摘要：類黃酮3＇，5＇-羥化酶（flavonoid 3＇，5＇-hydroxylase，F(xiàn)3＇5＇H）是花青素合成途徑中催化形成藍(lán)色飛燕草素的關(guān)鍵酶。本研究通過(guò)RT-PCR方法，從藍(lán)紫花、玫紅花、白花黃芩中克隆得到F3＇5＇H基因的全長(zhǎng)序列，分別命名為SbF3＇5＇H-b、SbF3＇5＇H-r、SbF3＇5＇H-w。經(jīng)序列比對(duì)，SbF3＇5＇H-r基因較SbF3'5'H-b/w缺失7 bp，導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止。生物信息學(xué)分析顯示，三個(gè)SbF3＇5＇H蛋白均屬于細(xì)胞色素P450家族，定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。SbF3＇5＇H-B/W蛋白具有典型的CYP450保守序列，包括富含脯氨酸基序“LPPGP”、底物識(shí)別位點(diǎn)SRS1-6、折疊鎖定基序“ExxR”、血紅素結(jié)合基序“PFGAGRRICAG”及預(yù)測(cè)的羥化活性位點(diǎn)CR1和CR2。而SbF3＇5＇H-R蛋白由于序列缺失影響二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)致CYP450結(jié)構(gòu)域不完整，c端缺少多個(gè)維持酶活性的保守基序?；贔3＇5＇H蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，黃芩與同為唇形科的丹參、一串紅等親緣關(guān)系最近，聚在一個(gè)分支，與單子葉植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)?；虮磉_(dá)分析結(jié)果顯示，SbF3＇5＇H在白花中整體表達(dá)最高，其次是藍(lán)紫花，玫紅花中整體表達(dá)最低；不同花發(fā)育階段比較，SbF3＇5＇H基因均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，在中蕾期表達(dá)量最高，其次是幼蕾期，盛花期表達(dá)量最低，藍(lán)紫和白花黃芩不同花發(fā)育階段間差異顯著或極顯著。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究不同花色黃芩中SbF3＇5＇H基因的功能差異、揭示黃芩花色變異的分子機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：黃芩；花色；類黃酮3＇，5＇-羥化酶；基因克??；生物信息學(xué)分析：表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S567.239：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）10-0001-09

黃芩（Scutellaria baicalensis Ceorgi）為唇形科黃芩屬植物，以其干燥根入藥，是我國(guó)大宗常用中藥材，具有清熱解毒、燥濕瀉火、止血安胎之功效。黃芩根提取物中含有豐富的黃酮類、二萜、多糖、氨基酸、揮發(fā)油等生物活性成分，黃酮類化合物黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素是其主要活性成分。黃芩地上部活性成分主要為芹菜素、野黃芩素、野黃芩苷等，與地下部存在明顯差異?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芩具有廣譜的抗病毒、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、護(hù)肝及保護(hù)神經(jīng)等作用。由黃芩等多味中藥組成的清肺排毒湯、宣肺敗毒方等在治療新型冠狀病毒感染中的臨床效果顯著。

在長(zhǎng)期的栽培過(guò)程中，黃芩產(chǎn)生了許多變異類型，包括花色、葉片大小、葉表有無(wú)被毛等?；ò甑闹饕噬镔|(zhì)為花青素，包括天竺葵素、矢車菊素、飛燕草素等。花青素與黃芩活性成分同屬于黃酮類化合物，以苯丙氨酸為前體，經(jīng)一系列酶促反應(yīng)生成共同的代謝中間產(chǎn)物柚皮素，后花青素分支在黃烷酮羥化酶F3H、F3'H、F3'5'H的作用下生成二氫黃酮醇類物質(zhì)，再后經(jīng)二氫黃酮醇還原酶DFR和花青素還原酶ANS的催化生成呈色的花青素類物質(zhì)。其中F3'5'H能夠催化二氫山奈酚在B環(huán)3'、5'位點(diǎn)羥基化生成二氫楊梅素，是合成藍(lán)色飛燕草素的關(guān)鍵酶基因，被稱為“藍(lán)色基因”。F3'5'H缺失是大部分植物不能形成藍(lán)色花的主要原因。目前，已在菊花、錦繡杜鵑、楊梅、茉莉、胡椒等植物中克隆鑒定到F3'5'H基因。但關(guān)于黃芩F3'5'H基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

黃芩花通常呈現(xiàn)藍(lán)紫色，本課題組前期篩選得到玫紅花和白花黃芩變異材料，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組代謝組聯(lián)合分析篩選到三種花色黃芩間的差異基因F3'5'H。本研究擬利用RT -PCR技術(shù)從藍(lán)紫花、玫紅花、白花黃芩中克隆SbF3'5'H基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用qRT-PCR分析SbF3'5'H基因在不同花發(fā)育階段的表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步研究SbF3'5'H基因功能、揭示黃芩花色變異的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，并為高品質(zhì)黃芩的精準(zhǔn)分子育種提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料

