亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        基于單分子納米孔測(cè)序技術(shù)揭示大白菜抽薹期全長轉(zhuǎn)錄組差異的復(fù)雜性

        2024-12-31 00:00:00王樹彬張志剛王榮花李巧云王立華胡新新趙智中劉栓桃
        山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2024年11期
        關(guān)鍵詞:大白菜

        關(guān)鍵詞:第三代高通量測(cè)序技術(shù);單分子納米孔測(cè)序技術(shù);大白菜;抽薹期;全長轉(zhuǎn)錄本

        中圖分類號(hào):S634.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A 文章編號(hào):1001-4942(2024)11-0001-12

        春白菜未熟抽薹是指短縮莖因?qū)Φ蜏孛舾袕亩ㄟ^春化在結(jié)球后過度伸長生長,致使葉球部分或全部喪失商品價(jià)值的現(xiàn)象,是困擾春白菜生產(chǎn)的主要難題。大白菜抽薹是多基因控制的數(shù)量性狀,且存在基因型與環(huán)境互作的復(fù)雜情況。擬南芥中,薹莖發(fā)育受6條開花途徑控制,包括受環(huán)境因子影響的春化途徑、光周期途徑、環(huán)境溫度途徑及受內(nèi)部因子調(diào)控的自主途徑、赤霉素途徑和年齡途徑,這6條途徑的上游基因相互獨(dú)立,但下游最終會(huì)作用于兩個(gè)關(guān)鍵整合因子FT和SOCl。春化途徑通過調(diào)控因子VRN1~5、VIL1~4、PRC 2、LHP1等協(xié)同作用感受低溫后,以表觀調(diào)控的方式使FLC(Flower Locus C)沉默,進(jìn)而解除對(duì)FT的抑制作用,其中長鏈非編碼RNA(IncRNA)也起到了關(guān)鍵作用:光周期途徑中,關(guān)鍵調(diào)控因子CO位于FT上游,其周期性變化受各種光受體和COP1/SPA-E3-泛素連接酶復(fù)合體的精細(xì)調(diào)控;在赤霉素途徑中,赤霉素合成與代謝以及由DELLA蛋白介導(dǎo)的赤霉素信號(hào)通路都會(huì)影響花芽分化和薹莖伸長。因此,植物的開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是由多基因參與、多條途徑控制的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。

        測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步和大白菜全基因組參考序列的公布,為利用組學(xué)技術(shù)從全基因組水平揭示大白菜晚抽薹的復(fù)雜分子機(jī)制提供了新的研究策略。目前,大白菜抽薹相關(guān)組學(xué)研究已取得了一些進(jìn)展,研究者們先后采用二代測(cè)序技術(shù)、甲基化測(cè)序揭示出大白菜在春化作用或者不同光周期處理下的轉(zhuǎn)錄組、甲基化和microRNA的差異。但前人研究所用的多是單一材料在可控條件下的轉(zhuǎn)錄組變化,而對(duì)于晚抽薹和早抽薹材料在接近自然生長條件下通過春化后的全長轉(zhuǎn)錄組差異分析鮮見報(bào)道。因此,本研究選擇大白菜晚抽薹材料06-247與早抽薹材料He102.采用單分子納米孔測(cè)序技術(shù)對(duì)兩者抽薹期帶葉片的花序軸進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,挖掘兩個(gè)材料抽薹期全長轉(zhuǎn)錄組的結(jié)構(gòu)變異和表達(dá)差異,并對(duì)兩者全長轉(zhuǎn)錄本之間存在的可變剪切(alternative splicing,AS)、可變多聚腺苷酸位點(diǎn)(alternative polyadenylation,APA)、長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,IncRNA)進(jìn)行分析,旨在為揭示大白菜晚抽薹分子機(jī)制提供新的線索。

