收稿日期：2024-01-23；修回日期：2024-04-12

基金項(xiàng)目：草種創(chuàng)新及其在草地農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中的作用（2023-NK-147）資助

作者簡介：

吳瑞（1996-），女，漢族，青?；∪?，博士研究生，主要從事牧草育種與栽培研究，E-mail：wuruiqh@163.com；*通信作者：Author for correspondence，E-mail：qhliuwenhui@163.com

摘要：非生物脅迫在一定程度上制約了燕麥（Avena sativa L.）的生長和發(fā)育，其關(guān)鍵基因的克隆和表達(dá)分析可為提高植物逆境耐受性奠定理論基礎(chǔ)。本研究從燕麥葉片中克隆到AsGRAS36基因，該蛋白N端含有DELLA結(jié)構(gòu)域和TVHYNP結(jié)構(gòu)域，確定其屬于DELLA蛋白。蛋白理化性質(zhì)分析表明AsGRAS36編碼611個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為64.81 kD，理論等電點(diǎn)為4.97，為親水性蛋白，主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示AsGRAS36與大麥GRAS28和小麥GRAS115的親緣關(guān)系最近。順式作用元件分析揭示AsGRAS36基因啟動(dòng)子含有脫落酸和水楊酸等激素響應(yīng)元件和干旱、低溫等脅迫響應(yīng)元件。蛋白互作預(yù)測顯示與AsGRAS36互作的蛋白參與到植物的脅迫響應(yīng)過程?；虮磉_(dá)分析表明AsGRAS36在燕麥?zhǔn)艿椒巧锩{迫后迅速表達(dá)，對(duì)高溫、干旱等脅迫和激素誘導(dǎo)響應(yīng)敏感。該研究結(jié)果為AsGRAS36基因及DELLA蛋白在燕麥非生物脅迫調(diào)控中的作用提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：燕麥；DELLA蛋白；非生物脅迫；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S544.9""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）11-3371-12

Cloning and Expression Analysis of the AsGRAS36 Gene in Oat

WU Rui， LIU Wen-hui*， LIANG Guo-ling， LIU Kai-qiang， JU Ze-liang

（Key Laboratory of Superior Forage Germplasm in the Qinghai-Tibetan Plateau， Laboratory for Research and Utilization of

Qinghai Tibet Plateau Germplasm Resources， Academy of Animal Science and Veterinary Medicine of Qinghai University，

Xining， Qinghai Province 810016， China）

Abstract：Abiotic stress restricts the growth and development of oat to a certain extent. Cloning and expression analysis of oat key genes can lay a theoretical foundation for improving its stress resistance. In this study，we cloned the AsGRAS36 gene from oat，the N-terminal end of the AsGRAS36 protein contains DELLA and TVHYNP domains that belongs to the DELLA protein. The analysis of protein physicochemical properties showed that the AsGRAS36 encoded 611 amino acids，with a protein molecular weight of 64.81 kD and a theoretical isoelectric point of 4.97. It is a hydrophilic protein，which mainly consists of α-helix and random coil. Phylogenetic analysis suggested that the AsGRAS36 is the most closely related to GRAS28 in barley and GRAS115 in wheat. Cis-acting element analysis showed that the promoter region of the AsGRAS36 gene contains hormone response elements such as abscisic acid and salicylic acid，as well as stress response elements such as drought and low temperature. The results of protein-protein interaction prediction indicated that the main proteins that interacted with AsGRAS36 were involved in the stress response process in plants. Gene expression analysis showed that AsGRAS36 was rapidly increased after abiotic stress and responded sensitively to high temperature，drought and hormone stresses. The results of this study provide a scientific basis for the role of AsGRAS36 gene and DELLA protein in the regulation of abiotic stress in oat.

Key words：Avena sativa;DELLA protein;Abiotic stress;Expression analysis

植物可以在不同的環(huán)境條件下產(chǎn)生復(fù)雜的機(jī)制來響應(yīng)外界壓力，常見的外部壓力包括干旱、高溫、鹽堿化、低溫和洪澇等，這些非生物脅迫嚴(yán)重阻礙了植物的生長發(fā)育^［1］，因此了解植物對(duì)脅迫的信號(hào)傳遞和反應(yīng)機(jī)制對(duì)提高植物的逆境適應(yīng)能力至關(guān)重要。為適應(yīng)非生物脅迫，脫落酸（Abscisic acid，ABA）、水楊酸（Salicylic acid，SA）等脅迫激素和生長素（Auxin，IAA）、赤霉素（Gibberellins，GA3）、蕓苔素（Brassinolide，BR）等生長激素均參與到植物的脅迫反應(yīng)中，其中ABA作為最主要的脅迫激素參與各類滲透脅迫過程^［2-3］。植物激素相關(guān)基因參與到各類合成、代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路中，轉(zhuǎn)錄因子作為一類與基因序列上游特定位點(diǎn)結(jié)合的蛋白質(zhì)，通過改變基因表達(dá)來調(diào)控生物過程，在植物生長和響應(yīng)外界脅迫方面發(fā)揮著重要作用^［4-5］。GRAS蛋白家族是一類具有重要功能的基因家族，編碼一類重要植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，由于其N端含有與分子識(shí)別有關(guān)的內(nèi)在無序區(qū)域（IDG），使其表現(xiàn)出功能多樣性^［6-7］。包括參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路^［8-9］，調(diào)控植物生長發(fā)育^［10］和非生物脅迫應(yīng)答等^［11］。