藍(lán)紫花（SB）、玫紅花（SR）、白花（SW）黃芩均種植于山東省中醫(yī)藥研究院中藥資源苗圃內(nèi)，于2023年6月盛花期分別采集各材料3個(gè)發(fā)育階段的花（圖1），置于50 mL離心管中液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取及SbF3'5'H基因克隆

利用RNAprep pure Plant Kit（TIANGEN）及PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）分別進(jìn)行三種顏色黃芩花的RNA提取及反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到的SbF3'5'H基因序列利用Primer Premier5軟件設(shè)計(jì)基因擴(kuò)增引物SbF3'5'H-F/R（表1），以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用PrimeSTAR@ Max DNA Poly-merase（TaKaRa）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（20μL）：cDNA模板1 μL，SbF3'5'H-F/R各1 μL，2×PrimeSTAR MAX 10 μL，ddH20 7 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min;95℃30 s，58℃30 s，72℃1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，采用TIANgel Midi Purification Kit（TIANCEN）回收目的片段，連接pMD18 -T載體（TaKaRa），轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑取單克隆利用T載體通用引物委托北京擎科生物科技股份有限公司青島分公司測(cè)序。

1.3 SbF3'5'H基因生物信息學(xué)分析

利用DNAStar軟件中的EditSeq工具分別預(yù)測(cè)SbF3'5'H-b、SbF3'5'H-r、SbF3'5'H-w基因編碼序列：利用NCBI的BLASTN下具對(duì)三個(gè)基因與同源基因的序列一致性進(jìn)行比對(duì)：利用在線分析軟件ExPASy的ProtParam、ProtScale工具進(jìn)行三種SbF3'5'H蛋白的理化性質(zhì)分析。

利用NCBI CD - search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）預(yù)測(cè)SbF3'5'H蛋白保守結(jié)構(gòu)域：采用SOPMA工具預(yù)測(cè)SbF3'5'H蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用TMHMM和SignalP 5.0預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽：用Plant-mPLoc進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位：利用NetPhos 3.1預(yù)測(cè)蛋白的磷酸化位點(diǎn)；利用NetOGlyc 4.0和NetNGlyc 1.0分別預(yù)測(cè)蛋白的O型和N型糖基化位點(diǎn)：利用Swiss-Model進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

從國(guó)家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心網(wǎng)站（https：／／ngdc.cncb.ac.cn／gwh/Assembly/10411/show）下載黃芩基因組序列，利用TBtools工具提取SbF3'5'H基因上游2 000 bp啟動(dòng)子區(qū)域，采用PlantCARE預(yù)測(cè)啟動(dòng)子中可能的順式作用元件。在NCBI網(wǎng)站用SbF3'5' H-B/W蛋白序列進(jìn)行BLASTP檢索，下載相近物種及模式植物同源蛋白序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，利用MECA11的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap值設(shè)為1 000。

1.4 SbF3'5'H基因表達(dá)分析

提取三種花色黃芩不同發(fā)育階段花的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用PerlPrimer軟件設(shè)計(jì)熒光定量檢測(cè)引物（表1），并通過(guò)TBtools軟件檢測(cè)引物特異性。利用SYBR@ Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行基因表達(dá)分析，反應(yīng)體系及程序參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。以黃芩18S rRNA為內(nèi)參基因，基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt方法計(jì)算，用CraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SbF3'5'H基因的克隆

以藍(lán)紫花（SB）、玫紅花（SR）、白花（SW）黃芩盛花期花的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。經(jīng)單克隆測(cè)序，SB、SR、SW的SbF3'5'H基因cDNA全長(zhǎng)分別是1 527、1 520、1 527 bp（圖3）。三個(gè)基因與丹參（Salvia miltiorrhiza）F3'5'H基因（MH447665.1）的序列一致性分別為76.68%、76.40%、76.68%，將其分別命名為SbF3'5'H-b、SbF3'5'H-r、SbF3'5'H-w、其中SbF3'5'H-b和SbF3' 5t H-w序列一致、SbF3%5'H-r在933 - 939位缺失7 bp。

2.2 SbF3'5'H蛋白理化性質(zhì)分析

利用DNAStar軟件中的EditSeq工具預(yù)測(cè)到SbF3'5'H-b、SbF3'5'H-r、SbF3'5'H-w基因分勛編碼508、316、508個(gè)氨基酸，其中SbF3'5'H-r由于缺失7 bp，導(dǎo)致移碼突變，蛋白質(zhì)翻譯提前終止。理化性質(zhì)分析結(jié)果（表2）顯示，SbF3'5'H-B、SbF3'5'H-W蛋白分子量為56.86 kDa，理論等電點(diǎn)為7.21; SbF3'5'H-R蛋白分子量為35.10kDa，理論等電點(diǎn)為6.45;三個(gè)蛋白均為穩(wěn)定蛋白。SbF3'5'H-B、SbF3'5'H-W平均親水系數(shù)為負(fù)值，說(shuō)明這兩個(gè)蛋白為親水性蛋白：SbF3'5'H-R為疏水性蛋白。