        1材料與方法

        1.1供試材料與樣品采集

        所用試材為大白菜晚抽薹自交系06-247與早抽薹自交系He102,二者在抽薹性方面的差異主要表現(xiàn)為在相同條件下完成春化后抽薹期主花莖長度存在極顯著差異。材料種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所核心試驗(yàn)基地。2018年12月31日,將經(jīng)催芽后的兩材料單粒點(diǎn)播于含壤土:草炭:珍珠巖(1:1:1)的育苗缽(口徑8 cm)中,置于冬暖大棚中育苗并使其自然通過春化。冬暖大棚為雙層棚膜結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì),內(nèi)層棚膜外設(shè)有保溫被,當(dāng)夜間氣溫低于-3℃時(shí)覆蓋保溫被過夜,自然光照。2019年3月1日將幼苗轉(zhuǎn)移至紗網(wǎng)棚煉苗,3月10日移栽至紗網(wǎng)棚。小區(qū)設(shè)置為0.8 mx3.0m,雙行種植,行距40cm,株距30 cm,每小區(qū)18~20株,3次重復(fù)。3月30日,從每個(gè)小區(qū)至少10個(gè)生長正常的單株上采集帶葉片的主花序軸,在低溫下剪碎、混勻,用于總RNA的提取。

        1.2全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

        1.2.1總RNA提取及質(zhì)控 總RNA提取采用Trizol法,用RNase-free DNase I(Ambion,美國)處理總RNA以消除潛在的基因組DNA污染,用Bioanalyzer 2100(Agilent,美國)評(píng)估總RNA質(zhì)量,以RIN≥7且OD260nm/OD280nm值≥1.8為閾值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。自檢合格的RNA分成兩份,一份用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,一份用于qRT-PCR驗(yàn)證。

        1.2.2全長cDNA文庫構(gòu)建和測(cè)序 用于測(cè)序的3次生物學(xué)重復(fù)的總RNA樣本等量混勻,采用SMART技術(shù)構(gòu)建全長cDNA文庫(SMARTer@PCR cDNA Synthesis Kit,Cat No:634925,TaKaRa生物科技(美國)有限公司生產(chǎn)),得到的cDNA添加switch oligo后再合成互補(bǔ)鏈。對(duì)合成的DNA進(jìn)行損傷修復(fù)和末端修復(fù),再利用磁珠對(duì)cDNA進(jìn)行純化。最后委托北京百邁克生物科技有限公司對(duì)cDNA文庫進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序平臺(tái)為Nanopore PromethION48(Oxford Nano-pore Technologies,簡(jiǎn)稱ONT,英國),實(shí)驗(yàn)按照ONT公司提供的標(biāo)準(zhǔn)流程執(zhí)行。

        1.3全長轉(zhuǎn)錄本鑒定與注釋

        1.3.1原始讀段的初步處理 測(cè)序產(chǎn)生的原始下機(jī)序列稱為原始讀段(raw reads),用Min-KNOW2.2軟件包中的Guppy軟件進(jìn)行base call-ing,過濾掉Qlt;7、長度lt;500 bp的低質(zhì)量序列和核糖體RNA序列,得到有效讀段(clean reads),并根據(jù)序列兩端是否存在引物得到全長讀段( full-length reads)。用Minmap2軟件對(duì)全長讀段與大白菜參考基因組V3.0進(jìn)行比對(duì),再使用pin-fish軟件分析得到一致性序列(consensus se-quence)。用一致性序列進(jìn)行后續(xù)的所有分析。

        1.3.2全長轉(zhuǎn)錄本以及新基因的篩選 合并每個(gè)樣品的一致性序列,再次通過Minimap2與參考基因組進(jìn)行比對(duì),去除冗余序列,過濾掉identitylt;0.9、coveragelt;0.85的序列,僅合并5’端外顯子有差異的序列,最終獲得高質(zhì)量非冗余全長轉(zhuǎn)錄本序列( collapsed sequence)。將全長轉(zhuǎn)錄本與大白菜參考轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比對(duì),篩選出已知基因或已知基因的異構(gòu)體。對(duì)于不能比對(duì)到參考轉(zhuǎn)錄本中的全長序列,再采用TransDecoder(v3.0.0)軟件,基于開放閱讀框(open reading frame,ORF)長度、對(duì)數(shù)似然函數(shù)值(log-likelihood score)、氨基酸序列與Pfam數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域序列的比對(duì)等信息,從中識(shí)別可靠的潛在編碼區(qū)序列(coding se-quence,CDS),視為具有編碼潛能的新基因。

