摘要：為分析青貯玉米來源近殼多胞菌屬種類及其致病性，本研究采集疑似病葉，對病原菌進(jìn)行分離純化，結(jié)合病原菌菌落和子囊孢子形態(tài)特征以及核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）、核糖體小亞基（Ribosomal small subunit，SSU）和翻譯延伸因子（Translation elongation factor，TEF-1α）序列聯(lián)合分析，鑒定分離自青貯玉米葉斑病樣本的近殼多胞菌屬種類，明確其有性生殖類型，通過劃傷接種和噴霧接種對其致病性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，分離得到的40株病原菌為穎枯近殼多胞菌（Parastagonospora nodorum），并只擴(kuò)增出1種交配型基因片段，為MAT1交配型；穎枯近殼多胞菌可通過室內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生有性后代，有性生殖類型為同宗配合；致病性測定結(jié)果表明40株菌株能侵染7個品種的青貯玉米引起葉斑病。本研究初步明確青海省青貯玉米來源近殼多胞菌屬真菌種類及其致病性，為后續(xù)青貯玉米病害準(zhǔn)確識別及綜合防治提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：青貯玉米；穎枯近殼多胞菌；葉斑病；致病性

中圖分類號：S435.13""" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）11-3400-08

Identification and Pathogenicity Analysis of Parastagonospora Leaf

Spot Pathogens from Silage Maize

CHANG Jian-ping1， NI Ru-yuan1， HE Chen-bang2， LU Guang-xin1， LIU Zhong-ge1，

LAI You-peng^2*， QI He-xing^1*

（1. College of Agriculture and Animal Husbandry， Qinghai University， Xining， Qinghai Province 810016， China;

2. Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Qinghai University， Xining， Qinghai Province 810016， China）

Abstract：In this study，in order to analyze the species and pathogenicity of Parastagonospora pathogens from silage corn，samples were collected and the pathogens were isolated. Morphology of colony and ascospores was observed，and phylogenetic analysis of internal transcribed spacer （rDNA-ITS），ribosomal small subunit （SSU） and translation elongation factor （TEF-1α） gene sequences of the pathogen were analyzed. To identify the species of Parastagonospora isolated from leaf spot disease samples of silage maize and clarify the type of sexual reproduction of this species，the pathogenicity was analyzed by scratching and spraying. The results showed that 40 isolates were Parastagonospora nodorum，and only one mating type gene of P. nodorum fragment was amplified，which was MAT1 mating type. P. nodorum was induced to produce sexual progeny，and the sexual reproduction type was homothallism. Pathogenicity test results showed that all the 40 isolates could infect 7 cultivars of silage maize，and caused leaf spot disease. In this study，we preliminarily clarify the species and pathogenicity of Parastagonospora pathogens from silage maize in Qinghai Province，which provides a theoretical basis for the accurate identification and comprehensive prevention of silage maize diseases.

Key words：Silage maize;Parastagonospora nodorum;Leaf spot;Pathogenicity

收稿日期：2024-02-08；修回日期：2024-04-20

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（32460653）資助

作者簡介：

常建萍（1998-），女，漢族，青海西寧人，碩士研究生，主要從事植物病理研究，E-mail：3308283833@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：yplai@126.com；qhx390495559@126.com

玉米（Zea mays）是重要的青貯原料^［1-2］，中國玉米種植面積和總產(chǎn)量已超過水稻（Oryza sativa）和小麥（Triticum aestivum），為第一大糧食作物^［3］。青貯玉米飼料營養(yǎng)豐富、利用率高，是養(yǎng)殖業(yè)不可缺少的優(yōu)良飼料^［4］和基礎(chǔ)飼料之一^［5］。發(fā)展種植青貯玉米可解決飼草、飼料產(chǎn)量不足問題，促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展^［6］。青海是全國五大牧區(qū)之一，青貯玉米產(chǎn)量高、穩(wěn)增收，推動了青海畜牧業(yè)發(fā)展，已成為青海省農(nóng)業(yè)特色產(chǎn)業(yè)^［7-8］。

