí)長(zhǎng)0 d（原始種子）、28 d（露白）、55 d（種子根長(zhǎng)達(dá)到4～5 cm胚芽膨大）、80 d（胚芽膨大且上胚軸伸長(zhǎng)）、分別用T0，T1，T2，T3表示每個(gè)時(shí)期，各取樣完整種子2 g用于ABA和GA的測(cè)定。

1.5 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

使用TIANGEN公司的多糖多酚總RNA提取試劑盒從芍藥種子中提取總RNA。使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)（Thermo Scientific，USA）和瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估RNA質(zhì)量。樣品反轉(zhuǎn)錄采用TIANGEN公司的FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（KR118）試劑盒按說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。反應(yīng)體系：總反應(yīng)體系20 μL，5×FastKing-RT SuperMix 4 μL，總RNA 1 μg，加RNA-free純水補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?2℃，15 min；95℃，3 min。

1.6 qRT－PCR分析

采用QIAGEN公司的QuantiNova SYBR Green PCR Kit試劑盒，在384孔板的LightCycler 384 System上進(jìn)行點(diǎn)樣，在羅氏LightCycler480 II實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器上設(shè)置參數(shù)，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系為：總體系10 μL，包含上下游引物各1 μL，1 μL cDNA模板，5 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，1 μL QN ROX Reference Dye，1 μL RNase-free water。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃、2 min；變性95℃、5 s；退火60℃、10 s，共40個(gè)循環(huán)。延伸階段收集熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后獲得溶解曲線。進(jìn)行熔化曲線分析，以驗(yàn)證預(yù)期PCR產(chǎn)物的特異性生成。引物序列根據(jù)實(shí)驗(yàn)室未公開(kāi)轉(zhuǎn)錄組自行設(shè)計(jì)的（表1），基于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的mRNA序列合成。mRNA的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為（PlACTIN），并使首先計(jì)算ΔCt，根據(jù)公式E=2^-ΔΔCt。

2 結(jié)果與分析

2.1 芍藥種子休眠解除不同階段的形態(tài)觀察

芍藥種子未經(jīng)層積處理發(fā)芽率僅為23.07，經(jīng)20℃層積可達(dá)72.45%。在20℃沙藏過(guò)程中，28 d時(shí)50%種子胚根突破種皮（露白），35 d時(shí)，種子50%開(kāi)始長(zhǎng)出胚根，且胚根的根長(zhǎng)達(dá)到了1～2 cm。40 d時(shí)，50%種子胚根長(zhǎng)度達(dá)到了2～3 cm。45 d時(shí)，50%種子胚根長(zhǎng)度達(dá)到了3～4 cm。

45 d后選取種子胚根長(zhǎng)度3～4 cm種子進(jìn)行20℃沙藏，沙藏55 d時(shí)，50%種子胚根長(zhǎng)度達(dá)4～5 cm。75 d時(shí)，50%種子胚根長(zhǎng)度達(dá)5～7 cm。80 d時(shí)，50%種子胚根長(zhǎng)度達(dá)7～9 cm。90 d時(shí)，50%種子胚根長(zhǎng)度達(dá)9 cm以上；將胚根長(zhǎng)度達(dá)3～4 cm的種子進(jìn)行4℃沙藏，沙藏55 d時(shí)，50%種子胚芽膨大，75 d時(shí)，50%種子子葉間開(kāi)裂且胚芽膨大，80 d時(shí)，50%種子上胚軸伸長(zhǎng)胚芽（淺黃色），90 d時(shí)，50%種子長(zhǎng)出真葉（表2、圖1）。

