收稿日期：2024-03-20；修回日期：2024-04-29

基金項目：內(nèi)蒙古自治區(qū)種業(yè)科技創(chuàng)新重大示范工程“揭榜掛帥”項目（2022 JBGS0014）；財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-34）資助

作者簡介：

樊璐（1997-），女，漢族，內(nèi)蒙古包頭人，碩士研究生，主要從事牧草種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用及植物抗逆基因挖掘研究，E-mail：f1915213249@163.com;*通信作者Author for correspondence，E-mail：zhaowei@haust.edu.cn；wangxuemin@caas.cn

摘要：為挖掘蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）抗旱相關(guān)基因并探究蒙古冰草響應(yīng)干旱脅迫分子機制，本研究以蒙古冰草為材料進行轉(zhuǎn)錄組測序。首先將不同生長期及干旱脅迫處理后的盆栽蒙古冰草組織按照根、莖、葉、花（穗）4類分別進行混樣并利用三代全長轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)建立蒙古冰草轉(zhuǎn)錄本參考序列數(shù)據(jù)庫，共獲得26 027條轉(zhuǎn)錄本，包含25 578個基因，利用BlastX在KEGG，KOG，Nr，Swissprot等數(shù)據(jù)庫中進行比對注釋，共有25 453個轉(zhuǎn)錄本得到注釋。其次利用二代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對干旱脅迫處理前后水培蒙古冰草幼苗進行測序，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫處理2 h，6 h后與處理前相比分別有2669個，3668個差異表達基因。此外，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組及熒光定量PCR驗證結(jié)果，發(fā)現(xiàn)基因ERF053，ERF055，NAC100，bZIP23，ERF5和NAM-B1在干旱處理后表達量較高且均上調(diào)可能是抗旱調(diào)控關(guān)鍵基因，為后續(xù)蒙古冰草抗旱相關(guān)候選基因克隆及功能驗證奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蒙古冰草；干旱；三代全長轉(zhuǎn)錄組；二代轉(zhuǎn)錄組測序；轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號：S543.9""" 文獻標(biāo)識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）11-3344-14

Screening Genes Related to Drought Resistance in Agropyron mongolicum

Keng Based on Transcriptome

FAN Lu^1，2， TANG Jun2， MA Lin2， ZHANG Zhi-peng2， JIANG Qing-xue2，

LIE Ren-cuo3， MA Qiao-ling3， WANG Xue-min^2*， ZHAO Wei^1*

（1.College of Agriculture， Henan University of Science and Technology， Luoyang， Henan Province 471000， China;

2.Institute of Animal Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China;

3.Qinghai Sanjiang Group Co.， LTD， Xining， Qinghai Province 810100， China）

Abstract：To dig drought-resistant genes and explore the molecular mechanism of Agropyron mongolicum Keng responding to drought stress，transcriptome analysis was carried out in this study using Agropyron mongolicum Keng as the material. In this study，the transcriptome sequencing was performed on Agropyron mongolicum Keng seedlings in pots during different growth periods and after drought stress treatment according to the four categories of roots，stems，leaves and flowers （spikes），and the reference sequence database of Agropyron mongolicum Keng was established by third-generation full-length transcriptome sequencing technology，which obtained a total of 26 027 transcripts，containing 25 578 genes. BlastX was used to compare the annotations in KEGG，KOG，Nr，Swissprot and other databases，using BlastX，25 453 transcripts were annotated. Secondly，the second-generation transcriptome sequencing technology was used to sequence the differentially expressed genes in hydroponically grown Agropyron mongolicum Keng seedlings before and after drought stress treatment，compared with before treatment，2669 and 3668 differentially expressed genes were detected after 2-hour and 6-hour drought stress treatment，respectively. In addition，based on transcriptome analysis and qRT-PCR validation results，the genes ERF053，ERF055，NAC100，bZIP23，ERF5，and NAM-B1 were found to have higher and up-regulated expression after drought treatment，which may be the key genes of drought regulation，and this lays a foundation for the subsequent cloning and functional validation of the drought-related candidate genes in Agropyron mongolicum Keng.

Key words：Agropyron mongolicum Keng;Drought;Third-generation full-length transcriptome sequencing;Second-generation transcriptome sequencing;Transcription factor

干旱是影響植物生長發(fā)育最重要的非生物脅迫之一，可導(dǎo)致植物水平衡被直接或間接破壞，最終萎蔫或枯死。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國干旱半干旱地區(qū)約占國土面積的48%^［1］，占總耕地面積的51%^［2］，培育耐旱作物是利用干旱、半干旱土地的有效方法之一^［3］。蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng），又稱沙蘆草，禾本科（Gramingae）冰草屬（Agropyron Gaertn）異花授粉二倍體（2n=2x=14，PP），具有耐旱、耐寒、適口性好等特點，是一種優(yōu)質(zhì)的多年生牧草。主要分布于我國陜西、寧夏、內(nèi)蒙古、新疆、甘肅和山西等地^［4-6］，常作為伴生成分在干草原和荒漠草原等典型沙質(zhì)環(huán)境中出現(xiàn)，具有重要的飼用價值、遺傳價值和生態(tài)價值。目前該物種已被列為國家二級重點保護野生植物，在我國北方草地畜牧業(yè)及生態(tài)環(huán)境建設(shè)中具有十分重要的作用。因此鑒定并了解蒙古冰草干旱耐受機制對保護生態(tài)環(huán)境、指導(dǎo)選育抗旱冰草品種具有現(xiàn)實意義^［7］。

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factors，TFs）是一種可與真核生物基因啟動子區(qū)域中順式作用元件特異結(jié)合的蛋白，是植物中最重要的一類調(diào)節(jié)基因。根據(jù)結(jié)合DNA結(jié)構(gòu)域的特點，將轉(zhuǎn)錄因子分為若干家族，如WRKY，AP2/EREBP，NAC，MYB，bZIP等^［8-12］。轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫響應(yīng)過程中起著關(guān)鍵作用，了解蒙古冰草響應(yīng)干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄因子對培育抗旱品種、改善生態(tài)環(huán)境具有重要意義^［13］。