隨著青貯玉米種植面積增加和優(yōu)質(zhì)青貯飼料需求量增大，田間真菌性病害問題愈加復(fù)雜，嚴(yán)重影響了青貯玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)^［9-10］。穎枯近殼多胞菌（Parastagonospora nodorum）同物異名為穎枯殼針孢（Septoria nodorum）、穎枯殼多隔孢（Stagonospora nodorum），隸屬于子囊菌門（Ascomycota），暗球腔菌科（Phaeosphaeriaceae），近殼多胞菌屬（Parastagonospora），其有性階段為穎枯球腔菌（Leptosphaeria nodorum，Phaeosphaeria nodorum）^［11-14］。目前，國內(nèi)外關(guān)于穎枯近殼多胞菌引起病害的報道相對較少，大多數(shù)為穎枯近殼多胞菌能侵染小麥引起小麥穎枯?。╓heat septoria nodorum blotch）^［15-17］，主要危害小麥未成熟穗部和莖稈，危害葉片和葉鞘^［11］，發(fā)病嚴(yán)重時穗部穎片變成深棕色或深紫色，導(dǎo)致籽粒干癟^［18］。此外，趙丹^［14］于2013年發(fā)現(xiàn)穎枯殼多隔孢能侵染洛陽牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews），引起牡丹枝枯病，發(fā)病嚴(yán)重時造成枝條表皮開裂、枝條枯死；2019年于內(nèi)蒙古發(fā)現(xiàn)穎枯近殼多胞菌能侵染羊草（Leymus chinensis）引起葉斑病^［19］。

由近殼多胞菌屬真菌引起的玉米病害在國內(nèi)外報道較少，本課題組于2018—2023年在青海省東部農(nóng)業(yè)區(qū)西寧市和海東市青貯玉米種植區(qū)、青海大學(xué)實(shí)驗(yàn)田進(jìn)行病害調(diào)查時發(fā)現(xiàn)青貯玉米真菌性葉斑病害發(fā)生嚴(yán)重，采集疑似葉斑病樣本，前期通過田間病斑特征和菌落形態(tài)學(xué)特征初步判斷分離得到40株近殼多胞菌屬真菌，對其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和致病性分析，明確青海省東部農(nóng)業(yè)區(qū)青貯玉米近殼多胞菌屬真菌的種類，為青貯玉米葉斑病的準(zhǔn)確診斷和有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

2018—2023年，在青海省東部農(nóng)業(yè)區(qū)西寧市和海東市青貯玉米種植區(qū)采用五點(diǎn)取樣法采集疑似病害樣本（表1）。青貯玉米品種‘金頓313’‘鐵研53’‘豫玉22’‘甘玉23’‘晉單60’‘金穗3號’和‘中單2號’由青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院提供，用于致病性測定。

1.2 培養(yǎng)基配制

參照馬桂花等^［20］的方法配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dextrose agar，PDA）和2%水瓊脂培養(yǎng)基（Water agar，WA）。

1.3 病原菌的分離、純化與保藏

采用組織分離法對病原菌進(jìn)行分離純化^［10］；保存病原菌采用濾紙片保藏法^［21］，分離的純菌株接種于0.5 cm×0.5 cm無菌濾紙片的PDA平板上，培養(yǎng)7 d，無菌牙簽夾取長滿菌絲的濾紙片于滅菌硫酸紙袋，待濾紙片完全干燥后放入—20℃冰箱保存^［22］。

1.4 病原菌的分類鑒定

1.4.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定 菌落形態(tài)觀察：分離菌株接種于PDA平板，25℃培養(yǎng)7 d。用直徑5 mm的打孔器取菌餅，倒置于相同厚度的PDA平板中央，25℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)，每株菌株3個重復(fù)^［10］。

子囊及子囊孢子形態(tài)觀察：將交配型菌株隨機(jī)組合接種至PDA培養(yǎng)基進(jìn)行對峙培養(yǎng)，26℃黑暗培養(yǎng)3 d，之后16℃弱光培養(yǎng)21 d，誘導(dǎo)穎枯近殼多胞菌進(jìn)行有性生殖，觀察菌絲的生長情況和子囊殼是否形成，對峙平板分別做3個重復(fù)。子囊殼形成后挑取子囊制成臨時玻片，在40×光學(xué)顯微鏡（尼康Eclipse Ni-U）下觀察子囊殼、子囊和子囊孢子形態(tài)特征。