2.2 芍藥種子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與酶的動(dòng)態(tài)變化

2.2.1 種子萌發(fā)過(guò)程中抗氧化酶活性的變化 芍藥種子在20℃生根過(guò)程中超氧化物歧化酶（SOD）活性變化是先增加后下降。從沙藏的0 d的59.23 U·mg^-1·min^-1增加到沙藏55 d種子根長(zhǎng)（4～5 cm）的79.33 U·mg^-1·min^-1。此過(guò)程中芍藥種子一直旺盛生長(zhǎng)，產(chǎn)生大量的氧自由基，因此SOD活性一直增加。在沙藏的55 d后芍藥種子的SOD活性一直下降到沙藏90 d的70 U·mg^-1·min^-1。在此過(guò)程中芍藥種子屬于不正常生長(zhǎng)，一直處于生根狀態(tài)，芽不生長(zhǎng)，且根的生長(zhǎng)緩慢，因此SOD活性出現(xiàn)下降。如果芍藥種子在沙藏45 d后轉(zhuǎn)入4℃的環(huán)境下，芍藥種子的SOD活性會(huì)出現(xiàn)先下降后上升，從20℃沙藏45 d的73.2 U·mg^-1·min^-1減少至4℃沙藏10 d 68.97 U·mg^-1·min^-1。在這個(gè)階段芍藥種子受到了低溫脅迫，因此酶活性突然下降，隨后芍藥種子芽開(kāi)始生長(zhǎng)，酶的活性出現(xiàn)上升低溫沙藏第45 d為78.37 U·mg^-1·min^-1。這個(gè)過(guò)程中芍藥種子開(kāi)始出芽，但根停止生長(zhǎng)（圖2A）。

芍藥種子在20℃生根過(guò)程中過(guò)氧化物酶（POD）活性也呈先增加后下降，從沙藏0 d的6.13 U·mg^-1·min^-1增加至沙藏55 d的9.6 U·mg^-1·min^-1。當(dāng)芍藥種子根長(zhǎng)為5～7 cm沙藏75 d時(shí)，芍藥種子酶的活性開(kāi)始持續(xù)下降，最后為4.20 U·mg^-1·min^-1。如果芍藥種子在沙藏45 d后轉(zhuǎn)入4℃的環(huán)境下，POD活性變化規(guī)律與SOD活性一致，也是先降低后增加，先從沙藏45 d的8.6 U·mg^-1·min^-1下降到低溫沙藏10 d的7.6 U·mg^-1·min^-1，酶活性突然降低，主要原因可能是低溫脅迫。最后增加到11.86 U·mg^-1·min^-1，可能原因是種子開(kāi)始適應(yīng)低溫和芽的旺盛生長(zhǎng)（圖2B）。

芍藥種子在20℃生根過(guò)程中過(guò)氧化氫酶（CAT）活性變化和POD，SOD活性變化一致。從沙藏0 d的2.57 U·mg^-1·min^-1增加到沙藏55 d的7.87 U·mg^-1·min^-1然后開(kāi)始持續(xù)下降到2.90 U·mg^-1·min^-1，芍藥種子在沙藏45 d放入4℃的環(huán)境下，其變化規(guī)律與POD，SOD一致。從6.54 U·mg^-1·min^-1下降到5.83 U·mg^-1·min^-1，最后升高到10.23 U·mg^-1·min^-1（圖2C）。

2.2.2 種子萌發(fā)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及相應(yīng)酶活性變化 芍藥種子在20℃生根過(guò)程中淀粉含量一直下降，從沙藏0 d的40.13 mg·g^-1下降至沙藏45 d時(shí)的23.02 mg·g^-1，沙藏45 d后于4℃環(huán)境下降較快，下降至6.34 mg·g^-1，于20℃環(huán)境下，下降到14.31 mg·g^-1，4℃環(huán)境下代謝旺盛，有利芍藥種子休眠的解除（圖3A）。芍藥種子在20℃生根過(guò)程中可溶性糖含量變化呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)。從沙藏0 d的22.34 mg·g^-1上升到沙藏14 d的27.26 mg·g^-1，然后下降至沙藏45 d的13.23 mg·g^-1，可溶性糖含量在露白前下降是因?yàn)榉N子下胚軸生長(zhǎng)和根的生長(zhǎng)消耗了大量的能量。芍藥種子可溶性糖含量在4℃環(huán)境下呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，先上升至17.188 mg·g^-1，最后下降至8.12 mg·g^-1。在20℃環(huán)境下最后下降到6.54 mg·g^-1。4℃環(huán)境下芍藥種子可溶性糖消耗比20℃環(huán)境下消耗多，說(shuō)明芍藥種子在4℃環(huán)境下代謝旺盛，在此階段芍藥種子休眠完全解除（圖3B）。在20℃生根過(guò)程中粗脂肪含量變化從沙藏0 d的280.13 mg·g^-1到下降到了沙藏45 d的239.12 mg·g^-1。沙藏45 d后。粗脂肪含量的下降趨勢(shì)和淀粉含量的下降趨勢(shì)一致，4℃環(huán)境下降快最后下降到140.02 mg·g^-1 20℃環(huán)境下降慢，最后下降到200.34 mg·g^-1。粗脂肪在芍藥種子整個(gè)消耗大于淀粉，說(shuō)明芍藥種子主要用脂肪供能（圖3C）。芍藥種子在20℃生根過(guò)程中可溶性蛋白含量一直下降，從沙藏0 d的4.92 mg·g^-1下降到沙藏45 d的3.03 mg·g^-1。沙藏45 d后芍藥種子變化可溶性蛋白的變化規(guī)律和淀粉變化規(guī)律一致（圖3D）。