        1.3.3全長轉(zhuǎn)錄本的注釋 利用Blast工具將上述所有全長轉(zhuǎn)錄本在Pfam、KOG[24]、Swiss-Prot、NR、eggNOG、GO(Gene Ontolo-gy)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析,獲得相應(yīng)的注釋信息。

        1.4全長轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變異分析

        1.4.1可變剪切篩選 可變剪切(alternative spli-cing,AS)的類型主要包括外顯子互斥(mutually excluslve exons,MEE)、外顯子跳躍(skipping ex-on,SE)、內(nèi)含子保留(retained intron,RI)、可變5′剪切位點(diǎn)(alternative 5′splice-site,A5)、可變3′剪切位點(diǎn)(alternative 3′splice-site,A3)。通過Asta-lavista軟件獲取每個(gè)樣品的可變剪切類型,并對(duì)各種AS事件類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

        1.4.2可變多聚腺苷酸位點(diǎn)分析 按下列方法對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行可變多聚腺苷酸位點(diǎn)(alternative polyadenylation,APA)的篩選:比較冗余轉(zhuǎn)錄本的3′端非翻譯區(qū)序列(3′-UTR),根據(jù)3′-UTR是否完全一致判斷APA的數(shù)目。利用MEME比較冗余轉(zhuǎn)錄本polyA位點(diǎn)上游50 bp的序列,鑒別相應(yīng)的polyA信號(hào)(PAS)。

        1.5長鏈非編碼RNA預(yù)測(cè)

        通過對(duì)所得非冗余轉(zhuǎn)錄本的編碼潛能進(jìn)行分析,篩選出不編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄本,即長鏈非編碼RNA(IncRNA)。再用編碼潛能計(jì)算器(CodingPotential Calculato,簡(jiǎn)稱CPC)、編碼一非編碼指數(shù)分析工具(Coding-Non-Coding Inde,簡(jiǎn)稱CP-CI)、編碼潛能評(píng)估工具(Coding Potential As-sessment Tool,簡(jiǎn)稱CPAT)、蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)工具Pfam對(duì)IncRNA進(jìn)行分類,取4種方法的交集作為高質(zhì)量IncRNA。

        采用兩種方法對(duì)IncRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。方法①:基于IncRNA調(diào)控其鄰近基因的表達(dá),主要根據(jù)IncRNA與mRNA的位置關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè),定義染色體中每100kb范圍內(nèi)存在差異表達(dá)的IncRNA與差異表達(dá)的mRNA,得到順式作用(cis-acting)靶基因。方法②:lncRNA與mRNA由于堿基互補(bǔ)配對(duì)而發(fā)生作用,主要利用靶基因預(yù)測(cè)工具LncTar進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),得到反式調(diào)控靶基因。

        1.6轉(zhuǎn)錄本定量分析及與抽薹相關(guān)的差異基因篩選

        1.6.1轉(zhuǎn)錄本定量分析及差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本鑒定 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以模擬成一個(gè)隨機(jī)抽樣的過程,為了讓片段數(shù)目能真實(shí)地反映轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平,首先對(duì)樣品中Mapped Reads的數(shù)目進(jìn)行歸一化。采用CPM(counts per million) 作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo),CPM計(jì)算公式如下:

        CPM=N1/N2×1000000。

        其中,CPM表示CPM;N1表示reads mapped to tran-script,即比對(duì)到某一轉(zhuǎn)錄本上的reads數(shù)目;N2表示total reads aligned in sample,即比對(duì)到參考轉(zhuǎn)錄組的片段總數(shù)。