DELLA蛋白是GRAS蛋白家族的重要成員，是GA3信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控因子，大量研究表明GRAS蛋白家族的DELLA蛋白在植物響應(yīng)逆境脅迫過程中發(fā)揮了重要作用，即通過GA3的調(diào)控調(diào)節(jié)植物對(duì)脅迫的耐受性^［12］。當(dāng)GA3含量較低時(shí)DELLA蛋白相對(duì)穩(wěn)定，反之DELLA蛋白發(fā)生降解。在脅迫條件下，GA3含量降低，從而確保了DELLA蛋白的穩(wěn)定和積累，提高植物對(duì)脅迫的耐受性^［13］。DELLA蛋白積累可減少鹽脅迫造成的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）損傷，誘導(dǎo)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和氧化物酶等的表達(dá)^［14］。在逆境脅迫下，DELLA蛋白也可通過改變根的形態(tài)及根毛的伸長來抑制ROS的積累^［15］。此外，研究表明擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）耐旱基因XERICO（RING-H2，really interesting new gene-H2）參與ABA代謝，且該基因?yàn)镈ELLA蛋白的下游目的基因^［16］。以上研究表明DELLA蛋白是GA3調(diào)控通路的阻遏物，并通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性來調(diào)控植物對(duì)逆境的耐受性。

青藏高原由于海拔高、光照時(shí)間長等獨(dú)特的地理特征，為燕麥的生長提供了理想的條件，使其成為燕麥的主產(chǎn)區(qū)和優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)。在栽培管理方面，燕麥生長周期短、種植方式靈活，適宜大面積推廣^［17-18］。在飼草方面，燕麥產(chǎn)量高，品質(zhì)好，粗纖維含量低，莖葉柔嫩，適口性好，是家畜的優(yōu)質(zhì)飼料^［19］。在適應(yīng)性方面，燕麥可在海拔4000 m的地區(qū)完成生育期，可在貧瘠的土壤中生長，具有較強(qiáng)的抗逆性，因此燕麥在緩解青藏高原草畜季節(jié)性供需矛盾和畜牧業(yè)發(fā)展中具有重要的意義^［20］。然而，青藏高原作為全球氣候變化的敏感區(qū)，其氣候變化劇烈，表現(xiàn)出區(qū)域和季節(jié)性降水不均衡現(xiàn)象，高溫、干旱事件頻率增加。加之該地區(qū)溫度低、生長季短，制約了燕麥的生長^［21］。因此，探究燕麥的抗逆機(jī)制，提高燕麥抗逆性是當(dāng)下需解決的重要問題。

基于本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)燕麥的干旱轉(zhuǎn)錄組分析和前人對(duì)鹽脅迫^［22］和高溫脅迫^［23］的研究，鑒定到1個(gè)差異表達(dá)的AsGRAS36基因（ID：AVESA.00001b.r3.4Ag0001267.4），該基因?qū)儆贒ELLA亞家族。本研究對(duì)該基因進(jìn)行基因克隆，分析蛋白結(jié)構(gòu)、順式作用元件、互作蛋白和亞細(xì)胞定位，同時(shí)對(duì)AsGRAS36在不同脅迫和激素誘導(dǎo)下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步驗(yàn)證AsGRAS36基因響應(yīng)非生物脅迫提供研究基礎(chǔ)，為加快燕麥抗逆品種的培育提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所選用的材料為燕麥品種‘青燕3號(hào)’，種子由青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院牧草種質(zhì)資源庫提供。選擇籽粒飽滿、大小一致的燕麥種子于智能溫室中種植，待幼苗長至三葉期時(shí)分別以100 μmol·L^-1BR，100 μmol·L^-1ABA，100 μmol·L^-1GA3，200 mmol·L^-1 NaCl，30% PEG-6000替換純水進(jìn)行澆灌，另一部分分別放置于33℃和4℃光照培養(yǎng)箱處理，對(duì)照正常澆水，于處理的0，1，3，6，12和24 h分別采集燕麥葉片，經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。

1.2 AsGRAS36基因克隆

采用Primer 6.0 設(shè)計(jì)AsGRAS36的引物，AsGRAS36-F：ATGAAGCGCGAGTACCAAGACGCCGGCGGGA，AsGRAS36-R：TCACGGCGCGGCCAGGCGCCAT。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA文庫為擴(kuò)增模板，反應(yīng)總體系50 μL，包括2×PCR緩沖液25 μL，2 mmol·L^-1 dNTPs 10 μL，Primer（F/R）1 μL，KODFx酶1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，68℃退火150 s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；68℃延伸5 min，4℃保存。目的條帶切膠后使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技有限公司，DP209-03）回收目的片段，經(jīng)檢測無誤后連接T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α。經(jīng)菌落PCR檢測后挑取陽性單克隆。上述陽性菌斑提取的質(zhì)粒由武漢艾迪晶生物科技有限公司進(jìn)行Sanger測序。