轉(zhuǎn)錄組測序（RNA sequencing，RNA-Seq）是利用高通量測序平臺對cDNA進行測序的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域。通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，可以對植物響應(yīng)逆境脅迫所有轉(zhuǎn)錄本變化進行全面的分析，快速精準(zhǔn)地得到目的轉(zhuǎn)錄本序列及表達信息。因此，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)挖掘植物抗逆基因，明確植物對逆境脅迫的響應(yīng)機制是一種理想的研究手段^［2］。目前干旱、鹽害及旱鹽復(fù)合脅迫等非生物脅迫對植物影響的研究多集中在小麥（Triticum aestivum L.）、玉米（Zea mays L.）等大宗作物上^［14］，在牧草植物方面的研究相對較少，在蒙古冰草這一重要牧草資源非生物脅迫方面更是鮮有研究^［4］；對蒙古冰草抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究除了在WRKY，bHLH，NAC，ERF，MYB等轉(zhuǎn)錄因子方面已有進展，在其他轉(zhuǎn)錄因子方面尚無系統(tǒng)全面的介紹^［15-18］。

本研究通過三代全長轉(zhuǎn)錄組測序建立蒙古冰草轉(zhuǎn)錄本參考序列數(shù)據(jù)庫，并以此為參對蒙古冰草干旱處理前后轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行測定，從而完成對蒙古冰草響應(yīng)干旱脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的分析鑒定。通過對干旱脅迫處理下的水培蒙古冰草幼苗進行表型觀測、生理指標(biāo)測定、差異表達基因篩選、差異表達基因GO功能富集和KEGG代謝通路富集分析、熒光定量PCR驗證等篩選出蒙古冰草抗旱相關(guān)候選基因，從而為蒙古冰草抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的篩選及作用機制的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗供試材料為蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng），種子由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院趙彥教授惠贈。

1.2 種子萌發(fā)及培養(yǎng)

挑選籽粒飽滿、大小一致的蒙古冰草種子置于放有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于室內(nèi)培養(yǎng)箱（溫度24℃，濕度75%，光強110 μmol·m^-2·s^-1，光周期16 h）中進行水培生長，為后續(xù)培養(yǎng)三代全長轉(zhuǎn)錄組測序所需的盆栽苗及干旱脅迫處理、二代轉(zhuǎn)錄組測序所需的水培苗做準(zhǔn)備。

1.3 三代轉(zhuǎn)錄組測序及分析

待培養(yǎng)皿中種子萌發(fā)，選取長勢良好的蒙古冰草幼苗移栽入營養(yǎng)土蛭石比例為1∶1的土壤中進行盆栽培養(yǎng)，并將植株置于溫度22℃～25℃、濕度70%～80%、光周期16 h的人工智能溫室正常生長，并分別在植株幼苗期、成熟期、開花期、開花期結(jié)束等不同時期對同株蒙古冰草的根、莖、葉、花（穗）等不同部位進行取樣；待盆栽冰草整個生長期取樣結(jié)束，用20%的PEG-2000對整棵植株進行模擬干旱脅迫處理，并在干旱脅迫處理2 h，6 h后對植株不同部位進行取樣；將取下的樣品迅速置于液氮中，用研缽充分研磨成粉末，按照根、莖、葉、花（穗）4類將不同生長期及干旱脅迫處理后的樣品粉末進行混合并交由基迪奧生物科技有限公司進行RNA提取及質(zhì)檢，質(zhì)檢合格后，使用美國太平洋生物技術(shù)公司（Pacific Biosciences）Sequel測序系統(tǒng)對根、莖、葉、花（穗）4個樣本RNA混合后得到的總樣本進行第三代全長轉(zhuǎn)錄組測序。使用SMRT Link V8.0.0^［19］對Sequel2產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)進行分析，從下機后數(shù)據(jù)中提取出高質(zhì)量環(huán)型一致性序列（Circular consensus sequence，CCS）并進行引物、barcode、poly（A）和連環(huán)結(jié)構(gòu)的移除得到全長非嵌合序列（fulllength non-concatemer，F(xiàn)LNC reads），對相似的FLNC reads進行聚類合并，得到完整的isoform，從而得到樣本全長轉(zhuǎn)錄本，對得到的全長轉(zhuǎn)錄本進行基因功能注釋和結(jié)構(gòu)分析，從而建立蒙古冰草全長轉(zhuǎn)錄本參考序列數(shù)據(jù)庫。

1.4 干旱脅迫處理

選取培養(yǎng)皿中發(fā)芽時間一致的蒙古冰草幼苗移入已提前準(zhǔn)備好的96孔板中，將96孔板置于培養(yǎng)皿中用營養(yǎng)液進行水培并定期更換營養(yǎng)液，將培養(yǎng)皿置于溫度24℃、濕度75%、光強110 μmol·m^-2·s^-1、光周期16 h的室內(nèi)光照培養(yǎng)箱中正常生長，待幼苗生長至三葉一心期時用20%的PEG-2000對蒙古冰草幼苗進行模擬干旱脅迫處理，在干旱脅迫處理0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h，24 h，36 h，48 h，72 h后對葉片形態(tài)、顏色等表型進行觀察并取樣^［20］，根據(jù)表型最終用0 h，2 h，4 h，6 h四個時間點樣品進行生理指標(biāo)測定，0 h，2 h，6 h三個時間點樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.5 生理指標(biāo)測定

將干旱脅迫處理0 h，2 h，4 h，6 h取下的三葉一心期蒙古冰草葉片迅速置于液氮中用研缽充分研磨成粉末，按照每管0.1 g分裝于2 mL EP管中，使用索萊寶活性檢測試劑盒對干旱處理0 h（CK），2 h（D2），4 h（D4），6 h（D6）后樣品過氧化氫酶（Catalase，CAT）、脯氨酸（Proline，Pro）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、植物可溶性糖等生理指標(biāo)進行測定，每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，3個技術(shù)重復(fù)^［21］。