        對(duì)于沒有生物學(xué)重復(fù)的樣本,使用EBSeq進(jìn)行差異分析,參數(shù)設(shè)置FC≥2且FDRlt;0.01。FC(Fold Change)表示差異倍數(shù),即兩(組)樣品間表達(dá)量的比值。FDR是False Discovery Rate的簡(jiǎn)稱,是通過對(duì)差異顯著性P值(P-value)進(jìn)行校正得到的。

        1.6.2與抽薹有關(guān)的差異候選基因篩選 在差異表達(dá)基因集的GO注釋中,用“vernalization”、“photoperiod”、“gibberellins”和“gibberellic acid”為關(guān)鍵詞進(jìn)行基因條目的篩選,合并所有條目并去除重復(fù)項(xiàng),獲得與抽薹直接相關(guān)的差異候選基因。

        1.6.3差異候選基因qRT-PCR驗(yàn)證 總RNA的逆轉(zhuǎn)錄采用天根的Quant cDNA第一鏈合成試劑盒(KR103)進(jìn)行。qRT-PCR在Applied Biosys-tems QuantStudio 3型qPCR儀上進(jìn)行,采用天根RealUniversal彩色熒光定量預(yù)混試劑(SYBR Green,F(xiàn)P201)并按說明書操作,所用引物見表1。反應(yīng)總體積20μL,包含如下成分:2×RealUniver-sal PreMi×10μL,Primer F(10μmol·L-1)0.6μL,Primer R(10μmol.L-1) 0.6μL,0.1~100 ng cDNA模板,添加ddH2O至20μL。以葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因(G6PD)作為內(nèi)參基因,按照2-ΔΔCt)法計(jì)算特異基因相對(duì)表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)分析用SAS Version 9.0軟件進(jìn)行,依據(jù)Duncan’s multiple range test法計(jì)算0.05水平差異顯著性。

        2結(jié)果與分析

        2.1測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

        He102與06-247分別得到6962774條和5659251條原始讀段,總堿基數(shù)分別為82.02Gb和62.64 Gb;最大長度分別是11902bp和10407bp,居中長度(N50)分別為1329bp和1211bp,平均長度分別是1178bp和1106bp(表2)。He102與06-247的原始讀段長度大部分介于1kb~10kb,其中分布reads數(shù)最多的長度均為1kb(圖1A、B)。原始讀段的質(zhì)量(Q)值介于1~18之間,讀段的質(zhì)量值分布最多的是11(圖1C、D),平均質(zhì)量值為11(表2)。上述數(shù)據(jù)表明本次測(cè)序產(chǎn)生了高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。

        2.2全長轉(zhuǎn)錄本的鑒定

        He102與06-247測(cè)序產(chǎn)生的高質(zhì)量有效讀段(clean reads)分別是6 896 814條和5586307條,兩側(cè)都有引物序列的全長讀段(full-length reads)分別有6051557條和4844987條,去冗余后分別得到64228條和55123條一致性序列(consensus isoforms);過濾掉identitylt;0.9、cover-agelt;0.85的序列,合并僅5′端外顯子有差異的reads,兩者分別得到37309個(gè)和30415個(gè)高質(zhì)量非冗余全長轉(zhuǎn)錄本,其居中長度分別為1628bp和1537bp,平均長度分別為1413bp和1337bp,最大長度分別為7074bp和5642bp(表3)。

        2.3全長轉(zhuǎn)錄本序列的比對(duì)及新基因的數(shù)據(jù)庫注釋

        整合各樣品高質(zhì)量非冗余轉(zhuǎn)錄本,累計(jì)獲得46485個(gè)unigene,包括44797個(gè)已知基因和1688個(gè)新基因。經(jīng)過嚴(yán)格的序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)22971個(gè)已知基因的序列與參考轉(zhuǎn)錄組同源基因的序列之間存在多態(tài)性差異,它們是已知基因的異構(gòu)體(isoforms)。全部1688個(gè)新基因在GO、KEGG、COG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG或NR 8個(gè)數(shù)據(jù)庫中獲得注釋。