1.4.2 菌株交配型基因的擴(kuò)增 以分離菌株基因組DNA為模板，穎枯近殼多胞菌交配型基因序列SnMAT1.1和SnMAT1.2，SnMAT2.1和SnMAT2.2為引物鑒定其交配型，分別擴(kuò)增大小為325 bp和513 bp的片段^［23］（表2）。SnMAT1 PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃，4 min；變性94℃，30 s，退火50℃，30 s，延伸72℃，1 min，30個循環(huán)；72℃，10 min，SnMAT2 PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃，4 min；變性94℃，30 s，退火56℃，30 s，延伸72℃，1 min，30個循環(huán)；72℃，10 min。

1.4.3 菌株基因組DNA的提取 采用CTAB法提取基因組DNA^{［10，20］}，用25 μL無菌水溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 菌株系統(tǒng)發(fā)育分析 使用ITS1和ITS4引物擴(kuò)增rDNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）區(qū)域^［24］，用NS1和NS4引物對核糖體小亞基（Ribosomal small subunit，SSU）基因進(jìn)行擴(kuò)增^［24］，使用引物EF1-983F和EF1-2218R擴(kuò)增翻譯延伸因子1-α^［25］（表3）。25 μL PCR反應(yīng)體系：21.05 μL 1.1×PCR Mix；上下游引物（25 pmol·L^-1）各1.0 μL；模板DNA（30 μg·L^-1）1.0 μL；雙蒸水0.95 μL。

PCR擴(kuò)增步驟：預(yù)變性94℃，5 min；變性94℃，30 s，退火50℃～55℃，30 s，延伸72℃，1 min～1.5 min，30個循環(huán)；72℃，10 min。PCR產(chǎn)物通過0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，純化后送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序。參照祁鶴興等^［10］和常建萍等^［21］的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行同源性比對，利用MEGA7.0軟件進(jìn)行序列比對，使用軟件SequenceMatrix1.7.8進(jìn)行序列拼接，聯(lián)合3個基因序列進(jìn)行建樹，以交鏈格孢（Alternaria alternata）作為外群，運(yùn)算重復(fù)1000次，構(gòu)建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹。菌株登錄號分別為ITS：OP748716-OP748752，PP146380-PP146382；SSU：OP750335-OP750371，PP146403-PP146405；TEF1-α：OP762336- OP762372，PP157128-PP157130。

1.5 病原菌致病性測定

用0.025% Tween 20溶液將培養(yǎng)7 d的菌株制備為菌絲懸浮液^［22］。在盛有營養(yǎng)土直徑為12 cm的塑料花盆中種植青貯玉米‘金頓313’‘鐵研53’‘豫玉22’‘甘玉23’‘晉單60’‘金穗3號’和‘中單2號’，采用離體劃傷接種法^［26］和菌絲懸浮液噴霧接種法測定病原菌致病性。接種試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

離體劃傷接種法：剪取4～6葉期青貯玉米心葉中下部，葉片均勻劃傷2處，菌絲塊倒置接種于劃傷處，接種葉片置于培養(yǎng)皿中，25℃黑暗保濕培養(yǎng)24 h，之后12 h光照、12 h黑暗孵育7 d，接種無菌蒸餾水作為對照。

噴霧接種法：在培養(yǎng)7 d的培養(yǎng)皿中加入25 mL 0.025% Tween 20溶液，用無菌棉簽刮擦菌落，渦旋打碎得到菌絲懸浮液，噴霧接種于2周齡的青貯玉米幼苗，并以接種無菌蒸餾水為空白對照，25℃黑暗保濕培養(yǎng)24 h，之后12 h光照、12 h黑暗培養(yǎng)7 d，觀察發(fā)病情況。每株菌株重復(fù)接種3盆植株。從接種發(fā)病的青貯玉米上再次分離病原菌，與田間分離菌株的形態(tài)特征進(jìn)行比較，完成柯赫氏法則驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯玉米近殼多胞葉斑病菌分類鑒定