1.3 AsGRAS36基因生物信息學(xué)分析

AsGRAS36蛋白的理化性質(zhì)使用Expasy-ProtParam（https：//www.expasy.org/）在線網(wǎng)站預(yù)測；蛋白磷酸化位點(diǎn)使用NetPhos-3.1 server（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）進(jìn)行預(yù)測；TMHMM-2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線軟件用于跨膜域分析；SignalP-5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）用于信號(hào)肽分析；蛋白亞細(xì)胞定位使用Softberry（http：//www.softberry.com/berry.phtml）在線網(wǎng)站預(yù)測；AsGRAS36蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分別用SOPMA（https：//npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）在線網(wǎng)站和SWISS-MODEL（https：//www.sib.swiss/）在線網(wǎng)站預(yù)測。使用NCBI在線網(wǎng)站的Conserved Domains Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）功能進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。

1.4 AsGRAS36同源比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用NCBI的blastp功能進(jìn)行同源比對(duì)搜索，篩選E值為0且一致性大于50%的植物蛋白序列；使用DNAMAN9軟件進(jìn)行多序列比對(duì)；使用MEGA11的Maximum Likelihood（ML）法構(gòu)建同源序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，并使用EvolView網(wǎng)站（https：//evolgenius）對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行美化。

1.5 AsGRAS36順式作用元件分析

使用PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）對(duì)目標(biāo)基因上游2000 bp序列進(jìn)行篩選，確定啟動(dòng)子的順式元件。

1.6 AsGRAS36蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用在線軟件STRING12.0（https：//cn.string-db.org），以大麥（Hordeum vulgare L.）和小麥（Triticum aestivum L.）為參考物種，進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析。

1.7 AsGRAS36表達(dá)分析

使用SPARKeasy Plant RNA Kit新型植物RNA快速提取試劑盒（Sparkjade，中國山東）提取葉片總RNA，使用SPARKscript Ⅱ RT Plus Kit試劑盒（Sparkjade，中國山東）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。Primer Premier 6.0用于設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，AsGRAS36-RT-F：ATCGCCGTGAACTCAGTCTTCG，AsGRAS36-RT-R：AGGAACGAGCCGCTGTTGTG。內(nèi)參基因?yàn)閍ctin-F：GAGCGGGAA-ATTGTGAGGGA，actin-R：GAAGAGGACCTCA-GGGCAAC。根據(jù)2×SYBR Green qPCR Mix試劑盒在Light Cycle96熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為：1 μL cDNA，0.4 μL Forward Prime，0.4 μL Reverse Prime，10 μL 2×SYBR qPCR Mix，8.2 μL RNase Free H2O。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min；94℃變性10 s，55℃復(fù)性10 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。采用 2^-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，并用GraphPad Prism 8繪圖。

1.8 亞細(xì)胞定位

將煙草（Nicotiana tabacum L.）種子種植于培養(yǎng)箱內(nèi)，12 h光照培養(yǎng)3～4周。將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌（GV3101），30℃培養(yǎng)2 d后用接種環(huán)將農(nóng)桿菌從固體培養(yǎng)皿上刮下，接于含卡那霉素和利福平的1 mL LB液體培養(yǎng)基中，吹打均勻后搖床培養(yǎng) 1 h。然后5000 r·min^-1離心 5 min，去上清后用10 mmol·L^-1 MgC12（含120 μmol·L^-1 AS）懸浮液重懸菌體，調(diào)OD600至0.6左右，室溫靜置 3～4 h。挑選生長狀況良好的‘本氏煙草’植株，用去針頭的 1 mL注射器從煙草葉片下表皮注射菌液，并做好標(biāo)注。將注射完成的煙草植株弱光培養(yǎng) 2 d后用激光共聚焦顯微鏡（Nikon，A1 HD25）拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 AsGRAS36基因克隆與序列分析

以燕麥葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條約1836 bp的目的條帶（圖1）。菌液PCR檢測結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒已轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，表明已成功連接到克隆載體上。對(duì)陽性克隆進(jìn)行測序，測序結(jié)果與基因電子序列結(jié)果比對(duì)顯示二者相似度為100%，表明AsGRAS36基因克隆成功（圖2）。

利用在線網(wǎng)站expasy-protparam分析AsGRAS36的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)AsGRAS36的分子式為C2849H4442N796O891S22，編碼611個(gè)氨基酸，富含丙氨酸（Ala，13.3%）、甘氨酸（Gly，9.5%）、亮氨酸（Leu，9.2%）和絲氨酸（Ser，8.0%）等。蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為64.806 kD，理論等電點(diǎn)為4.97。該基因正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）為46，負(fù)電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）為73，原子總數(shù)為9000，脂肪系數(shù)77.07。不穩(wěn)定指數(shù)為51.09，表明其為不穩(wěn)定蛋白，Softberry在線軟件預(yù)測其定位于細(xì)胞核。