        2.4可變剪切分析

        從He102與06-247中分別鑒定出3571個(gè)和2065個(gè)AS事件,分別獨(dú)有2421個(gè)和993個(gè)AS事件,涉及的基因數(shù)目分別是1832個(gè)和819個(gè),He102獨(dú)有的AS基因數(shù)目是06-247的兩倍多。這些AS事件包括外顯子互斥、內(nèi)含子保留、外顯子跳躍、可變5′剪切位點(diǎn)和可變3′剪切位點(diǎn)共5種類型(表4)。其中,內(nèi)含子保留是最常見的可變剪切類型,分別占He102與06-247可變剪切的60.52%和57.58%;外顯子互斥則是比較罕見的可變剪切類型,在He102與06-247中分別鑒定出10個(gè)和4個(gè),占比均不足3%0(圖2)。2.5可變多聚腺苷酸位點(diǎn)分析

        在He102與06-247中分別有19636個(gè)和18 996個(gè)基因具有APA,APA數(shù)為1~29個(gè)不等,基因數(shù)與APA數(shù)統(tǒng)計(jì)如圖3所示。其中3 286個(gè)基因僅在He102中有APA現(xiàn)象,2646個(gè)基因僅在06- 247中有APA現(xiàn)象。雖然二者有16 350個(gè)相同基因發(fā)生了APA數(shù)的變化,但仍然有很多基因在兩者中存在APA數(shù)和polyA位置的差異。

        2.6 IncRNA的鑒定與分析

        IncRNA是不編碼蛋白的全長轉(zhuǎn)錄本,采用CPC、CNCI、CPAT和Pfam 4種方法分別鑒定出1358、554、1209條和453條IncRNA序列,4種方法的交集有453條高質(zhì)量IncRNA(圖4A),其中He102獨(dú)有81條,06-247獨(dú)有55條。80%以上的IncRNA屬于long intergemc non-coding RNA(lincRNA),來自基因間區(qū)(圖4B)。靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,451個(gè)IncRNA具有順式調(diào)控靶基因的潛能,97個(gè)具有反式調(diào)控潛能。

        2.7與開花相關(guān)的差異基因篩選

        隨機(jī)抽取不同數(shù)量的測(cè)序數(shù)據(jù)單獨(dú)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本定量分析,得到He102與06-247轉(zhuǎn)錄本的飽和度模擬檢驗(yàn)結(jié)果,如圖5所示,最終發(fā)現(xiàn)有29 062個(gè)基因符合定量比較的要求,這些基因的差異比較火山圖和MA圖如圖6A、B所示。在設(shè)定閾值條件下篩選到差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本5197個(gè),這些差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的聚類分析結(jié)果如圖6C所示,其中He102_vs_06-247上調(diào)的有2453個(gè),下調(diào)的有2744個(gè)。

        差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本中有GO注釋的4024個(gè),以“vernalization”、“photoperiod”、“gibberellins”和“gibberellic acid”為關(guān)鍵詞分別在GO注釋中篩選,累計(jì)獲得41個(gè)差異轉(zhuǎn)錄本,它們?cè)趦刹牧现械牟町愱P(guān)系以及NR注釋見表5。其中有DNA甲基化修飾酶、赤霉素受體GIDIA、赤霉素調(diào)控蛋白6和7、開花調(diào)控因子FRI-like蛋白、FLC異構(gòu)體、SOCl-like基因AGIA2和AGL72、FT以及BFT等多種與開花相關(guān)的基因。