1.6 二代轉(zhuǎn)錄組測序RNA提取及cDNA文庫構(gòu)建

使用上海普洛麥格RNA提取試劑盒對干旱脅迫處理0 h（CK），2 h（D2），6 h（D6）3個時間點樣品進行總RNA提取，用瓊脂糖凝膠電泳法對RNA的完整性及是否受到DNA污染進行檢驗，將條帶邊界清晰完整沒有明顯彌散拖尾的RNA用干冰送往廣州基迪奧生物科技有限公司進行后續(xù)的文庫構(gòu)建及測序。通過帶有Oligo（dT）的磁珠富集具有poly（A）尾巴的真核mRNA后用超聲波將mRNA打斷；用隨機寡核苷酸做引物，在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中將片段化的mRNA模板反轉(zhuǎn)為cDNA第一條鏈，隨后用RNaseH對RNA鏈進行降解，并以dNTPs為原料在DNA polymerase I體系下合成cDNA第二條鏈；對純化后的雙鏈cDNA進行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，用AMPure XP beads篩選出200 bp左右的cDNA進行PCR擴增，并再次使用AMPure XP beads對PCR產(chǎn)物進行純化，最終得到cDNA文庫^［22］，完成Illumina Nova測序系統(tǒng)進行二代有參轉(zhuǎn)錄組測序所需文庫的構(gòu)建。

1.7 二代轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

使用fastp^［23］過濾掉下機后原始數(shù)據(jù)中含adapter、含N比例大于10%、全部都是A堿基、質(zhì)量值Q≤20的堿基數(shù)占整條read 50%以上的低質(zhì)量reads得到clean reads（原始數(shù)據(jù)已上傳至GSA公共數(shù)據(jù)庫https：//ngdc.cncb.ac.cn/gsa/，登錄號CRA016178）。以三代測序所得轉(zhuǎn)錄本（isoform）作為參考，用RSEM進行序列比對定量，統(tǒng)計每個樣本中基因檢測情況，將二代測序reads比對到isoform獲得各轉(zhuǎn)錄本豐度并在各大數(shù)據(jù)庫中進行比對得到基因注釋信息^［24］。

以｜log2（fc）｜＞1（fold change，fc），pvalue≤0.05，F(xiàn)DR≤0.05等為條件對差異表達基因進行篩選，對篩選到的差異表達基因進行GO功能富集及KEGG代謝通路富集分析^［25］，根據(jù)富集分析結(jié)果、基因在不同處理時間點均發(fā)生響應(yīng)、屬于TF家族、發(fā)生響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子家族中所含基因數(shù)量排名及其他物種中已有研究的干旱脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等對篩選出的差異表達基因進行綜合分析，初步篩選出蒙古冰草抗旱相關(guān)候選基因。

1.8 qRT-PCR驗證與候選基因篩選

在全長轉(zhuǎn)錄本參考序列數(shù)據(jù)庫中查詢出候選基因全部轉(zhuǎn)錄本的預(yù)測CDS序列并進行序列比對，根據(jù)比對結(jié)果，按照定量引物設(shè)計原則運用AlleleID 6.0進行引物設(shè)計，（見表1，表中僅對最終所選基因所用引物進行了展示），查詢文獻所用內(nèi)參，委托生工生物公司進行引物合成；使用諾唯贊公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR）對轉(zhuǎn)錄組測序返還樣品進行反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄所得cDNA稀釋至100 ng·μL^-1作為模板儲存于-20℃冰箱中備用；使用諾唯贊熒光定量試劑盒（Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix）進行預(yù)實驗，檢驗反轉(zhuǎn)模板及所設(shè)引物是否合格^［26］。

使用ABI Q7 Flex 384孔熒光定量PCR儀，以β-Actin為內(nèi)參，參照諾唯贊熒光定量試劑盒（Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix）說明書，按10 μL反應(yīng)體系進行熒光定量檢測，每個樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，3個技術(shù)重復(fù)。通過QuantStudio軟件根據(jù)擴增曲線、熔解曲線等對數(shù)據(jù)進行篩選，最終采用2^-ΔΔCt法對基因表達量進行計算并與測序結(jié)果進行對比完成對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠性的檢驗，并以表達量上調(diào)、差異倍數(shù)大于2為條件篩選出蒙古冰草抗旱相關(guān)候選基因^［27］。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2020對數(shù)據(jù)進行整理分析，運用SPSS 27.0對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析^［25］。使用GraphPad Prism 8制圖，在基迪奧生物信息云平臺（www.omicsmart.com）對差異表達基因進行GO功能富集、KEGG代謝途徑富集分析并繪圖^［28］。

2 結(jié)果與分析

2.1 三代全長轉(zhuǎn)錄組測序建立冰草參考基因組

2.1.1 三代全長轉(zhuǎn)錄組RNA樣品準(zhǔn)備及測序質(zhì)量評價 經(jīng)基迪奧生物公司對三代全長轉(zhuǎn)錄組樣品進行RNA提取及質(zhì)量檢測，發(fā)現(xiàn)三代全長轉(zhuǎn)錄組樣品RNA濃度及質(zhì)量達到公司A類等級標(biāo)準(zhǔn)（滿足建庫測序要求且總量滿足2次或2次以上建庫需要），可上機進行后續(xù)分析。選取轉(zhuǎn)錄本在零模波導(dǎo)孔（zero-mode waveguides，ZMW）中循環(huán)數(shù)（full passes）大于等于1的序列開展CCS分析獲得環(huán)型一致性序列（Circular consensus sequence，CCS）166 617條，通過Isoseq3.1軟件對獲得的高精確度CCS reads進行全長非嵌合序列（fulllength non-concatemer，F(xiàn)LNC reads）鑒定，用Minimap2對相似的FLNC reads進行聚類分析得到一致性序列（Unpolished Consensus Isoforms）并利用Quiver算法對一致性序列進行校正，最終根據(jù)輸出的序列準(zhǔn)確度分別得到高、低質(zhì)量序列31 607條和160條（高質(zhì)量序列預(yù)測準(zhǔn)確度≥0.99，低質(zhì)量序列預(yù)測準(zhǔn)確度lt;0.99），使用軟件cd-hit-v4.6.7對Reads聚類和校正之后得一致性序列進行去冗余，將相似度在99%以上的序列合并，最終得到26 027個轉(zhuǎn)錄本，總長度60 739 526 bp，其中最大的轉(zhuǎn)錄本序列長度為8281 bp，最小的轉(zhuǎn)錄本序列長度為136 bp，平均長度2333.71，N50為2594 bp，GC含量50.71%。