在20℃生根過(guò)程中，酸性磷酸酶活性變化從沙藏0 d的2.57 nmol·min^-1·mg^-1（protein）上升至沙藏45 d的8.56 nmol·min^-1·mg^-1（protein）。在芍藥種子沙藏45 d后，在4℃環(huán)境下芍藥種子的酸性磷酸酶活性出現(xiàn)先略微下降，后大幅升高趨勢(shì)。出現(xiàn)這種情況是因?yàn)樯炙幏N子在低溫環(huán)境的脅迫下酸性磷酸酶活性出現(xiàn)下降，后來(lái)上升因?yàn)樯炙幏N子在低溫環(huán)境下種子上胚軸的休眠逐漸解除，淀粉前期消耗很多，這時(shí)候脂肪變成主要供能物質(zhì)。在20℃環(huán)境下芍藥種子酸性磷酸酶活性先上升后下降。因?yàn)樯炙幏N子后期供能物質(zhì)為脂肪，因此活性升高，但一直處于20℃下芍藥種子胚根不正常生長(zhǎng)，種子代謝開(kāi)始下降因此酸性磷酸酶活性下降（圖4A）。在20℃生根過(guò)程中，α-淀粉酶活性變化從沙藏0 d的0.095 mg·g^-1·min^-1（FW）上升到沙藏45 d的0.189 mg·g^-1·min^-1（FW）。在芍藥種子沙藏45 d后，4℃環(huán)境下芍藥種子的α-淀粉酶活性出現(xiàn)先略微下降后升高再下降的趨勢(shì)，出現(xiàn)這種情況是因?yàn)樯炙幏N子剛進(jìn)入低溫環(huán)境中，在低溫環(huán)境的脅迫下淀粉酶的活性出現(xiàn)下降。后來(lái)上升因?yàn)樯炙幏N子在低溫環(huán)境下種子上胚軸的休眠逐漸解除，開(kāi)始生長(zhǎng)。后期下降因?yàn)樯炙幏N子儲(chǔ)藏的淀粉已經(jīng)大量消耗。在20℃環(huán)境下芍藥種子α-淀粉酶活一直下降，因?yàn)樯炙幏N子胚根不正常生長(zhǎng)，種子代謝處于較低水平。此外β-淀粉酶活性的變化規(guī)律α-淀粉酶一致，但β-淀粉酶的活性始終大于α-淀粉酶的活性（圖4B～4C）。在20℃生根過(guò)程中，蛋白酶活性變化從沙藏0 d的0.57 μmol·g^-1·h^-1到上升到沙藏45 d的1.56 μmol·g^-1·h^-1。在芍藥種子沙藏45 d后，在4℃環(huán)境下芍藥種子的蛋白酶活性出現(xiàn)先略微下降，后升高趨勢(shì)。出現(xiàn)這種情況是因?yàn)樯炙幏N子剛進(jìn)入低溫環(huán)境在低溫環(huán)境的脅迫下蛋白酶活性出現(xiàn)下降。后來(lái)上升因?yàn)樯炙幏N子在低溫環(huán)境下種子上胚軸和芽開(kāi)始形成需要大量氨基酸。在20℃環(huán)境下芍藥種子蛋白酶活性先上升后下降。因?yàn)樯炙幏N子在20℃環(huán)境下剛開(kāi)始代謝正常，后來(lái)休眠不能解除，代謝水平下降（圖4D）。