        隨機(jī)選擇19個(gè)差異表達(dá)基因(12個(gè)下調(diào)、7個(gè)上調(diào))進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,檢測(cè)結(jié)果如表6所示??傆?jì)有16個(gè)基因(占84.21%)的調(diào)控趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致,其中10個(gè)基因的差異達(dá)到顯著水平(Plt;0.05)。雖然有3個(gè)基因的驗(yàn)證結(jié)果與測(cè)序結(jié)果不一致,但在兩個(gè)材料之間的差異均未達(dá)到顯著性水平(Pgt;0.05)。表明本研究篩選到的差異基因可信度較高,可以為后續(xù)研究提供可靠的參考。

        3討論

        晚抽薹是春白菜育種最重要的目標(biāo)之一。晚抽薹性是多基因控制的數(shù)量性狀,且受溫度、光照等環(huán)境因素影響大。近年來,隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步,基于二代測(cè)序技術(shù)的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究已經(jīng)用于晚抽薹和早抽薹大白菜材料之間的差異基因篩選,這為更全面闡釋大白菜晚抽薹分子機(jī)理提供了重要參考。但由于二代測(cè)序的讀段相對(duì)較短,通常僅有200~500 bp,而大白菜基因組在長期演化過程中經(jīng)歷了基因組的三倍化過程,有很多基因存在多拷貝現(xiàn)象,二代測(cè)序技術(shù)的短讀段無疑不能區(qū)分來自同源基因的同源片段,這使得比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)產(chǎn)生的差異基因信息存在先天的系統(tǒng)誤差。納米孔測(cè)序技術(shù)是第三代測(cè)序技術(shù),它的最大優(yōu)點(diǎn)是可以使超長堿基構(gòu)成的DNA鏈在一個(gè)單通道中就能夠被解碼和識(shí)別,而不需要將長鏈分割成小的短鏈,因而可以對(duì)全長轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序,對(duì)于區(qū)別同源基因、識(shí)別新基因、篩選可變剪切等基因結(jié)構(gòu)變異有更大的優(yōu)勢(shì)。但國內(nèi)外尚未見采用納米孔測(cè)序技術(shù)分析晚抽薹和早抽薹大白菜材料的帶葉片花序軸全長轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)報(bào)道。因此,本研究基于納米孔測(cè)序技術(shù),對(duì)大白菜晚抽薹材料06-247與早抽薹材料He102春化完成后的帶葉片的花序軸進(jìn)行了全長轉(zhuǎn)錄組分析,所得結(jié)果與二代測(cè)序的結(jié)果可以互相印證,互為補(bǔ)充,將對(duì)闡釋大白菜晚抽薹分子機(jī)理提供重要參考。

        本研究通過納米孔測(cè)序技術(shù)對(duì)單個(gè)文庫的數(shù)據(jù)產(chǎn)出分別是82.02 Gb(He102)和62.64 Gb(06-247),是前人二代測(cè)序單個(gè)文庫數(shù)據(jù)產(chǎn)出(6 Gb或8.81Gb)的7.1~13.7倍,成為轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)分析、新轉(zhuǎn)錄本/基因篩選以及定量比較的基礎(chǔ)。另外,本研究對(duì)新轉(zhuǎn)錄本的篩選質(zhì)控嚴(yán)格,僅保留identity≥0.9、coverage≥0.85且5′端外顯子有差異的序列,以確保獲得高質(zhì)量全長新轉(zhuǎn)錄本序列,最終從He102與06-247中分別獲得37309個(gè)和30415個(gè)高質(zhì)量全長轉(zhuǎn)錄本。將兩材料的全長轉(zhuǎn)錄本序列合并,累計(jì)獲得44797個(gè)已知基因和1688個(gè)新基因,這一結(jié)果與Dai等采用二代測(cè)序技術(shù)獲得的數(shù)據(jù)(分別是44799個(gè)和2280個(gè))相當(dāng)。進(jìn)一步進(jìn)行嚴(yán)格的序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)在44797個(gè)已知基因中有22971個(gè)是參考轉(zhuǎn)錄組同源基因的異構(gòu)體,這些大量存在的異構(gòu)體基因(即等位基因的多樣性)從分子水平為種質(zhì)資源多樣性提供了有力證據(jù),而關(guān)于大白菜抽薹期同源基因異構(gòu)體的挖掘尚未見報(bào)道。