2.1.2 三代全長轉(zhuǎn)錄組基因功能注釋 利用BlastX將篩選后得到的26 027條非冗余轉(zhuǎn)錄本序列在KEGG，KOG，Nr，Swissprot等數(shù)據(jù)庫中進行比對注釋，共有25 453個轉(zhuǎn)錄本得到注釋，占總數(shù)的97.79%，其中在Nr數(shù)據(jù)庫得到注釋的轉(zhuǎn)錄本最多，有25 403個，占比達97.60%，在KEGG數(shù)據(jù)庫、SwissProt數(shù)據(jù)庫、KOG數(shù)據(jù)庫中各有25 157個、21 239個、16 963個轉(zhuǎn)錄本得到注釋，占比分別為96.66%，81.60%和65.17%。（見表2）

如圖1所示，在26 027個基因中，有16 231個轉(zhuǎn)錄本在KEGG，KOG，Nr，Swissprot四個數(shù)據(jù)庫中均被成功注釋，在所有被注釋的轉(zhuǎn)錄本中僅由Nr數(shù)據(jù)庫注釋成功的轉(zhuǎn)錄本有218個，僅由KEGG數(shù)據(jù)庫注釋成功的轉(zhuǎn)錄本有30個，僅由KOG數(shù)據(jù)庫注釋成功的轉(zhuǎn)錄本有3個，僅由Swissprot數(shù)據(jù)庫注釋成功的轉(zhuǎn)錄本有6個。

2.2 干旱脅迫處理及生理指標(biāo)測定

2.2.1 干旱脅迫處理下蒙古冰草幼苗表型 干旱脅迫會嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育，如圖2所示，在20%的PEG-2000溶液干旱脅迫處理下，試驗組與對照組相比，干旱脅迫處理開始幼苗葉片立刻發(fā)生萎蔫，2 h后幼苗葉片變軟下垂，2—24 h葉片逐漸變黃，24 h后葉片顏色明顯變暗，48 h后葉片顏色發(fā)灰且蜷縮變干，到72 h幼苗葉片變?yōu)橥耆捎矤顟B(tài)。

2.2.2 干旱脅迫處理下蒙古冰草幼苗生理指標(biāo)變化 干旱對植物的生長發(fā)育、生理代謝等多種生物過程具有不利影響，植物能夠通過預(yù)防、減少或修復(fù)損傷等生理功能來響應(yīng)干旱脅迫。干旱脅迫下，植物細(xì)胞原有的活性氧自由基清除系統(tǒng)動態(tài)平衡會被過度累積的活性氧自由基打破，進一步導(dǎo)致細(xì)胞膜過氧化、質(zhì)膜透性增加最終引起代謝紊亂甚至細(xì)胞死亡。CAT（過氧化氫酶）能夠有效清除H2O2，對于維持活性氧清除系統(tǒng)的動態(tài)平衡具有重要作用；SOD（超氧化物歧化酶）能催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用生成H2O2和O2，是一種重要的氧自由基清除劑；Pro（脯氨酸）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是植物抗旱性評價的重要指標(biāo)，植物抗旱性越強Pro積累量越高；POD（過氧化物酶）可通過催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物來消除過氧化氫和酚類、胺類毒性；MDA（丙二醛）由氧自由基作用于脂質(zhì)的不飽和脂肪酸生成的過氧化脂質(zhì)分解而來，通過MDA含量可衡量細(xì)胞膜氧化程度，MDA含量越高植物對干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng)越靈敏；糖類物質(zhì)是構(gòu)成植物體的重要組成成分之一，也是新陳代謝的主要原料和貯存物質(zhì)，可溶性糖在滲透調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用。如圖3所示，蒙古冰草幼苗經(jīng)20%的PEG-2000溶液模擬干旱脅迫處理0 h，2 h，4 h，6 h后，CAT，MDA呈先降后升趨勢，說明干旱脅迫處理2 h后蒙古冰草細(xì)胞膜已受到嚴(yán)重?fù)p傷，Pro基本保持不變，POD，SOD呈先升后降趨勢，植物可溶性糖呈先升后降再升的趨勢，說明一定程度內(nèi)的干旱脅迫與植物葉片的POD，SOD酶活性及植物可溶性糖含量呈正相關(guān)。

2.3 二代轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析

2.3.1 二代轉(zhuǎn)錄組RNA樣品準(zhǔn)備及測序質(zhì)量評價 對所提RNA進行質(zhì)檢，發(fā)現(xiàn)RNA質(zhì)量達到生物公司樣品判定標(biāo)準(zhǔn)A級，可進行后續(xù)分析。對干旱脅迫處理0 h（D0），2 h（D2），6 h（D6）后的蒙古冰草進行轉(zhuǎn)錄組測序，每個樣本設(shè)置3個重復(fù)，如表3所示，干旱脅迫處理后的9個樣本測序所得原始序列介于6 407 888 400 bp～7 907 353 800 bp之間，過濾后序列介于6 467 448 005 bp～7 812 040 531 bp之間，Q30介于91.45%～93.77%之間，GC含量在53.18%～53.75%之間，測序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。將各個樣品比對至參考基因，比對率均大于71.99%，表明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好、準(zhǔn)確性較高，可滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析的要求。

基于表達量信息開展主成分分析（Principal component analysis，PCA），計算樣品間皮爾斯（pearson）相關(guān)系數(shù)，再將這些相關(guān)系數(shù)以熱圖形式直觀展示出樣品間相關(guān)性，如圖4a，4b所示，不同處理時間下的3個樣本重復(fù)性及相關(guān)性均較好，后續(xù)分析可信度高；如圖4c所示，干旱處理2 h與處理前相比（CKvsD2），有1539個基因上調(diào)，1130個基因下調(diào)；干旱處理6 h與處理前相比（CKvsD6），有2213個基因上調(diào)，1455個基因下調(diào)。

