關(guān)鍵詞：“紫霞仙子”月季；藍(lán)紫色花色；轉(zhuǎn)錄組分析；類黃酮；花青素；類胡蘿卜素

中圖分類號(hào)：S685.12 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）11-0013-08

月季（Rosa hybrid）品種多、花色豐富且適應(yīng)性強(qiáng)，是世界切花最多的花卉種類?；ㄉ鳛樵录咀钪匾彩亲钍苋藗冴P(guān)注的經(jīng)濟(jì)性狀之一，主要受花瓣中的黃酮類和類胡蘿卜素類色素的種類及含量影響。黃酮類色素多數(shù)屬于水溶性色素，存在于液泡中，花朵的紅、粉、綠等主要受其影響；類胡蘿卜素類色素多數(shù)是脂溶性的，存在于質(zhì)體中，對(duì)花朵的橙色至黃色影響比較大?；ㄉ男纬墒芏喾N基因的影響及控制，其中，轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體R2R3MYB、WD40和bHLH等花青素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子以及MADS-box、NAC和AP2/ERF等類胡蘿卜素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控查爾酮合成酶基因（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶基因（CHI）、花青素3-糖基轉(zhuǎn)移酶基因（A3GT）、二氫黃酮醇還原酶基因（DFR）、類黃酮3-羥化酶基因（F3H）、類黃酮3′，5′-羥化酶基因（F3′5′H）、八氫番茄紅素合成酶基因（PSY）、八氫番茄紅素去飽和酶基因（PDS）、ζ-胡蘿卜素去飽和酶基因（ZDS）、紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶基因（VDE）、玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因（ZEP） 等結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平來調(diào)控花色。此外，色素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因還受到IncRNA和siRNA等轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的影響。因此，花色調(diào)控是通過一個(gè)非常復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行的。

藍(lán)色是花卉中比較少的花色，藍(lán)色花僅占花卉總量很小的比例，象征高貴，頗受人們青睞。薔薇屬缺少藍(lán)色色素合成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因F3′5′H，因此自然界缺少藍(lán)色玫瑰與月季品種。為滿足市場(chǎng)需求，近年來研究人員培育出“藍(lán)色海洋”、“紫霞仙子”等接近藍(lán)紫色的月季品種，具有較高觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也具有重要的研究?jī)r(jià)值。本研究選用藍(lán)紫色月季品種“紫霞仙子”（Rosa‘Nightingale’），在其花朵不同發(fā)育期采集花瓣樣品，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因篩選和富集分析，并挖掘類胡蘿卜素和類黃酮合成相關(guān)基因，篩選出引起其花色趨向藍(lán)色的關(guān)鍵基因，為月季種質(zhì)創(chuàng)新提供重要參考。

1材料與方法

1.1供試材料與設(shè)備

1.1.1植物材料 于5月中旬在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濟(jì)陽(yáng)試驗(yàn)示范基地挑選生長(zhǎng)狀況良好、沒有病蟲害的三年生“紫霞仙子”月季植株。根據(jù)花的不同發(fā)育階段，分別在花蕾期（N_S1）、初開期（N_S2）、半開期（N_S3）、盛開期（N_S4）和落花期（N_S5）5個(gè)時(shí)期采集花朵的第3～5輪花瓣，每個(gè)樣本中至少包含取自10朵不同花的花瓣，每個(gè)時(shí)期3個(gè)重復(fù)，共得到15個(gè)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣本。樣品采用液氮冷凍，送北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.1.2主要設(shè)備 冷凍高速離心機(jī)，-80℃超低溫冰箱，核酸定量?jī)x，全自動(dòng)凝膠圖像分析系統(tǒng)，水平電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司），PCR擴(kuò)增儀（伯樂T100），Eppendorf移液器（德國(guó)Eppendorf公司），全自動(dòng)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)（Agilent 2100 bio-analyzer），分光光度計(jì)NanoDrop ND-1000（美國(guó)NanoDrop公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 采用天根多糖多酚總RNA提取試劑盒從“紫霞仙子”月季花瓣樣品中提取總RNA，并使用Agilent 2100 bioanalyzer嚴(yán)格檢測(cè)RNA樣品的完整性，以RNA總量gt;0.4μg、RIN5.6為合格標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)檢合格后，把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量需求pooling后進(jìn)行Illu-mina測(cè)序。