2.3 種子萌發(fā)過(guò)程內(nèi)源激素變化研究

GA在種子萌發(fā)過(guò)程中能增強(qiáng)胚的生長(zhǎng)勢(shì)，促進(jìn)胚根和下胚軸細(xì)胞的生長(zhǎng)和伸長(zhǎng)，GA一般在種子露白前大量積累。在芍藥種子休眠解除過(guò)程中GA整體上升，從0.52 ng·g^-1上升到0.75 ng·g^-1。GA在芍藥種子露白、長(zhǎng)根、長(zhǎng)芽過(guò)程中大輻上升高，從0.52 ng·g^-1上升到5.21 ng·g^-1，但在上胚軸伸長(zhǎng)階段出現(xiàn)下降，從5.21 ng·g^-1下降到0.75 ng·g^-1（圖5B）。脫落酸ABA對(duì)種子休眠解除起負(fù)調(diào)控作用。在芍藥種子休眠解除過(guò)程中，ABA含量整體下降，從72.54 ng·g^-1下降到2.41 ng·g^-1（圖5C）。GA，ABA是調(diào)控種子休眠最主要的激素。ABA是調(diào)控種子休眠最直接的激素，因此對(duì)2種激素的比例變化進(jìn)行研究，內(nèi)源激素含量比值結(jié)果分析顯示GA/ABA在芍藥種子休眠解除過(guò)程中整體下降。說(shuō)明種子休眠的解除和激素GA/ABA的含量比例有很大關(guān)系（圖5A）。

2.4 種子休眠解除過(guò)程中激素相關(guān)基因的表達(dá)分析

使用PlACTIN作為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因的引物序列見(jiàn)表1。根據(jù)熔解曲線分別找到各基因最佳退火溫度。GA2ox，KAO，CYP707A2，NCED的最佳退火溫度為60℃。4個(gè)基因的熔解曲線表明熒光定量PCR產(chǎn)物的可信性極高（圖6）。

內(nèi)源激素GA的分解基因GA2ox在芍藥種子休眠解除過(guò)程中相對(duì)表達(dá)量整體下降，與內(nèi)源激素GA的變化趨勢(shì)相反，表達(dá)量從11.61下降到9.48（圖7A）。合成基因KAO相對(duì)表達(dá)量整體上升，與內(nèi)源激素GA的變化趨勢(shì)一致，表達(dá)量從7.12上升到7.93，在芍藥種子露白、長(zhǎng)根、長(zhǎng)芽過(guò)程中大輻上升高，從7.12上升到15.54，但在上胚軸伸長(zhǎng)階段出現(xiàn)下降，從15.54下降到7.93（圖7B）。脫落酸ABA的分解基因CYP707A2相對(duì)表達(dá)量整體上升，從3.54上升到8.69（圖7C）。合成基因NCED相對(duì)表達(dá)量整體下降，與內(nèi)源激素ABA含量的變化趨勢(shì)一致，從13.01下降到2.42（圖7D）。

GA2ox與KAO的變化趨勢(shì)與內(nèi)源激素GA整體上升一致，由于分解基因GA2ox相對(duì)表達(dá)量整體下降，導(dǎo)致內(nèi)源激素GA增多，合成基因KAO相對(duì)表達(dá)量整體上升，導(dǎo)致內(nèi)源激素GA上升；NCED與CYP707A2基因變化趨勢(shì)與內(nèi)源激素ABA整體上升一致，分解基因CYP707A2相對(duì)表達(dá)量整體下降，內(nèi)源激素ABA增多，合成基因NCED相對(duì)表達(dá)量整體上升，內(nèi)源激素ABA上升（圖7）。

3 討論

3.1 芍藥種子休眠解除過(guò)程中胚的形態(tài)變化

本研究觀察20℃恒溫沙藏下，20℃/4℃變溫沙藏下的種子形態(tài)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)芍藥種子在20℃沙藏28 d種子露白，20℃沙藏45 d根長(zhǎng)3～4 cm胚芽分化，這與費(fèi)日曼等^［21］的發(fā)現(xiàn)一致。4℃沙藏28 d上胚軸開(kāi)始生長(zhǎng)。如果芍藥種子在根長(zhǎng)3～4 cm繼續(xù)20℃沙藏，芍藥種子會(huì)一直長(zhǎng)根。胚芽生長(zhǎng)緩慢，上胚軸不會(huì)生長(zhǎng)。這與描述Zhang等^［22］描述不同。芍藥種子在根長(zhǎng)3～4 cm進(jìn)行4℃低溫沙藏，芍藥種子的胚芽會(huì)快速生長(zhǎng)，上胚軸休眠解除，45 d后50%芍藥種子出苗。因此芍藥種子萌發(fā)的關(guān)鍵時(shí)期為下胚軸的伸長(zhǎng)，胚芽膨大和上胚軸伸長(zhǎng)。