        在比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中,為了得到可靠的結(jié)果,常設(shè)生物學(xué)重復(fù)。如Dai等在晚抽薹材料JWW和早抽薹材料XBJ不同春化處理時(shí)期的葉片的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中,每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù),發(fā)現(xiàn)JWW在春化處理5個(gè)階段均存在表達(dá)差異的基因有2 245個(gè),而XBJ中有3278個(gè),但并沒有比較兩個(gè)材料之間的差異表達(dá)基因。Wei等以花原基為試材,同樣設(shè)3次重復(fù),將晚抽薹DH系“Y410-1”與早抽薹菜芯DH系“CX14-1”以及晚抽薹DH系“SY2004”與早抽薹菜芯DH系“CX14-1”進(jìn)行比較,分別獲得12932個(gè)和12711個(gè)差異表達(dá)的基因。上述如此龐大的差異基因?qū)罄m(xù)選擇候選基因以及深入闡釋大白菜耐抽薹分子機(jī)制造成一定困難??紤]到一個(gè)物種特定時(shí)期表達(dá)的基因數(shù)目是有限的,隨著測(cè)序量的增加,檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目會(huì)趨于飽和,而且全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的成本也很高,因此本研究舍棄了生物學(xué)重復(fù)。但是表達(dá)量越高,轉(zhuǎn)錄本越容易被檢測(cè)定量,對(duì)于表達(dá)量低的轉(zhuǎn)錄本,則需要更大的數(shù)據(jù)量才能被準(zhǔn)確定量。基于此,本研究采用大的數(shù)據(jù)產(chǎn)出來彌補(bǔ)不設(shè)重復(fù)的缺陷,并隨機(jī)抽取轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了飽和度檢測(cè),僅僅選擇飽和度檢驗(yàn)合格的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量比較,以使得定量分析結(jié)果更加可靠。經(jīng)檢驗(yàn),最終有29062個(gè)基因符合定量比較的要求,在設(shè)定的閾值條件下篩選到5197個(gè)差異表達(dá)基因。這一數(shù)據(jù)比Dai等的報(bào)道結(jié)果略多但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Wei等的結(jié)果。由于兩個(gè)大白菜材料的背景差異比較大,這些差異基因未必都與晚抽薹性有關(guān),鑒于春化、光周期、赤霉素等是影響大白菜抽薹性比較重要的因素,我們?cè)诓町惢蛑羞M(jìn)一步篩選GO注釋中含有關(guān)鍵詞“vernalization”、“photoperiod”、“gibberellins”或“gibberellic acid”的基因,累計(jì)得到41個(gè)與抽薹直接相關(guān)的差異基因,其中有與DNA表觀修飾有關(guān)的DNA(cytosine-5)-methyltransferase DRM2,有與赤霉素信號(hào)有關(guān)的赤霉素受體GIDIA和赤霉素調(diào)控蛋白,有調(diào)控開花的轉(zhuǎn)錄因子FRI-like蛋白、FLC異構(gòu)體、SOCl-like基因AGIA2和AGL72、FT以及BFT等。眾所周知,F(xiàn)LC是春化途徑的重要調(diào)控因子,F(xiàn)T、CONSTANS等是光周期途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子,DNA甲基化在春化介導(dǎo)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控方面發(fā)揮重要調(diào)控作用。因此,這些候選基因可為深入解析大白菜耐抽薹分子機(jī)制提供功能基因。qRT-PCR結(jié)果表明,將近85%的差異表達(dá)基因的表達(dá)趨勢(shì)與驗(yàn)證結(jié)果相一致,這進(jìn)一步增加了候選基因的可信度。