1.2.2差異基因篩選及富集分析 差異分析分為3個(gè)主要階段：首先，對(duì)原始的readcount進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并對(duì)測(cè)序深度進(jìn)行校正。其次，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)模型計(jì)算假設(shè)檢驗(yàn)中的概率值（P-value）；進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正后，計(jì)算得到FDR值（FDR指的是錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率，P_adj是它的常見形式）。富集分析基于超幾何分布原理，其中差異基因集為差異顯著分析所得并注釋到GO（Gene Ontology）或KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)的基因集，而將所有參與差異顯著分析并注釋到GO或KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的差異基因集作為背景基因集。

1.2.3花色合成相關(guān)基因的挖掘 結(jié)合KEGG注釋和Blast方法，對(duì)“紫霞仙子”月季類黃酮、花青素和類胡蘿卜素合成通路上的功能基因進(jìn)行識(shí)別。從Phytozome網(wǎng)站（https：//phytozome. jgi.doe.gov/pz/portal.html）下載草莓、蘋果中已經(jīng)確定與類黃酮、花青素和類胡蘿卜素合成相關(guān)的蛋白序列，用其比對(duì)月季全基因組，通過NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的保守序列鑒定篩選月季基因。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)錄組分析

2.1.1轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估 對(duì)“紫霞仙子”月季花發(fā)育5個(gè)時(shí)期的15個(gè)樣品進(jìn)行Illumina測(cè)序，結(jié)果（表1）顯示，去除低質(zhì)量reads后，共獲得1634066710條、99.68Gb的有效數(shù)據(jù)；每個(gè)樣品的clean bases都在5.96Gb及以上，GC含量為45.55%～46.23%；Q30堿基所占百分比在92.75%及以上。以上數(shù)據(jù)證明本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量良好，結(jié)果可信。

2.1.2不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)基因分析 利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)“紫霞仙子”月季花不同發(fā)育時(shí)期進(jìn)行比較，在4個(gè)比較組中，N_S2 vs N_S1共找到793個(gè)差異基因，其中上調(diào)286個(gè)，下調(diào)507個(gè)；N_S3 vs N_S2差異基因最多，共找到3341個(gè)，其中上調(diào)1492個(gè)，下調(diào)1849個(gè)；N_S4 vs N_S3共找到980個(gè)差異基因，其中上調(diào)830個(gè)，下調(diào)150個(gè)；N_S5 vs N_S4共找到1038個(gè)差異基因，其中上調(diào)255個(gè)，下調(diào)783個(gè)（圖1A）。

用韋恩圖展示4組差異基因的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，可以看出在N_S2 vs N_S1、N_S3 vs N_S2、N_S4 vs N_S3、N_S5 vs N_S4組合中分別有516、2692、672、569個(gè)特異的差異基因（圖1B）。

聚類熱圖可以反映“紫霞仙子”月季各發(fā)育時(shí)期的差異基因表達(dá)情況。由圖2可見，花發(fā)育不同時(shí)期的基因表達(dá)存在明顯差異，但每個(gè)時(shí)期的生物學(xué)重復(fù)之間不存在顯著差異。“紫霞仙子”月季花基因的表達(dá)可分為4簇，Ⅰ簇在N_Sl和N_S2時(shí)期表達(dá)量較高；Ⅱ簇在N_S3時(shí)期表達(dá)量最高，N_S4與N_S5時(shí)期表達(dá)量較低；Ⅲ簇在不同時(shí)期均有表達(dá)，其中N_S4與N_S5時(shí)期表達(dá)量最高；Ⅳ簇在N_S4與N_S5時(shí)期表達(dá)量較高，在N_S3時(shí)期少量表達(dá)。整體而言，Ⅰ簇在花發(fā)育初期表達(dá)量較高，隨著花發(fā)育進(jìn)入半開期則維持在比較低的水平；Ⅱ簇在花發(fā)育的前中期表達(dá)量較高，而在花的發(fā)育進(jìn)入盛開期之后表達(dá)量急劇降低，在盛開期與落花期表達(dá)量極低；Ⅲ簇和Ⅳ簇主要表達(dá)于花發(fā)育后期，在花發(fā)育的前中期僅有少量表達(dá)。

2.2差異基因的GO富集分析

我們將在兩組樣品中的表達(dá)量差異達(dá)到兩倍以上且P_adjlt;0.05的基因確定為顯著差異表達(dá)基因，對(duì)其進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果如圖3所示。