2.2 AsGRAS36蛋白信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測和親疏水性分析

通過NetPhos 3.1網(wǎng)站預(yù)測磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果表明AsGRAS36蛋白具有58個(gè)磷酸化位點(diǎn)。絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）位點(diǎn)分別有35個(gè)、19個(gè)和4個(gè)（圖3A）。利用TMHMM在線網(wǎng)站分析AsGRAS36的蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，顯示所有蛋白均在膜外，不存在跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于膜結(jié)合蛋白（圖3B）。利用在線網(wǎng)站SignalP預(yù)測AsGRAS36的信號(hào)肽發(fā)現(xiàn)該蛋白不存在信號(hào)肽（圖3C）。親水性平均系數(shù)為-0.182，為親水性蛋白（圖3D）。

2.3 AsGRAS36蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過NCBI數(shù)據(jù)庫中的Batch CD-Search在線分析網(wǎng)站獲得AsGRAS36的保守結(jié)構(gòu)域，明確該基因具有DELLA結(jié)構(gòu)，屬于GRAS基因家族，其保守結(jié)構(gòu)域位于228～607 位氨基酸之間（圖4A）。使用SOPMA在線網(wǎng)站預(yù)測AsGRAS36的二級(jí)結(jié)構(gòu)，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈4種形式組成，其中α-螺旋和無規(guī)則卷曲的占比高，分別為45.99%（281個(gè)氨基酸殘基）和36.99%（226個(gè)氨基酸殘基）。延伸鏈占10.47%（64個(gè)氨基酸殘基），β-折疊占6.55%（40個(gè)氨基酸殘基）。由此可見，AsGRAS36蛋白的結(jié)構(gòu)元件主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成（圖4B-C）。

利用swiss-model在線網(wǎng)站構(gòu)建燕麥AsGRAS36蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，全球性模型質(zhì)量估測（global model quality estimation，GMQE）得分對(duì)于該模型的預(yù)估值為0.73，表明該結(jié)果較好。該建模發(fā)現(xiàn)AsGRAS36與二穗短柄草I1GP39蛋白的相似度為92.75%，其三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成（圖4D）。

2.4 AsGRAS36蛋白序列分析和進(jìn)化樹分析

通過NCBI的blastp在線網(wǎng)站進(jìn)行AsGRAS36蛋白序列的同源比對(duì)，結(jié)果得到19個(gè)與AsGRAS36蛋白相似的其他物種同源性蛋白序列。以上蛋白與AsGRAS36蛋白的一致性在50.49%～87.42%之間，與大麥、小麥、玉米（Zea mays L.）、秈稻（Oryza sativa Indica Group kato.）和粳稻（Oryza sativa Japonica Group kato.）的一致性高，分別為87.42%，86.33%，84.26%，83.76%和83.60%。通過DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，AsGRAS36蛋白結(jié)構(gòu)域與其他植物結(jié)構(gòu)域相似度較高（圖5）。幾乎所有的蛋白N端均含有DELLA和TVHYNP結(jié)構(gòu)，中部包含有VHVID結(jié)構(gòu)域、核定位區(qū)域（NLS）、蘇氨酸富集區(qū)（Poly S/T/V）、LHRI和LHRII結(jié)構(gòu)域，C端含有RVER和SAW保守結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步分析AsGRAS36和以上19個(gè)蛋白的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA11軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖6）。結(jié)果顯示AsGRAS36蛋白與大麥和小麥蛋白處于同一分支，親緣關(guān)系近。系統(tǒng)進(jìn)化樹將這些物種的基因分為5個(gè)亞組，其中玉米和水稻分別被分為1個(gè)亞組；燕麥、大麥和小麥被分為1個(gè)亞組；擬南芥、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula Gaertn.）、棉花（Gossypium hirsutum L.）和番茄（Solanum lycopersicum L.）被分為1個(gè)亞組；其余5個(gè)物種的8個(gè)基因被分為1個(gè)亞組。

2.5 順式作用元件分析

利用PlantCARE對(duì)AsGRAS36啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行了預(yù)測分析，結(jié)果表明AsGRAS36啟動(dòng)子區(qū)域總共存在22個(gè)元件，包括激素響應(yīng)、脅迫響應(yīng)、光響應(yīng)和生長發(fā)育相關(guān)元件（表1）。與激素相關(guān)的元件包括脫落酸響應(yīng)元件3個(gè)，水楊酸響應(yīng)元件1個(gè)，茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）作用調(diào)控元件2個(gè)。與脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件包括參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)1個(gè)，參與低溫反應(yīng)的元件2個(gè)，參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件1個(gè)，參與厭氧誘導(dǎo)元件1個(gè)。此外，還存在1個(gè)參與胚乳表達(dá)的調(diào)控元件，參與光響應(yīng)的相關(guān)元件共計(jì)10個(gè)。