2.3.2 差異表達基因GO，KEGG富集分析 對差異表達基因進行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因在GO功能注釋中被注釋在生物過程（Biological process，BP）、細(xì)胞成分（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular function，MF）3大類中，如圖5a所示，在BP中主要富集于細(xì)胞過程（Cellular process）、代謝過程（Metabolic process）、定位（Localization）、應(yīng)激反應(yīng)（Response to stimulus）、生物調(diào)節(jié)（Biological regulation）及生物過程調(diào)控（Regulation of biological process）等生物學(xué)過程中，在CC中主要富集于細(xì)胞解剖學(xué)完整性（Cellular anatomical entity）和含蛋白質(zhì)復(fù)合物（Protein-containing complex） 2個生物學(xué)過程中，在MF中主要富集于催化活性（Catalytic activity）、結(jié)合（Binding）和轉(zhuǎn)化活性（Transporter activity）3個生物學(xué)過程中；由圖5b，5c可知，差異表達基因顯著富集于對酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)（Response to acid chemical）、作用于糖基鍵的水解酶活性（Hydrolase activity，acting on glycosyl bonds）、對滲透脅迫的反應(yīng)（Response to osmotic stress）、水解氧糖基鍵化合物的水解酶活性（Hydrolase activity，hydrolyzing O-glycosyl compounds）、對含氧化合物的反應(yīng)（Response to oxygen-containing compound）、作用于單個供體并結(jié)合分子氧的氧化還原酶活性（Oxidoreductase activity，acting on single donors with incorporation of molecular oxygen）、對脫落酸的反應(yīng)（Response to abscisic acid）、對無機物的反應(yīng)（Response to inorganic substance）、谷氨酰胺族氨基酸生物合成過程（Glutamine family amino acid biosynthetic process）等與抗旱相關(guān)的代謝通路中。

如圖6a所示，根據(jù)KO注釋可將差異表達基因參與的KEGG代謝通路分為代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic information Processing）、環(huán)境信息處理（Environmental information Processing）、有機系統(tǒng)（Organismal Systems）和細(xì)胞過程（Cellular Processes）5大類，其中代謝類占比最高。在代謝類中，主要富集在全局概述地圖（Global and overview maps）、碳水化合物代謝（Carbohydrate Metabolism）、氨基酸代謝（Amino Acid Metabolism）、脂質(zhì)代謝（Lipid Metabolism）及其他次生代謝物合成途徑（Biosynthesis of other Secondary Metabolites）等通路中，其中全局概述地圖類占比最高；在遺傳信息處理類中主要富集于折疊分類和降解（Folding，sorting and degradation）、翻譯（Translation）、轉(zhuǎn)錄（Transcription）、復(fù)制和修復(fù)（Replication and repair）等途徑；在環(huán)境信息處理類中主要富集于信號傳導(dǎo)（Signal Transduction）和膜運輸（Membrane transport）途徑；在有機系統(tǒng)類和細(xì)胞過程類中，分別富集于環(huán)境適應(yīng)（Environmental adaptation）和運輸分解代謝（Transport and catabolism）2個代謝通路。如圖6b，6c所示，差異表達基因顯著富集于精氨酸與脯氨酸代謝（Arginine and proline metabolism）、淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）、內(nèi)吞作用（Endocytosis）、植物激素信號傳導(dǎo)（Plant hormone signal transduction）、α-亞麻酸代謝（alpha-Linolenic acid metabolism）、類胡蘿卜素生物合成（Carotenoid biosynthesis）、碳代謝（Carbon metabolism）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）與植物-病原體互作（Plant-pathogen interaction）等與抗旱相關(guān)的代謝通路。

2.4 干旱響應(yīng)關(guān)鍵基因篩選

以三代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參，利用二代有參轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對干旱脅迫處理前后的蒙古冰草進行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得25 578個基因，干旱脅迫處理2 h，6 h后與處理前相比分別有2669個、3668個差異表達基因，以｜log2（fc）｜＞1、pvalue≤0.05、FDR≤0.05、屬于TF家族等為條件對差異表達基因進行篩選，在CKvsD2中有109個轉(zhuǎn)錄本滿足條件，在CKvsD6中有120個轉(zhuǎn)錄本滿足條件，其中干旱脅迫處理2 h與6 h后同時發(fā)生響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子有73個；按照轉(zhuǎn)錄因子家族中所含基因數(shù)量進行排名，排名前四的分別是WRKY，NAC，ERF與bZIP四個家族；根據(jù)在不同處理時間點均發(fā)生響應(yīng)、發(fā)生響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子家族排名及其他物種中已有研究的干旱脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等最終篩選出19個（共44個轉(zhuǎn)錄本）基因進行qPCR驗證并完成進一步篩選。

2.5 候選基因的篩選與驗證

為檢驗RNA-Seq數(shù)據(jù)可靠性并對候選基因進行二次篩選，查詢相關(guān)文獻，選定GAPDH，G6PD，U6，ACTIN11，β-Actin，MwActin等文獻中所用內(nèi)參作為候選內(nèi)參^{［5-6，13，18］}，根據(jù)擴增曲線、熔解曲線等最終選定β-Actin作為內(nèi)參，如圖7所示（圖中僅對最終所選候選基因的驗證情況進行了展示），qRT-PCR驗證結(jié)果與RNA-Seq中差異基因變化趨勢大體一致，證明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠，部分組間的基因表達趨勢存在一定差異，可能是檢驗的基因表達水平較低或基因序列特征復(fù)雜等原因。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果、差異表達基因分析、差異表達基因富集分析結(jié)果及其他物種中已有研究的干旱脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等最終以實時熒光定量PCR檢驗結(jié)果中表達量上調(diào)且差異倍數(shù)gt;2為條件篩選出ERF053，ERF055，NAC100，bZIP23，ERF5，NAM-B1等基因可作為抗旱相關(guān)候選基因進行后續(xù)分析。

3 討論

作為影響植物生長發(fā)育的主要逆境因素之一，干旱對植物的生長發(fā)育、生理代謝、生殖發(fā)育等過程均有影響^［29-31］，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)植物受到干旱脅迫后會在生理生化和分子水平方面做出脅迫響應(yīng)來抵御逆境損傷，從而降低環(huán)境對自身的傷害^［32-33］，同時其基因表達模式和表達水平也會發(fā)生相應(yīng)的變化，通過轉(zhuǎn)錄組測序可快速全局的了解這種變化并篩選出抗旱相關(guān)基因，這為了解植物適應(yīng)干旱脅迫的分子機制奠定了基礎(chǔ)，同時也為研究植物適應(yīng)逆境脅迫提供了新的思路和方法^［25］。