從N_S1期到N_S2期，差異基因顯著性較低，未富集到顯著差異表達(dá)基因。

從N_S2期到N_S3期，共有750個(gè)差異基因可在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋，其中上調(diào)300個(gè)，下調(diào)450個(gè)。差異基因在生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）方面均有富集，BP方面參與最多的為碳水化合物代謝過程（carbohydrate metabolic process），共有88個(gè)差異基因；CC方面參與最多的為細(xì)胞壁（cell wall）、外部封裝結(jié)構(gòu)（ external encapsulating structure）、細(xì)胞外周（cell periphery）和胞外區(qū)（extracellular re-gion），差異基因數(shù)量分別為18、18、21個(gè)和10個(gè)：MF方面差異基因最多的為葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性（transferase activity， transferring glycosyl groups）、己糖轉(zhuǎn)移酶活性（transferase activity，transferring hexosyl groups）、血紅素結(jié)合（heme binding）和四吡咯結(jié)合（tetrapyrrole binding），差異基因數(shù)量分別為71、61、57個(gè)和57個(gè)。

從N_S3期到N_S4期，共有641個(gè)差異基因可在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋，其中上調(diào)608個(gè)，下調(diào)33個(gè)。該時(shí)期基因表達(dá)差異最為顯著，在BP、CC和MF方面均有富集。BP方面參與最多的為多有機(jī)體過程（multi-organism process）、細(xì)胞識(shí)別（cell recognition）、授粉（pollination）、花粉一雌蕊相互作用（ pollen-pistil interaction）、花粉識(shí)別（rec-ognition of pollen）和多細(xì)胞生物過程（multicellularorganismal process），差異基因數(shù)量分別為20、18、18、18個(gè)和18個(gè)；CC方面參與最多的為細(xì)胞外周，有9個(gè)差異基因；MF方面參與最多的為DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子活性（DNA binding transcriptionfactor activity）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活性（Transcription regulator activity）和作用于成對(duì)供體的氧化還原酶活性（oxidoreductase activit， acting on paired donors），差異基因數(shù)量分別為38、38個(gè)和29個(gè)。

從N_S4期到N_S5期，差異基因主要集中于MF方面，參與最多的為銅離子結(jié)合（copper ion binding），有10個(gè)差異基因。

2.3差異基因的KEGG通路富集分析

采用clusterProfile軟件對(duì)4個(gè)比較組（N_S2vs N_S1、N_S3 vs N_S2、N_S4 vs N_S3、N_S5 vsN_S4）的差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，用P_adjlt;0.05作為確定顯著性富集的閾值，結(jié)果見圖4。圖中展示了每個(gè)對(duì)比組顯著性最高的20個(gè)通路，橫坐標(biāo)表示注釋到KEGG通路的差異基因數(shù)與總差異基因數(shù)的比率，縱坐標(biāo)代表富集到的KEGG通路：點(diǎn)的大小表示注釋到KEGG通路的基因數(shù)大小，顏色由紅色到紫色代表了富集到的基因的顯著性由大到小。

在N_S1期到N_S2期，有202個(gè)基因可在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋，共富集到81條通路，其中顯著富集1條通路，即苯丙烷類生物合成通路（phenylpropanoid biosynthesis），共包含18個(gè)差異基因。

在N_S2期到N_S3期，共有1108個(gè)基因可在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋，共富集到115條通路，顯著富集12條通路。其中富集差異基因較多的是糖酵解／糖異生（glycolysis，gluconeogenesis）、植物MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway-plant）、苯丙烷類的生物合成和a-亞麻酸代謝（alpha-linolenic acid metabolism），分別含有29、26、25、23個(gè)差異基因。

在N_S3期到N_S4期之間，共有227個(gè)基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中得到了注釋，共富集到77條通路，有8條通路顯著富集，其中植物MAPK信號(hào)通路、苯丙烷類的生物合成以及倍半萜和三萜的生物合成（sesquiterpenoid and triterpenoid biosyn-thesis）通路是富集差異基因多的通路，分別含有12、11、10個(gè)差異基因。

在N_S4期到N_S5期，共254個(gè)基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中有注釋，共有88條通路被富集，5條通路顯著富集。其中苯丙烷類生物合成和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（plant hormone signal transduction）是富集差異基因最多的通路，分別包含14個(gè)和13個(gè)差異基因。