2.6 AsGRAS36蛋白互作分析

基于前期研究發(fā)現(xiàn)AsGRAS36與大麥和小麥的親緣關(guān)系最近，因此選擇大麥和小麥的同源蛋白進(jìn)行互作分析。以大麥為背景文件時(shí)預(yù)測結(jié)果表明，AsGRAS36與F2E7E0_HORVV（HORVU.MOREX.r3.4HG0336620.1）一致性最高（84.6%），與其互作的蛋白共計(jì)10個(gè)。分別為：赤霉素受體1個(gè)（A0A287FUX3），含bHLH結(jié)構(gòu)域的蛋白5個(gè)（A0A287ESA6，A0A287SA14，A0A287QCP0，M0VQ53_HORVV和M0Z576_HORVV），預(yù)測蛋白1個(gè)（F2CVJ7_HORVV），GRAS基因家族蛋白1個(gè)（A0A287L6Q8），以及1個(gè)未表征蛋白質(zhì)（圖7A）。以小麥為背景文件時(shí)預(yù)測結(jié)果表明，AsGRAS36與Rht-A1（TraesCS4A02 G271000.1）一致性最高（85%），與其互作的蛋白共計(jì)10個(gè)。包括3個(gè)GID1蛋白，3個(gè)含F(xiàn)-box結(jié)構(gòu)域的蛋白（A0A3B6EB36，A0A3B6EQQ6和A0A077RPU2）和4個(gè)含bHLH結(jié)構(gòu)域的蛋白（A0A3B6LST4，A0A3B5XWL7，A0A3B5ZQ70和A0A3B6KP05）（圖7B）。

2.7 AsGRAS36基因表達(dá)分析

為明確AsGRAS36的表達(dá)模式，本研究對(duì)三葉期燕麥分別進(jìn)行了4℃，33℃，PEG，ABA，BR，GA3和NaCl處理。結(jié)果顯示，AsGRAS36在燕麥葉片受到各脅迫和誘導(dǎo)處理后較對(duì)照基本都顯著上調(diào)表達(dá)。在4℃冷處理下，AsGRAS36表達(dá)量于處理1 h急劇升高，隨后下調(diào)。在33℃高溫、PEG脅迫和GA3誘導(dǎo)下，AsGRAS36表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢，且均在12 h達(dá)到峰值（圖8A-B）。ABA處理下，AsGRAS36在1，3和12 h快速上調(diào)表達(dá)。BR處理下，AsGRAS36的表達(dá)量在3 h達(dá)到峰值。在NaCl處理下，AsGRAS36表達(dá)量呈先降低后升高的趨勢，在處理24 h時(shí)表達(dá)量最高，12 h次之（圖8D-G）。表明AsGRAS36參與了不同的應(yīng)答過程，對(duì)激素、高溫、干旱等脅迫響應(yīng)敏感。

2.8 亞細(xì)胞定位

本研究將農(nóng)桿菌注射到煙草下表皮中，暗培養(yǎng)2 d后用激光共聚焦顯微鏡觀察AsGRAS36蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果，以空載作對(duì)照。結(jié)果表明空載體在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中均表達(dá)，而AsGRAS36蛋白主要在細(xì)胞核中有較強(qiáng)熒光信號(hào)，這與前期生信分析預(yù)測結(jié)果一致，最終確定AsGRAS36蛋白定位于細(xì)胞核中（圖9）。

3 討論

研究表明，DELLA蛋白序列N端具有DELLA和TVHYNP結(jié)構(gòu)域，其作用為接受GA信號(hào)和維持DELLA蛋白的穩(wěn)定^［24］。中部包括核定位區(qū)域（NLS）和S/T/V區(qū)域（富含絲氨酸，蘇氨酸和纈氨酸）等，C端包含VHIID結(jié)構(gòu)域、SH2、RVER和SAW保守結(jié)構(gòu)域^［25］。本研究從燕麥中克隆到一個(gè)差異表達(dá)基因AsGRAS36，經(jīng)過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其具有典型的GRAS結(jié)構(gòu)域，并且其N端含有DELLA蛋白特有的DELLA結(jié)構(gòu)域和TVHYNP結(jié)構(gòu)域，確定AsGRAS36屬于DELLA亞家族基因。擬南芥中DELLA蛋白包括GAI，RGA，RGL1，RGL2和RGL3，隨后越來越多的DELLA蛋白從不同植物中被克隆，如在水稻和小麥中分別克隆得到SLR1和Rht蛋白^［26-27］，本研究的AsGRAS36屬于Rht1蛋白。通過AsGRAS36與同源蛋白的進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白與大麥GRAS28和小麥GRAS115處于同一個(gè)分支，這兩個(gè)蛋白分別被注釋為SLN1和RHT-1，均屬于DELLA蛋白。大麥SLN1蛋白作為“綠色革命”矮化基因，被證明除調(diào)控株高外還增強(qiáng)了水澇脅迫耐受性，與缺氧脅迫相關(guān)，且在抗病性方面發(fā)揮了一定的作用^［28-29］。小麥矮稈基因Rht（矮桿基因，Reduced height-1）一方面調(diào)控了植株的半矮化，另一方面該基因可調(diào)節(jié)抗氧化防御系統(tǒng)和維持膜完整性，在植物水分調(diào)節(jié)和脅迫適應(yīng)中發(fā)揮了重要作用^［30-31］。因此燕麥Rht1基因可能與大麥SLN1基因和小麥Rht基因具有相似的功能，將在后續(xù)的研究中進(jìn)行驗(yàn)證。