近年來，隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在鑒定差異表達基因、篩選抗逆基因等領(lǐng)域被大量應(yīng)用^［34-35］。通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能夠量化基因表達，挖掘生物重要功能基因^［36］，目前二代測序已在挖掘模式植物擬南芥及非模式植物甘藍型油菜、蘿卜、白菜、擬南芥等干旱脅迫應(yīng)答基因中發(fā)揮重要作用^［26］。與二代測序相比，三代測序cDNA讀長更長，無需拼接即可直接獲取完整的全長轉(zhuǎn)錄本，得到的轉(zhuǎn)錄本質(zhì)量更高，獲得的長RNA序列更為準(zhǔn)確，更利于對mRNA結(jié)構(gòu)進行研究^［27］。以三代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參進行二代有參轉(zhuǎn)錄組測定，可極大提高逆境脅迫下應(yīng)答基因挖掘的準(zhǔn)確性。

轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對逆境脅迫過程中具有復(fù)雜的調(diào)控機制，可以通過在轉(zhuǎn)錄水平上激活或抑制基因表達來幫助植物應(yīng)對干旱等非生物脅迫^［37］。根據(jù)DNA結(jié)構(gòu)域的特點，轉(zhuǎn)錄因子可分為若干家族，如WRKY，AP2/EREBP，NAC，MYB，bZIP等，根據(jù)AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域的不同又分為AP2，RAV，DREB，ERF和Soloist五個亞族^［13］。不同的轉(zhuǎn)錄因子亞家族甚至同一亞家族的成員在植物應(yīng)對逆境脅迫過程中發(fā)揮著不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能^［38］，其中WRKY，ERF，NAC，MYB，bHLH，bZIP等是常見的調(diào)控植物生長發(fā)育和應(yīng)對逆境脅迫的轉(zhuǎn)錄因子家族。WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物應(yīng)對干旱、鹽漬等非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。多項研究表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控ABA信號通路來參與植物應(yīng)對干旱脅迫的分子機制。ERF轉(zhuǎn)錄因子是AP2/EREBP家族中最大的一類亞族，往往通過參與乙烯、脫落酸、茉莉酸和水楊酸等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控下游基因表達，從而提高植物的抗逆性。吳婧等基于蒙古冰草轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)篩選出41個ERF轉(zhuǎn)錄因子，對其中4個可能具有抗旱功能的ERF基因進行差異表達分析及qRT-PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)基因AmERF053，AmERF1B和AmERF4-1起正調(diào)控作用，AmERF4-2呈現(xiàn)負(fù)調(diào)控作用^［13］。NAC家族作為植物特有的、最大的TF家族之一，可以顯著提高植物逆境生存能力。范菠菠等^［15］從蒙古冰草轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中篩選鑒定出26個NAC轉(zhuǎn)錄因子，得到15個有完整結(jié)構(gòu)域的NAC蛋白，通過進化關(guān)系比對及保守基序、保守結(jié)構(gòu)域和NAC蛋白二、三級結(jié)構(gòu)分析，獲得2個抗旱相關(guān)的AmNAC100和AmNAC102-2基因，對其進行差異表達分析發(fā)現(xiàn)其在干旱脅迫中起正調(diào)控作用。bZIP轉(zhuǎn)錄因子是高等植物中功能較為復(fù)雜的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物響應(yīng)逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，Ma等對玉米中的ZmbZIP4進行研究，發(fā)現(xiàn)ZmbZIP4能夠通過增加側(cè)根數(shù)量、促進初生根生長來提高玉米對非生物脅迫的耐受性^［39］。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)作為鑒定差異表達基因、篩選抗逆基因的重要研究手段，不僅能夠幫助研究者快速全局的了解植物響應(yīng)逆境脅迫過程中的所有轉(zhuǎn)錄本變化，還能精準(zhǔn)地得到目的轉(zhuǎn)錄本序列及表達信息，進而快速準(zhǔn)確地篩選出響應(yīng)逆境脅迫相關(guān)基因。季香林等以高抗旱二倍體馬鈴薯A90為試驗材料，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對PEG-6000脅迫下不同時間的差異表達基因進行分析，發(fā)現(xiàn)53個基因注釋到RLKs，AP2/ERF和Tify等15個轉(zhuǎn)錄因子中^［40］。王瑋等以斧翅沙芥（Pugionium dolabratum）葉片為材料，采用Illumina HiSeq高通量測序技術(shù)鑒定到HSF，ERF，WRKY，MYB，bHLH等47個干旱誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子家族^［41］。翟永青等以蒙古冰草為材料，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對25% PEG-6000模擬干旱脅迫處理不同時間下的差異表達基因進行分析，篩選得到6個參與逆境脅迫的脫水素基因，干旱誘導(dǎo)脅迫下DN19347_c0_g7基因呈下調(diào)表達，起負(fù)調(diào)控作用；DN18948_c1_g4，DN14936_c0_g6，DN18948_c1_g1，DN27921_c1_ g1和DN23361_c0_g4在干旱誘導(dǎo)脅迫下呈上調(diào)表達，起正調(diào)控作用^［42］。本研究以蒙古冰草為材料，利用三代測序技術(shù)建立蒙古冰草轉(zhuǎn)錄本參考序列數(shù)據(jù)庫，共獲得26 027條轉(zhuǎn)錄本，以此為參進行二代有參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測定，發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫處理2 h與6 h后同時發(fā)生響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子有73個，其中所含基因數(shù)量排名前四的轉(zhuǎn)錄因子家族分別是WRKY，NAC，ERF與bZIP四個家族，結(jié)合差異表達基因富集分析結(jié)果及其他物種中已有研究的響應(yīng)干旱脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，最終以實時熒光定量PCR結(jié)果中表達量上調(diào)且差異倍數(shù)gt;2為條件篩選出ERF，NAC，bZIP等轉(zhuǎn)錄因子家族中的ERF053，ERF055，NAC100，bZIP23，ERF5，NAM-B1等基因可能是抗旱調(diào)控關(guān)鍵基因，可進一步進行基因克隆及功能驗證。