2.1.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定 菌落呈典型的圓形，氣生菌絲發(fā)達(dá)。菌絲棉絮狀，中間稠密，略隆起，菌落背面出現(xiàn)淺黃色色素，無分生孢子形成。從發(fā)病葉片重新分離得到的菌株，PDA平板培養(yǎng)7 d后，菌落形態(tài)與野生型菌株一致，符合柯赫氏法則（圖1）。

用穎枯近殼多胞菌交配型鑒定特異性引物對40株菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，40株分離菌株只擴(kuò)增出1種交配型基因片段，條帶大小均為325 bp的單一條帶，表明40株菌株均為MAT1交配型（圖2）。不同菌株對峙培養(yǎng)交界處沒有形成子囊殼，只有菌株TJZYM-125形成子囊殼（圖3A），單獨(dú)培養(yǎng)該菌株也能形成子囊殼（圖3B）。子囊殼為黑色、球形至近球形，無毛，平均大小1595.81 μm×1234.06 μm（圖3c），體視鏡下壓黑色子囊殼，發(fā)現(xiàn)有子囊和子囊孢子溢出。子囊棒狀，直或稍彎曲，無色，平均大小146.67 μm×14.67 μm（圖3d）。子囊內(nèi)含8個子囊孢子，呈近雙列排列成梭形，重疊，無柄或近無柄，子囊孢子棕色或淡棕色，紡錘形，稍彎曲，多數(shù)具有3個橫向隔膜，隔膜處有明顯縊縮，大小為42.73 μm×7.68 μm（圖3e）。

2.1.2 菌株分子生物學(xué)鑒定 多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，分離的菌株與穎枯近殼多胞菌Parastagonospora nodorum聚在同一分支上，支持率為100%。結(jié)合ITS，SSU和TEF1-α基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析和菌株形態(tài)特征，將分離菌株鑒定為P. nodorum。

2.2 青貯玉米近殼多胞葉斑病菌致病性分析

菌株經(jīng)離體劃傷接種7 d后，在劃傷處產(chǎn)生近圓形或橢圓形、褐色或深褐色病斑，病斑邊緣產(chǎn)生黃色暈圈，對照葉片無發(fā)病癥狀（圖5）。接種結(jié)果表明穎枯近殼多胞菌能侵染7個不同品種的青貯玉米，引起葉斑病。接種穎枯近殼多胞菌后，青貯玉米‘金頓313’和‘鐵研53’，形成近圓形褐色病斑，‘晉單60’ ‘金穗3號’和‘中單2號’病斑顏色較深為深褐色、橢圓形病斑，接種青貯玉米‘金頓313’ ‘晉單60’和‘金穗3號’品種后玉米葉片變紅，可能與青貯玉米感染葉斑病后，葉綠體色素遭到破壞，轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄇ嗨?，葉片中花青素含量升高有關(guān)。

穎枯近殼多胞菌經(jīng)活體噴霧接種青貯玉米葉片，早期形成棕色或褐色，橢圓形或不規(guī)則形狀的斑點(diǎn)；后期病斑逐漸變大擴(kuò)展，形成深褐色、橢圓形或不規(guī)則形病斑，病斑周圍出現(xiàn)明顯的黃色暈圈（圖6）；發(fā)病嚴(yán)重時，病斑連片，青貯玉米葉片萎蔫并出現(xiàn)白色菌絲，最終干枯死亡。用無菌水接種的對照植株未出現(xiàn)發(fā)病癥狀。以上結(jié)果表明穎枯近殼多胞菌能夠侵染青貯玉米葉片，引起葉斑病。

3 討論

真菌性親和個體交配方式有同宗配合（homothallism）和異宗配合（heterothallism）兩種^［27］。異宗配合真菌大多數(shù)都是雌雄異體，需要不同交配型菌株間進(jìn)行雜交，單個個體不能完成有性生殖，同宗配合為雌雄同體，單個菌株自交就可完成整個有性生殖過程^［28］，自然界中90%真菌有性生殖以異宗配合的方式進(jìn)行^［29］。1957年Shaw證明了麥類殼多胞斑點(diǎn)病菌Leptosphaeria avenaria可以單獨(dú)培養(yǎng)產(chǎn)生子囊和子囊孢子，從而證明該真菌是同宗配合^［30］。1989年，Shoemaker等將Leptosphaeria avenaria f.sp. triticea歸入近殼多胞菌屬有性階段，命名為Phaeosphaeria avenaria f. sp. tritici，并發(fā)現(xiàn)其亞種對小麥和其他谷物具有較弱致病性，是同宗配合^［31］。