順式作用元件是與結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)、能夠被基因調(diào)控蛋白特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，是調(diào)控基因表達(dá)的主要組分^［32］。AsGRAS36的順式作用元件分析表明該基因存在6個(gè)激素響應(yīng)元件（包括ABA、SA和MeJA），5個(gè)脅迫響應(yīng)相關(guān)元件（包括干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)、低溫響應(yīng)元件、防御和應(yīng)激元件以及厭氧誘導(dǎo)元件）和一些與光響應(yīng)相關(guān)的元件。研究表明，順式作用元件在植物抗逆過程中發(fā)揮了重要作用。如轉(zhuǎn)錄因子MYB15在葡萄中的抗逆性依賴于水楊酸調(diào)控元件（TCA）、脫落酸順式調(diào)控元件（ABRE）等^［33］。擬南芥αVPE（液泡加工酶）啟動(dòng)子區(qū)中由于存在ABRE，MBS，MYC和MYB等干旱相關(guān)順式元件，確定了αVPE在擬南芥干旱脅迫響應(yīng)中的作用^［34］。AsGRAS36啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)激素響應(yīng)元件和脅迫響應(yīng)元件，因此AsGRAS36可能也參與到燕麥的逆境脅迫過程。進(jìn)一步分析了AsGRAS36在燕麥不同脅迫處理下的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在脅迫處理下其表達(dá)量較對(duì)照顯著增加，不同處理時(shí)間也存在顯著差異。除鹽脅迫外，其余脅迫下AsGRAS36均響應(yīng)敏感。表明AsGRAS36參與到燕麥高溫、低溫和干旱脅迫過程，且可能受ABA，GA3和BR等激素的調(diào)控。

蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析有助于基因的功能預(yù)測，本研究以大麥和小麥為背景預(yù)測了AsGRAS36的互作蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與AsGRAS36互作的蛋白主要包括赤霉素受體GID1、含bHLH結(jié)構(gòu)域的蛋白和含F(xiàn)-box結(jié)構(gòu)域的蛋白。研究表明，GID1蛋白作為一種可溶性的赤霉素受體，可與活性GA結(jié)合誘發(fā)一系列下游反應(yīng)^［35］。擬南芥和水稻中GID1在GA存在的條件下可直接與DELLA蛋白相互作用，形成GID1-GA-DELLA復(fù)合體，在植物生長發(fā)育過程中具有重要功能^［36］。對(duì)水稻抗逆性的研究發(fā)現(xiàn)GID1通過ABA和GA信號(hào)通路在氣孔反應(yīng)和水分耐受性中發(fā)揮重要作用^［37］。含bHLH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)廣泛參與了植物激素合成、代謝和傳導(dǎo)過程^［38］，F(xiàn)-box蛋白同樣參與到植物激素信號(hào)傳導(dǎo)過程，由此影響植物的抗逆反應(yīng)^［39］。研究發(fā)現(xiàn)大部分F-box基因在植物抗逆過程中發(fā)揮了重要作用，它們與植物激素信號(hào)途徑相互作用，共同參與了抗旱、抗鹽堿和抗低溫等途徑^［40］。以上研究豐富了AsGRAS36調(diào)控逆境脅迫的證據(jù)，對(duì)揭示AsGRAS36的作用機(jī)制具有重要意義。

GRAS基因家族蛋白一部分定位于細(xì)胞核發(fā)揮作用，另一部分定位于細(xì)胞質(zhì)中與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成復(fù)合體而發(fā)揮作用，DELLA蛋白主要存在于細(xì)胞核中^［41-42］。本文研究表明燕麥AsGRAS36蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，前人關(guān)于GRAS蛋白家族的亞細(xì)胞定位研究表明水稻OsSCL7蛋白^［43］和楊樹（Populus L.）PeSCL7蛋白^［44］均定位于細(xì)胞核并顯示出轉(zhuǎn)錄活性，分別在植物抗病性和耐鹽耐旱方面發(fā)揮了作用。玉米原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明ZmGRAS31蛋白均定位于細(xì)胞核內(nèi)，且ZmGRAS31可能參與玉米非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)^［45］。AsGRAS36的亞細(xì)胞定位與以上研究一致，且能在煙草中正常表達(dá)，表明AsGRAS36在目的植物中可正常轉(zhuǎn)化表達(dá)，為研究該基因在燕麥非生物脅迫方面提供了參考依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究從燕麥成功克隆得到一個(gè)DELLA亞家族基因AsGRAS36，編碼區(qū)全長1836 bp，編碼611個(gè)氨基酸?；蛐蛄蟹治霰砻髟摰鞍譔端含有DELLA和TVHYNP結(jié)構(gòu)域，確定其屬于DELLA蛋白，定位于細(xì)胞核。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明其與大麥GRAS28和小麥GRAS115親緣關(guān)系最近。順式作用元件分析表明其存在多個(gè)激素和脅迫響應(yīng)元件。通過基因表達(dá)模式分析表明AsGRAS36對(duì)干旱、高溫和激素處理均有響應(yīng)，初步確定AsGRAS36參與了燕麥的干旱及高溫等脅迫應(yīng)答反應(yīng)。