目前尚無蒙古冰草基因組信息公布，在轉(zhuǎn)錄組水平對蒙古冰草干旱脅迫分子響應(yīng)機制的研究也相對較少，可供參考的遺傳信息不足，這在一定程度上限制了蒙古冰草功能基因的挖掘。本研究以抗旱性優(yōu)良的蒙古冰草為材料，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對盆栽蒙古冰草完整生長期的各個組織、水培蒙古冰草干旱脅迫處理前后的葉片進行高通量測序，通過三代全長轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)建立蒙古冰草轉(zhuǎn)錄本參考序列數(shù)據(jù)庫，以三代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參進行二代有參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測定，結(jié)合二代三代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較轉(zhuǎn)錄組分析，篩選得到大量差異表達基因，根據(jù)差異表達基因富集分析結(jié)果、在干旱脅迫處理不同時間后均發(fā)生響應(yīng)、發(fā)生響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子家族所含基因數(shù)量排名及其他物種中已有研究的響應(yīng)干旱脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等，初步篩選出蒙古冰草干旱脅迫應(yīng)答基因并進行qPCR驗證，為后續(xù)篩選蒙古冰草抗旱相關(guān)候選基因、驗證蒙古冰草響應(yīng)干旱脅迫關(guān)鍵基因功能、解析蒙古冰草抗旱分子機制奠定基礎(chǔ)。下一步將對候選基因進行克隆，構(gòu)建基因過表達載體，將基因轉(zhuǎn)入模式植物，通過對干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株株高、根長、側(cè)根數(shù)等表型及生理指標(biāo)變化進行分析，在形態(tài)、生理、分子方面對植株進行抗旱性評價，進一步確定候選基因功能。

4 結(jié)論

本研究首先利用三代全長轉(zhuǎn)錄組測序建立蒙古冰草轉(zhuǎn)錄本參考序列數(shù)據(jù)庫，得到26 027條轉(zhuǎn)錄本，其中有25 453個轉(zhuǎn)錄本在KEGG，KOG，Nr，Swissprot等數(shù)據(jù)庫中得到注釋，有16 231條轉(zhuǎn)錄本在4個數(shù)據(jù)庫中均被成功注釋；以三代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參，對干旱處理下蒙古冰草幼苗進行二代轉(zhuǎn)錄組分析，得到25 578個基因，在CKvsD2、CKvsD6中分別獲得2669個、3668個差異表達基因；在GO功能富集分析中差異表達基因顯著富集于“對滲透脅迫的反應(yīng)”“對含氧化合物的反應(yīng)”“作用于單個供體并結(jié)合分子氧的氧化還原酶活性”以及“對脫落酸的反應(yīng)”等與抗旱相關(guān)的過程；在KEGG代謝通路富集分析中差異表達基因顯著富集于“精氨酸與脯氨酸代謝”“淀粉和蔗糖代謝”“植物激素信號傳導(dǎo)”“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工”以及“植物-病原體互作”等抗旱相關(guān)代謝通路；結(jié)合三代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，根據(jù)GO及KEGG富集分析結(jié)果、基因在干旱脅迫不同處理時間點均發(fā)生響應(yīng)、發(fā)生響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子家族排名、響應(yīng)干旱脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在其他物種中的研究及qPCR驗證結(jié)果等，最終篩選出ERF053，ERF055，NAC100，bZIP23，ERF5，NAM-B1等6個基因可能是蒙古冰草參與抗旱的關(guān)鍵基因。

參考文獻

［1］ 陳露，宋旭紅，王凱，等. 雀麥種子萌發(fā)期抗旱性評價［J］. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2010（6）：35-37

［2］ O'HARA S L. Irrigation and land degradation：implications for agriculture in Turkmenistan，central Asia［J］. Journal of Arid Environments，1997，37（1）：165-179

［3］ AHMED I M，DAI H，ZHENG W，et al. Genotypic differences in physiological characteristics in the tolerance to drought and salinity combined stress between Tibetan wild and cultivated barley［J］. Plant Physiology and Biochemistry，2013（63）：49-60

［4］ 周燕飛. 沙蘆草對旱鹽復(fù)合脅迫響應(yīng)及轉(zhuǎn)錄組分析［D］. 銀川：寧夏大學(xué)，2020：63

［5］ 趙彥，陳雪英，石鳳敏，等. 蒙古冰草MwDREB3基因的克隆及表達分析［J］. 草地學(xué)報，2015，23（2）：377-382

［6］ 陳燕福，范菠菠，趙彥，等. 蒙古冰草AmWRKY1-like基因克隆及表達分析［J］. 西北植物學(xué)報，2021，41（3）：386-391

［7］ 余淑艷，周燕飛，黃薇，等. 干旱、鹽及旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草光合和生理特性的影響［J］. 草地學(xué)報，2021，29（11）：2399-2406

［8］ 李科友，朱海蘭. 植物非生物逆境脅迫DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子的研究進展［J］. 林業(yè)科學(xué)，2011，47（1）：124-134

［9］ 劉坤，李國婧，楊杞. 參與植物非生物逆境響應(yīng)的DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子研究進展［J］. 生物技術(shù)通報，2022，38（5）：201-214

［10］柏星軒，閆雪，要宇晨，等. DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫中的作用及研究進展［J］. 生物學(xué)雜志，2017，34（4）：88-93

［11］張麒，陳靜，李俐，等. 植物AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的研究進展［J］. 生物技術(shù)通報，2018，34（8）：1-7

［12］悅曼芳，張春，吳忠義. 植物轉(zhuǎn)錄因子AP2/ERF家族蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究進展［J］. 生物技術(shù)通報，2022，32（12）：11-26

［13］吳婧，范菠菠，張學(xué)峰，等. 蒙古冰草ERF轉(zhuǎn)錄因子生物信息學(xué)及其表達及其分析［J］. 草地學(xué)報，2022，30（11）：2910-2921

［14］翁亞偉，張磊，張姍，等. 鹽旱復(fù)合脅迫對小麥幼苗生長和水分吸收的影響［J］. 生態(tài)學(xué)報，2017，37（7）：2244-2252

［15］范菠菠，張學(xué)峰，于卓，等. 與蒙古冰草抗旱相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子生物信息學(xué)及其表達分析［J］. 草地學(xué)報，2021，29（6）：1183-1192