2.4類黃酮與花青素合成相關(guān)基因的挖掘與分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，類黃酮與花青素合成的相關(guān)基因中有15個(gè)基因在“紫霞仙子”月季花的不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)。其中，關(guān)鍵基因CHI、CHS、DFR、F3H、A3GT5隨著花的發(fā)育表達(dá)量先上升后下降，CHI、CHS、F3H在半開期達(dá)到峰值，而DFR、A3GT5在盛開期達(dá)到峰值；MYB轉(zhuǎn)錄因子基因MYB6和MYB113與上述基因表達(dá)趨勢(shì)相同，可能也對(duì)類黃酮及花青素的合成存在調(diào)控作用（圖5）。

2.5類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的挖掘與分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，類胡蘿卜素合成的相關(guān)基因中有14個(gè)在“紫霞仙子”月季花的不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)。其中，關(guān)鍵基因PSY2、PDS、ZDS、VDE和ZEP隨著花的發(fā)育表達(dá)量先上升后下降，PSY2、PDS、ZDS在初開期表達(dá)量達(dá)到峰值，VDE和ZEP則在半開期達(dá)到峰值（圖6）。

3討論與結(jié)論

本研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的方法，分析了“紫霞仙子”月季花不同發(fā)育時(shí)期影響花色變化的差異基因，結(jié)果表明，初開期到半開期的差異表達(dá)基因最多，共3341個(gè)：半開期到盛開期的差異基因最少，共980個(gè)。證明初開期到半開期是“紫霞仙子”月季花生理活動(dòng)最為活躍的時(shí)期。整個(gè)花發(fā)育過程中均與苯丙烷類的合成密切相關(guān)。從花蕾期到半開期，均與己糖轉(zhuǎn)移酶活性和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性的KEGG通路密切相關(guān)，證明糖代謝參與到“紫霞仙子”月季花的開放過程中。有研究表明糖的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝可促進(jìn)牡丹解除休眠和二次開花，這也可以佐證本研究在“紫霞仙子”月季中得到的結(jié)果。從初開期到盛開期，均與植物MAPK信號(hào)通路的KEGG通路密切相關(guān)。從盛開期到落花期，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的KEGG通路都與花的發(fā)育階段密切相關(guān)，證明在花發(fā)育后期植物激素發(fā)揮著重要作用。有研究表明茉莉酸、水楊酸和脫落酸可能協(xié)同調(diào)控杜鵑花的衰老過程，這也佐證了本研究結(jié)果。

在研究類黃酮與花青素合成通路的基因變化規(guī)律時(shí)，共找到15個(gè)基因在“紫霞仙子”月季花不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)，其中，CHI、CHS、F3H基因表達(dá)在半開期達(dá)到頂峰，證明半開期是“紫霞仙子”月季大量積累二氫黃酮醇的時(shí)期：而DFR作為合成無色矢車菊素、無色天竺葵素和無色飛燕草素的重要基因，A3GT5作為對(duì)花青素進(jìn)行糖基化修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶，二者的表達(dá)量均在盛開期達(dá)到頂峰，這一時(shí)期也是“紫霞仙子”月季花中花青素快速積累的時(shí)期。有研究表明MYB6與MYB113作為R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子，可以正向調(diào)控植物花中的花青素合成；本研究結(jié)果也表明MYB6與MYB113可能在“紫霞仙子”月季花發(fā)育過程中參與花青素合成的調(diào)控。

本研究在對(duì)類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的分析中找到了14個(gè)基因在“紫霞仙子”月季花不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)。其中，PS Y2、PDS、ZDS基因表達(dá)量在初開期達(dá)到峰值，隨后逐步下降，這可使植物積累的類胡蘿卜素減少。在某些橙色和黃色花卉中，類胡蘿卜素的表達(dá)量從花蕾期到落花期始終居高不下，如龍膽?！白舷枷勺印弊鳛樗{(lán)紫色月季花，其類胡蘿卜素合成基因從早期就開始下調(diào)，推測(cè)可能是通過減少類胡蘿卜素在體內(nèi)的積累降低黃色對(duì)藍(lán)紫色花色的干擾。而VDE和ZEP基因的表達(dá)量在半開期達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，可能是由于這兩個(gè)基因位于類胡蘿卜素合成通路的下游，存在一定的響應(yīng)延遲。

綜上所述，本研究通過“紫霞仙子”月季花發(fā)育不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組分析，找出了開花過程中類黃酮與花青素、類胡蘿卜素合成通路中的差異基因，探討了其花色形成機(jī)理，為日后月季的花色改造奠定了理論基礎(chǔ)。