3.2 芍藥種子休眠解除過(guò)程生理變化

研究表明種子解除休眠的生理過(guò)程往往伴隨著活性氧的產(chǎn)生和積累，活性氧的產(chǎn)生與植物發(fā)育過(guò)程中自由基的產(chǎn)生有關(guān)^［23］。抗氧化酶系統(tǒng)是植物體內(nèi)重要的活性氧清除系統(tǒng)^［24］。研究發(fā)現(xiàn)SOD活性在20℃下先升高后下降，在此溫度下芍藥種子只長(zhǎng)根不長(zhǎng)芽，而在4℃下SOD活性先下降而后升高，在此過(guò)程中種子開(kāi)始出芽，但根停止生長(zhǎng)。POD和CAT在消除H2O2和其它自由基的代謝方面起著重要作用，POD和CAT在20℃生根過(guò)程中活性變化與SOD活性變化一致，先升高后降低。在4℃的環(huán)境下，其變化規(guī)律與SOD一致，先降低后升高。這說(shuō)明SOD，POD和CAT活性與芍藥種子休眠的解除呈正相關(guān)，這與孫曉梅等人的研究結(jié)果一致^［9］。

可溶性糖由淀粉、脂肪等貯藏物質(zhì)降解而得到，二者均能為種子萌發(fā)提供能量^［25］。本研究中芍藥種子在20℃生根過(guò)程中淀粉含量一直下降，沙藏45 d后，在4℃環(huán)境下種子休眠解除，代謝旺盛，相比在20℃環(huán)境下淀粉含量下降更為明顯，除此芍藥種子生根階段相比發(fā)芽階段消耗淀粉更多；可溶性糖含量在20℃和4℃環(huán)境下，均表現(xiàn)下降趨勢(shì)。與淀粉含量變化一致，4℃相比于20℃環(huán)境下降幅度大。與孫海燕等人研究的‘鳳丹’種子萌發(fā)過(guò)程的淀粉和可溶性糖含量變化趨勢(shì)一致^［26］。

在α-淀粉酶和β-淀粉酶催化下，淀粉進(jìn)行分解。研究發(fā)現(xiàn)芍藥種子在20℃生根過(guò)程中，α-淀粉酶活性上升。在剛進(jìn)入4℃低溫環(huán)境下α-淀粉酶活性出現(xiàn)下降，后在低溫環(huán)境下種子上胚軸的休眠逐漸解除，起初α-淀粉酶活性開(kāi)始升高，后期下降因儲(chǔ)藏的淀粉已經(jīng)大量消耗，α-淀粉酶活性下降。β-淀粉酶活性的變化規(guī)律與α-淀粉酶一致，但β-淀粉酶的活性始終大于α-淀粉酶的活性。

脂肪在脂肪酶的作用下水解成脂肪酸和甘油，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為糖類物質(zhì)，為種子的萌發(fā)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)^［27］。本研究發(fā)現(xiàn)芍藥種子在20℃生根過(guò)程中粗脂肪含量持續(xù)下降。沙藏45 d后，粗脂肪含量的下降趨勢(shì)和淀粉含量的下降趨勢(shì)一致，4℃環(huán)境下比20℃環(huán)境下降趨勢(shì)相對(duì)較快，但芍藥種子生根階段比發(fā)芽階段消耗粗脂肪相對(duì)較少，與淀粉變化規(guī)律相反。分解粗脂肪的活性酶，酸性磷酸酶活性先上升，沙藏45 d后，在4℃環(huán)境下先略微下降，后呈現(xiàn)大幅升高趨勢(shì)?？赡苁怯捎谏炙幏N子低溫脅迫下出現(xiàn)酸性磷酸酶活性下降。后在低溫環(huán)境下種子上胚軸的休眠逐漸解除，由于前期消耗了大量淀粉，此時(shí)脂肪變成主要功能物質(zhì)，但如果一直處于20℃下芍藥種子胚根不能正常生長(zhǎng)，種子代謝開(kāi)始下降導(dǎo)致藥種子酸性磷酸酶活性下降。

可溶性蛋白質(zhì)會(huì)降解為氨基酸，為種子休眠的解除提供氮源。本研究發(fā)現(xiàn)芍藥種子在20℃生根過(guò)程中可溶性蛋白含量一直下降。沙藏45 d后芍藥種子變化可溶性蛋白的變化規(guī)律和淀粉變化規(guī)律一致。在20℃生根過(guò)程中，蛋白酶活性先上升，沙藏45 d后，在剛進(jìn)入4℃低溫環(huán)境下蛋白酶活性出現(xiàn)先略微下降，后在低溫環(huán)境下種子上胚軸和芽開(kāi)始形成需要大量氨基酸，蛋白酶活性上升。如果一直處在20℃環(huán)境下，剛開(kāi)始代謝正常芍藥種子蛋白酶活性呈先上升，后因休眠不能解除，代謝水平下降，蛋白酶活性呈下降趨勢(shì)。本研究只初步研究了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和酶的變化規(guī)律。對(duì)于三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在休眠解除過(guò)程分解的先后順序是否存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系還需進(jìn)一步探討。