        另外,本研究還發(fā)現(xiàn)了大量He102與06-247獨(dú)有的AS、APA及IncRNA,而已有研究證明開花調(diào)控因子FLC的表達(dá)受IncRNA的調(diào)控,因此不排除與春化相關(guān)的基因可能也存在AS和APA方面的差異。本研究獲得的大白菜不同耐抽薹性自交系抽薹期轉(zhuǎn)錄組在結(jié)構(gòu)方面的差異將為揭示大白菜晚抽薹的分子機(jī)制提供新的參考。

        4結(jié)論

        大白菜的抽薹性是多基因控制的數(shù)量性狀,本研究采用單分子納米孔測(cè)序技術(shù)對(duì)晚抽薹材料06-247與早抽薹材料He102抽薹期花莖組織進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析,獲得了1688個(gè)新基因,對(duì)新的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了數(shù)據(jù)庫注釋。篩選得到5197個(gè)差異表達(dá)基因,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步以關(guān)鍵詞篩選的方法挖掘出了41個(gè)與抽薹密切相關(guān)的差異基因,部分差異基因經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證準(zhǔn)確可靠,這為下一步選擇功能基因研究兩個(gè)材料抽薹性差異的分子機(jī)制提供了信息。同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn)兩個(gè)材料的轉(zhuǎn)錄本在AS、APA、IncRNA等方面存在廣泛的變異,這些變異可能對(duì)大白菜抽薹性具有一定影響。綜上,全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示出大白菜抽薹期轉(zhuǎn)錄組存在多方面的復(fù)雜差異,這些結(jié)果可為進(jìn)一步闡釋大白菜晚抽薹的分子機(jī)制提供新的參考。

        猜你喜歡
        大白菜
        Hechi:A Land of Natural Endowment
        大白菜要高產(chǎn)這樣管理
        農(nóng)谷三安模式 蔬菜基地大白菜喜獲豐收
        大白菜如何快速包心,5 招幫您搞定
        中晚熟大白菜新品種天白80的選育
        中國蔬菜(2016年8期)2017-01-15 14:23:41
        早熟大白菜新品種新早59
        蔬菜(2016年8期)2016-10-10 06:49:14
        兩棵“大白菜”遇到一棵“小酸菜”
        大白菜
        原野上的大白菜房子
        兩顆“大白菜”遇到一顆“小酸菜”
        国产精品麻豆最新AV| 中文字幕一区二区三区97| 麻豆国产成人av高清在线| 不卡一区二区视频日本| 日本成本人片免费网站| 国产精品无码不卡一区二区三区| 国产亚洲美女精品久久| 国产精品久久久av久久久| 91精品国产福利尤物免费| yy111111少妇影院| av在线网站一区二区| 亚洲av人片在线观看| 艳妇臀荡乳欲伦交换h在线观看| 无码人妻av一区二区三区蜜臀| 欧美日韩国产专区| 日韩精品一区二区三区四区视频| 与最丰满美女老师爱爱视频| 欧美人妻aⅴ中文字幕| 97人人超碰国产精品最新o| 久久久精品免费国产四虎| 午夜视频一区二区三区在线观看| 亚洲国产精品一区二区久久恐怖片| 热久久国产欧美一区二区精品 | 日韩欧美亚洲国产一区二区三区| 美女被内射中出在线观看| 免费大片黄国产在线观看| 亚洲国产综合精品 在线 一区| 久久精品成人亚洲另类欧美| 久久综合激情的五月天| 四虎国产精品永久在线| 在线播放国产一区二区三区| 国产免费三级三级三级| 性感女教师在线免费观看| 无码精品久久久久久人妻中字| 欧美成人www免费全部网站| 久久2020精品免费网站| 暖暖 免费 高清 日本 在线| 成人免费毛片内射美女-百度| 精品系列无码一区二区三区| 亚洲成年国产一区二区| 无码人妻精品一区二区|