［16］張學(xué)峰，馬艷紅，范菠菠，等. 基于RNA-Seq的蒙古冰草bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族分析［J］. 分子植物育種，2023，21（4）：1154-1163

［17］位志坤，許自成，賈國濤，等. bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族調(diào)控植物非生物逆境脅迫響應(yīng)的研究進展［J/OL］. 分子植物育種，http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20220615.0859.002.html，2022-06-15/2024-04-23

［18］王曉宇，劉秉毅，詹圓，等. 干旱脅迫下蒙農(nóng)雜種冰草RT-qPCR內(nèi)參基因的篩選［J］. 中國草地學(xué)報，2022，44（8）：1-8

［19］GORDON S P，TSENG E，SALAMOV A，et al. Widespread polycistronic transcripts in fungi revealed by single-molecule mRNA sequencing［J］. Plos One，2015，10（7）：e0132628

［20］王榮華，石雷，湯庚國，等. 鹽脅迫下蒙古冰草幼苗生長和離子含量的變化［J］. 植物研究，2004（3）：326-330

［21］卿晨，劉正學(xué)，李彥杰. 轉(zhuǎn)錄組測序分析干旱脅迫下復(fù)合微生物菌肥對玉米幼苗抗旱性的影響［J］. 作物雜志，http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.1808.S.20230727.1644.004.html，2023-07-27/2024-04-23

［22］吳璽，和秋蘭，王正維，等. 基于轉(zhuǎn)錄組測序?qū)Ω珊得{迫下馬鈴薯塊莖中淀粉和蔗糖代謝途徑相關(guān)基因的差異表達分析［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2023，42（1）：44-59

［23］CHEN S F，ZHOU Y Q，CHEN Y R，et al. Fastp：an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor［J］. Bioinformatics，2018，34（17）：884-890

［24］王祥，王育朋，安佳，等. 不同生長年限蒙古黃芪轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析及三萜皂苷合成關(guān)鍵基因挖掘［J］. 中草藥，2023，54（3）：915-925

［25］鄧小書，譚發(fā)銀，衛(wèi)秋陽，等. 基于轉(zhuǎn)錄組測序挖掘人工培養(yǎng)冬蟲夏草僵蟲顏色變化相關(guān)基因［J］. 食用菌學(xué)報，2023，30（1）：17-26

［26］馬薇，鄒麗媛，趙惠新，等. 基于轉(zhuǎn)錄組測序分析扭果花旗桿抗旱的主要代謝途徑［J］. 分子植物育種，2022，20（11）：3548-3561

［27］胡鑫，羅正英，李純佳，等. 基于二代和三代轉(zhuǎn)錄組測序揭示甘蔗重要親本對黑穗病菌侵染的響應(yīng)機制［J］. 作物學(xué)報，2023，49（9）：2412-2432

［28］張浩，胡海英，李惠霞，等. 荒漠草原優(yōu)勢植物牛枝子對干旱脅迫的生理響應(yīng)與轉(zhuǎn)錄組分析［J］. 草業(yè)學(xué)報，2023，32（7）：188-205

［29］張春榮，桑雪雨，渠萌，等. 基于轉(zhuǎn)錄組測序揭示適度干旱脅迫對甘草根基因表達的調(diào)控［J］. 中國中藥雜志，2015，40（24）：4817-4823

［30］KIM S. Antioxidant compounds for the inhibition of enzymatic browning by polyphenol oxidases in the fruiting body extract of the edible mushroom Hericium erinaceus［J］. Foods，2020，9（7）：951

［31］KHETTAL B，KADRI N，TIGHILET K，et al. Phenolic compounds from Citrus leaves：antioxidant activity and enzymatic browning inhibition［J］. Journal of Complementary and Integrative Medicine，2017，14（1）：20160030

［32］BOLGER A M，LOHSE M，USADEL B. Trimmomatic：a flexible trimmer for Illumina sequence data［J］. Bioinformatics，2014，30（15）：2114-2120

［33］KIM D，LANGMEAD B，SALZBERG S L. HISAT：a fast spliced aligner with low memory requirements［J］. Nature Methods，2015，12（4）：357-360

［34］LI X，WANG F，LIU Q，et al. Developmental transcriptomics of Chinese cordyceps reveals gene regulatory network and expression profiles of sexual development-related genes［J］. BMC Genomics，2019，20（1）：337

［35］ZHANG H，YUE P，TONG X X，et al. mRNA-seq and miRNA-seq profiling analyses reveal molecular mechanisms regulating induction of fruiting body in Ophiocordyceps sinensis［J］. Scientific Reports，2021，11（1）：12944

［36］孫曉琛，栗錦鵬，原靜靜，等. 基于轉(zhuǎn)錄組測序分析干旱脅迫對黨參不同組織基因表達的調(diào)控［J］. 中草藥，2022，53（14）：4465-4475

［37］尹麗興. 基于轉(zhuǎn)錄組測序和生化分析揭示鹽堿脅迫對玉米木質(zhì)素生物合成的影響［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2023，36（3）：454-464

［38］HE X，KANG Y，LI W Q，et al. Genome-wide identification and functional analysis of the TIFY gene family in the response to multiple stresses in Brassica napus L［J］. BMC Genomics，2020，21（1）：736

［39］MA H Z，LIU C，LI Z X，et al. ZmbZIP4 contributes to stress resistance in maize by regulating ABA synthesis and root development［J］. Plant Physiology，2018（178）：753-770

［40］季香林，張麗莉，甘珊，等. 高抗旱性二倍體馬鈴薯材料轉(zhuǎn)錄組分析及抗旱基因的初步挖掘［J］. 華北農(nóng)學(xué)報，2023，38（1）：63-73

［41］王瑋，王悅，厲萬榮，等. 基于轉(zhuǎn)錄組測序的斧翅沙芥（Pugionium dolabratum）干旱脅迫應(yīng)答基因表達分析［J］. 中國沙漠，2022，42 （6）：204-210

［42］翟永青，馬艷紅，范菠菠，等. 蒙古冰草脫水素基因生物信息學(xué)識別及表達分析［J］. 草地學(xué)報，2024，32（3）：684-692

（責(zé)任編輯 劉婷婷）