3.3 芍藥種子休眠解除過(guò)程中激素和基因的變化

植物激素調(diào)控種子休眠和萌發(fā)不是單一激素起作用，而是激素之間的共同調(diào)控。ABA是調(diào)控植物種子休眠的重要激素。其他植物激素主要通過(guò)與ABA互作來(lái)調(diào)控種子的休眠和萌發(fā)。種子中ABA/GA的動(dòng)態(tài)關(guān)系決定種子的萌發(fā)與休眠^［28-30］脫落酸主要的代謝途徑是CYP707A亞家族P450單加氧酶對(duì)ABA的8′-羥基化使ABA失去生物活性^［31-32］。NCED對(duì)類胡蘿卜素的裂解和CYP707A 8′-羥化酶對(duì)ABA的失活已被證明是控制ABA積累的關(guān)鍵調(diào)控步驟，二者在休眠解除過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用^［33］。突變體分析表明，NCED在胚和胚乳中的表達(dá)對(duì)誘導(dǎo)休眠產(chǎn)生ABA有重要貢獻(xiàn)^［34-35］。CYP707A 8′-羥化酶負(fù)調(diào)控種子休眠。雙突變體cyp707a1、cyp707a2與野生型材料相比，種子內(nèi)ABA含量明顯升高，增強(qiáng)種子的休眠強(qiáng)度^［36］。此外在擬南芥種子吸脹過(guò)程中CYP707A 8′-羥化酶被活化降低ABA含量會(huì)下降，促進(jìn)種子萌發(fā)^［37］。GA生物合成的關(guān)鍵酶有貝殼杉烯酸氧化酶（KAO）、內(nèi)根-貝殼杉烯合酶（KS）等^［38］。GA在植物中的代謝包括被GA 2-氧化酶（GA2ox）失活、被甲基轉(zhuǎn)移酶催化成為GA甲基酯等^［39］。GA缺陷突變體種子需要在外源GA的作用下才能萌發(fā)，擬南芥GA缺陷突變體ga1種子的休眠解除與萌發(fā)也需要外源GA^［40-41］。GA20ox基因在種子萌發(fā)過(guò)程中表現(xiàn)出高表達(dá)水平^［42-43］。本研究對(duì)芍藥種子休眠解除過(guò)程中的關(guān)鍵時(shí)期進(jìn)行植物激素ABA和GA及其關(guān)鍵基因的研究。在芍藥種子休眠解除過(guò)程中GA、ABA，在芍藥種子休眠解除過(guò)程中有差異變化。脫落酸整體降低，可能對(duì)休眠解除起主要抑制作用。赤霉素整體升高，對(duì)休眠解除起促進(jìn)作用。對(duì)GA、ABA合成、代謝的關(guān)鍵基因進(jìn)行分析。ABA生物合成和失活基因，包括NCED、CYP707As的變化趨勢(shì)符合ABA的內(nèi)源含量變化。GA生物合成和失活基因（KAO和GA2oxs）與內(nèi)源激素變化符合。本研究只初步探討了內(nèi)源激素ABA、GA及其相關(guān)基因的表達(dá)量變化，對(duì)于植物激素信號(hào)調(diào)控種子休眠的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究深入探討植物激素在芍藥種子休眠解除過(guò)程中的作用。結(jié)果表明，ABA和GA在種子休眠解除中起到了關(guān)鍵作用。ABA的整體降低可能是主要抑制因素，而GA的升高則促進(jìn)了休眠解除和萌發(fā)。具體來(lái)說(shuō)，脫落酸和CYP707A等基因在ABA代謝中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，而GA生物合成和失活相關(guān)基因也參與了調(diào)節(jié)。我們的研究為理解植物種子休眠解除的分子機(jī)制提供了重要線索。未來(lái)，進(jìn)一步的研究可以更深入地探究植物激素信號(hào)在種子休眠調(diào)控中的詳細(xì)機(jī)制，這對(duì)于提高作物產(chǎn)量和改良植物品質(zhì)具有重要意義。

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（責(zé)任編輯 劉婷婷）