參考文獻(xiàn)

［1］ YU Z P，DUAN X B，LUO L，et al. How plant hormones mediate salt stress responses［J］. Trends in Plant Science，2020，25（11）：1117-1130

［2］ 郝格格，孫忠富，張錄強(qiáng)，等. 脫落酸在植物逆境脅迫研究中的進(jìn)展［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（18）：212-215

［3］ WAADT R，SELLER C A，HSU P K，et al. Plant hormone regulation of abiotic stress responses［J］. Nature Reviews Molecular Cell Biology，2022，23（10）：680-694

［4］ JIN J F，WANG Z Q，HE Q Y，et al. Genome-wide identification and expression analysis of the NAC transcription factor family in tomato （Solanum lycopersicum） during aluminum stress［J］. BMC Genomics，2020，21：1-14

［5］ ZHENG X W，YI D X，SHAO L H，et al. In silico genome-wide identification，phylogeny and expression analysis of the R2R3-MYB gene family in Medicago truncatula［J］. Journal of Integrative Agriculture，2017，16（7）：1576-1591

［6］ SUN X，JONES W T，HARVEY D，et al. N-terminal domains of DELLA proteins are intrinsically unstructured in the absence of interaction with GID1/gibberellic acid receptors［J］. The Journal of Biological Chemistry，2010，285（15）：11557-11571

［7］ SUN X，JONES W T，HARVEY D，et al. A functionally required unfoldome from the plant kingdom：intrinsically disordered N-terminal domains of GRAS proteins are involved in molecular recognition during plant development［J］. Plant Molecular Biology，2011，77（3）：205-223

［8］ HOU X，LEE L Y C，XIA K，et al. DELLAs modulate jasmonate signaling via competitive binding to JAZs［J］. Developmental Cell，2010，19（6）：884-894

［9］ ZENTELLA R，ZHANG Z L，PARK M，et al. Global analysis of DELLA direct targets in early gibberellin signaling in Arabidopsis［J］. Plant Cell，2007，19（10）：3037-3057

［10］DHONDT S，COPPENS F，DE WINTER F，et al. SHORT-ROOT and SCARECROW regulate leaf growth in Arabidopsis by stimulating S-phase progression of the cell cycle［J］. Plant Physiology，2010，154（3）：1183-1195

［11］郭華軍，焦遠(yuǎn)年，邸超，等. 擬南芥轉(zhuǎn)錄因子GRAS家族基因群響應(yīng)滲透和干旱脅迫的初步探索［J］. 植物學(xué)報(bào)，2009，44（3）：290-299

［12］LI Y，YANG Y，HU Y，et al. DELLA and EDS1 form a feedback regulatory module to fine-tune plant growth-defense tradeoff in Arabidopsis［J］. Molecular plant，2019，12（11）：1485-1498

［13］ACHARD P，GENSCHIK P. Releasing the brakes of plant growth：how GAs shutdown DELLA proteins［J］. Journal of Experimental Botany，2009，60（4）：1085-1092

［14］ACHARD P，RENOU J P，BERTHOMé R，et al. Plant DELLAs restrain growth and promote survival of adversity by reducing the levels of reactive oxygen species［J］. Current Biology，2008，18（9）：656-660

［15］蔣夢婷，渠慎春. DELLA蛋白在植物生長發(fā)育中的作用［J］. 西北植物學(xué)報(bào)，2018，38（10）：192-200

［16］KO J H，YANG S H，HAN K H. Upregulation of an Arabidopsis RING-H2 gene，XERICO，confers drought tolerance through increased abscisic acid biosynthesis［J］. The Plant Journal，2006，47（3）：343-355

［17］高志昊. 飼用型燕麥種質(zhì)材料抗旱性評(píng)價(jià)與耐旱型品種篩選［D］. 銀川：寧夏大學(xué)，2022：1-2

［18］趙小娜，高志昊，王斌，等. 15份飼用型燕麥種質(zhì)材料苗期抗旱性比較與評(píng)價(jià)［J］. 草地學(xué)報(bào)，2023，31（12）：3734-43.

［19］景芳，南銘，劉彥明，等. 品種和種植密度對(duì)燕麥飼草產(chǎn)量、品質(zhì)和病害的影響［J］. 草地學(xué)報(bào)，2023，31（10）：3174-3184

［20］劉凱強(qiáng). 水分脅迫對(duì)燕麥生長發(fā)育及產(chǎn)量構(gòu)成的影響［D］.西寧：青海大學(xué)，2020：8-9

［21］任春燕，梁國玲，劉文輝，等. 青藏高原高寒地區(qū)早熟燕麥資源篩選和適應(yīng)性評(píng)價(jià)［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2023，32（9）：116-129

［22］WU B，HU Y，HUO P J，et al. Transcriptome analysis of hexaploid hulless oat in response to salinity stress［J］. Plos One，2017，12（2）：e0171451

［23］KO C S，LEE J S，SEO Y W. Various temperature effects on spikelet growth in hulless oat during grain-filling stage［J］. Agricultural and Food Science，2022，31（4）：282-296

［24］華楠. DELLA基因家族在被子植物中的起源與演化關(guān)系［D］. 吉首：吉首大學(xué)，2017：4-5.