1991年Bathgate等^［32］在野外發(fā)現(xiàn)小麥秸稈上產(chǎn)生黑色子囊殼，利用收集到的子囊殼，在顯微鏡下觀察到子囊孢子，根據(jù)孢子形態(tài)，鑒定出該病原菌為Phaeosphaeria nodorum。本課題組在室外采樣時未發(fā)現(xiàn)青貯玉米葉片出現(xiàn)子囊殼，將分離得到的穎枯近殼多胞菌（Parastagonospora nodorum）在室內(nèi)進(jìn)行對峙培養(yǎng)，共有雜交組合232皿，誘導(dǎo)培養(yǎng)24 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜交組合未能在相交線處形成子囊殼，其中只有菌株TJZYM-125能產(chǎn)生成熟的子囊和子囊孢子，證明本研究中的穎枯近殼多胞菌可以通過室內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生有性后代，結(jié)合交配型基因擴(kuò)增結(jié)果表明，穎枯近殼多胞菌有性生殖類型為同宗配合。孟家興^［33］發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)誘導(dǎo)條件下假禾谷鐮孢菌（Fusarium pseudograminearum）有性生殖沒有產(chǎn)生子囊孢子。Aoki等^［34］室內(nèi)雜交誘導(dǎo)培養(yǎng)18株假禾谷鐮孢菌，共153個雜交組合，其中只有7個組合產(chǎn)生成熟子囊和子囊孢子，說明其育性很低。本研究只有1株菌株能產(chǎn)生成熟子囊和子囊孢子，原因可能與假禾谷鐮孢菌雜交情況一致，P. nodorum育性水平低。

1966年首次于印度報道，Phaeosphaeria maydis能侵染玉米，引起暗球腔菌葉斑?。≒haeosphaeria leaf spot，PLS），形成分散、近圓形和橢圓形枯白色病斑^［35］。Carson等^［36］于2005年發(fā)現(xiàn)Phaeosphaeria maydis能在巴西、南非等熱帶玉米區(qū)侵染玉米引起玉米白斑?。∕aize white spot，MWS），導(dǎo)致葉片干枯、早衰，產(chǎn)量降低，造成超過60%的產(chǎn)量損失^［37］。另外，白斑病也導(dǎo)致美國玉米減產(chǎn)13%^［38］。2020年，在我國云南省、四川省等多地玉米種植區(qū)發(fā)現(xiàn)新型葉斑病，發(fā)病嚴(yán)重時病斑連片，葉片枯萎，與以往國外報道的暗球腔菌葉斑?。≒haeosphaeria leaf spot，PLS）田間癥狀相似^［35］。本研究通過離體接種和活體噴霧接種進(jìn)行致病性測定，接種結(jié)果顯示穎枯近殼多胞菌（Parastagonospora nodorum）能侵染青貯玉米，產(chǎn)生深褐色、橢圓形病斑，病斑周圍出現(xiàn)明顯黃色暈圈，發(fā)病嚴(yán)重時病斑連片，葉片萎蔫干枯死亡。該結(jié)果與上述報道中產(chǎn)生近圓形和橢圓形枯白色病斑存在一定差異，可能與病原菌地域差異和菌株個體差異有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究對青海省東部農(nóng)業(yè)區(qū)青貯玉米葉斑病病原菌進(jìn)行鑒定，采用組織分離法從病樣組織中分離獲得菌落形態(tài)一致的分離物，通過菌落形態(tài)學(xué)特征、致病性測定和多位點(diǎn)序列分析將獲得的40株菌株確定為穎枯近殼多胞菌（Parastagonospora nodorum），明確該病原菌有性生殖類型為同宗配合。菌株致病性測定結(jié)果表明，穎枯近殼多胞菌能侵染7個不同品種的青貯玉米，引起葉斑病。這是首次在青海省青貯玉米上分離得到穎枯近殼多胞菌，為穎枯近殼多胞菌葉斑病的準(zhǔn)確識別和防治提供了理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)意見。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）