［25］陳譚星. 桃GRAS家族成員的鑒定及DELLA亞族的功能分析［D］. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019：5

［26］HUSSAIN A，PENG J. DELLA proteins and GA signalling in Arabidopsis［J］. Journal of Plant Growth Regulation，2003，22：134-140

［27］DE VLEESSCHAUWER D，SEIFI H S，F(xiàn)ILIPE O，et al. The DELLA protein SLR1 integrates and amplifies salicylic acid-and jasmonic acid-dependent innate immunity in rice［J］. Plant Physiology，2016，170（3）：1831-1847

［28］SAVILLE R，GOSMAN N，BURT C，et al. The ‘Green Revolution’dwarfing genes play a role in disease resistance in Triticum aestivum and Hordeum vulgare［J］. Journal of Experimental Botany，2012，63（3）：1271-1283

［29］MORICONI J I，KOTULA L，SANTA-MARíA G E，et al. Root phenotypes of dwarf and “overgrowth” SLN1 barley mutants，and implications for hypoxic stress tolerance［J］. Journal of Plant Physiology，2019，234：60-70

［30］KOCHEVA K，NENOVA V，KARCEVA T，et al. Changes in water status，membrane stability and antioxidant capacity of wheat seedlings carrying different Rht-B1 dwarfing alleles under drought stress［J］. Journal of Agronomy and Crop Science，2014，200（2）：83-91

［31］VAN DE VELDE K，THOMAS S G，HEYSE F，et al. N-terminal truncated RHT-1 proteins generated by translational reinitiation cause semi-dwarfing of wheat Green Revolution alleles［J］. Molecular Plant，2021，14（4）：679-687

［32］WITTKOPP P J，KALAY G. Cis-regulatory elements：molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence［J］. Nature Reviews Genetics，2012，13（1）：59-69

［33］LI R X，ZHU F D，DUAN D. Function analysis and stress-mediated cis-element identification in the promoter region of VqMYB15［J］. Plant Signaling amp; Behavior，2020，15（7）：1773664

［34］TANG C N，WAN ABDULLAH W M A N，WEE C Y，et al. Promoter cis-element analyses reveal the function of αVPE in drought stress response of Arabidopsis［J］. Biology，2023，12（3）：430

［35］高秀華，傅向東. 赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)控植物生長發(fā)育的研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通報(bào)，2018，34（7）：1-13

［36］SHIMADA A，UEGUCHI-TANAKA M，NAKATSU T，et al. Structural basis for gibberellin recognition by its receptor GID1［J］. Nature，2008，456（7221）：520-523

［37］DU H，CHANG Y，HUANG F，et al. GID1 modulates stomatal response and submergence tolerance involving abscisic acid and gibberellic acid signaling in rice［J］. Journal of Integrative Plant Biology，2015，57（11）：954-968

［38］HAO Y Q，ZONG X M，REN P，et al. Basic Helix-Loop-Helix （bHLH） transcription factors regulate a wide range of functions in Arabidopsis［J］. International Journal of Molecular Sciences，2021，22（13）：7152

［39］STEFANOWICZ K，LANNOO N，VAN DAMME E J. Plant F-box proteins-judges between life and death［J］. Critical Reviews in Plant Sciences，2015，34（6）：523-552

［40］賈琪，孫松，孫天昊，等. F-box蛋白家族在植物抗逆響應(yīng)中的作用機(jī)制［J］. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，26（8）：1125-1136

［41］劉云輝，李珅，王洋，等. 藥用植物中GRAS轉(zhuǎn)錄因子的功能研究進(jìn)展［J］. 浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，36（6）：1233-1240

［42］白云赫，朱旭東，樊秀彩，等. 植物DELLA蛋白及其應(yīng)答赤霉素信號(hào)調(diào)控植物生長發(fā)育的研究進(jìn)展［J］. 分子植物育種，2019，17（8）：2509-2516

［43］LU L，DIAO Z J，YANG D W，et al. The 14-3-3 protein GF14c positively regulates immunity by modulating the protein homoeostasis of the GRAS protein OsSCL7 in rice［J］. Plant，Cell amp; Environment，2022，45（4）：1065-1081

［44］MA H S，LIANG D，SHUAI P，et al. The salt- and drought-inducible poplar GRAS protein SCL7 confers salt and drought tolerance in Arabidopsis thaliana［J］. Journal of Experimental Botany，2010，61（14）：4011-4019

［45］殷龍飛，王朝陽，吳忠義，等. 玉米ZmGRAS31基因的克隆及功能研究［J］. 作物學(xué)報(bào)，2019，45（7）：1029-1037

（責(zé)任編輯 付 宸）