2.3 SbF3'5'H蛋白結(jié)構(gòu)分析

保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果（圖4）顯示，SbF3'5'H蛋白屬于細(xì)胞色素P450超家族，SbF3 '5' H-B/W的第11 - 506個(gè)氨基酸為CYP450結(jié)構(gòu)域，SbF3'5'H-R含有不完整的CYP450結(jié)構(gòu)域（第11- 311個(gè)氨基酸）。

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示SbF3'5' H-B/W由α-螺旋（50.00%）、無(wú)規(guī)則卷曲（35.24%）、延伸鏈（10.83%）、β-轉(zhuǎn)角（3.94%）組成；SbF3'5'H-R則分別含有58.23%、29.75%、8.86%和3.16%的α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈和B -轉(zhuǎn)角?？缒そY(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果（圖5a）顯示，SbF3'5'H蛋白在N端含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，第2 - 24個(gè)氨基酸為跨膜區(qū)域，不含信號(hào)肽。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示三個(gè)蛋白均定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。蛋白磷酸化和糖基化在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性和穩(wěn)定性中起到重要作用。SbF3'5'H蛋白磷酸化預(yù)測(cè)結(jié)果（圖5b）顯示，SbF3'5'H-B/W存在21個(gè)絲氨酸（Ser）、16個(gè)蘇氨酸（Thr）、3個(gè)酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)；SbF3'5'H-R僅有12個(gè)絲氨酸（Ser）、11個(gè)蘇氨酸（Thr）、2個(gè)酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)。SbF3'5'H-B/W和SbF3'5'H-R均含有2個(gè)N型糖基化位點(diǎn)，不含O型糖基化位點(diǎn)（圖5c）。

根據(jù)Swiss -Model三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖6），SbF3'5'H-B/W和SbF3'5'H-R的蛋白模型分別是土瓶草（Cephalotus follicularis）的AOAIQ38288.I.A p450domain-containing protein和矮牽牛（Petunia hybrida）的P48419.1.AFlavonoid3'，5'- hydroxylase2，序列一致性分別為74.21%和71.66%，模型質(zhì)量評(píng)估（GMQE）值分別為0.94和0.90，模型可信度較高。

2.4 SbF3'5'H蛋白多序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

將SbF3'5'H-B/W、SbF3'5'H-R蛋白與相近物種同源蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，結(jié)果（圖7）顯示，SbF3'5'H具有典型的CYP450保守序列，N端的富含脯氨酸基序“LPPCP”形成鉸鏈負(fù)責(zé)連接蛋白的跨膜區(qū)域和胞質(zhì)中的催化區(qū)域，HelixI基序“ACTDTS”可能與底物選擇性及氧結(jié)合特性有關(guān)，折疊鎖定基序“ExxR”及c端的血紅素結(jié)合基序“PFCACRRICAG”是結(jié)合血紅素及底物蛋白所必需的，SRS1 -6為底物識(shí)別位點(diǎn)，CRI及位于SRS6基序內(nèi)的CR2是潛在的羥化活性位點(diǎn)，它們是F3'5'H蛋白發(fā)揮酶活性所必需的序列。SbF3'5'H-R蛋白由于翻譯提前終止，缺少SRS5 -6、CR2位點(diǎn)、“ExxR”及血紅素結(jié)合基序。

基于F3'5'H蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果（圖8）顯示，相同或相近科屬植物的F3'5'H親緣關(guān)系較近，黃芩與同為唇形科的丹參、一串紅等親緣關(guān)系最近，聚在一個(gè)分支；與茄科、豆科、胡桃科等物種親緣關(guān)系次之：與單子葉植物水稻、小麥及十字花科擬南芥親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，分別聚為兩大簇。

2.5 SbF3'5'H啟動(dòng)子分析

對(duì)SbF3'5'H基因上游2 000 bp啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式元件分析（圖9），發(fā)現(xiàn)存在逆境響應(yīng)元件MYC、MYB、W-box，應(yīng)激響應(yīng)元件STRE，防御和應(yīng)激響應(yīng)元件TC-rich repeats，厭氧誘導(dǎo)元件ARE，低溫響應(yīng)元件LTR;脫落酸響應(yīng)元件ABRE、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CCTCA/TCACG -motif、乙烯響應(yīng)元件ERE、赤霉素響應(yīng)元件GARE -motif、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件TCA - ele-ment等激素響應(yīng)元件：以及與分生發(fā)育相關(guān)的CAT-box元件和光響應(yīng)元件Box 4、G-Box。

2.6 黃芩花不同發(fā)育階段SbF3'5'H基因的表達(dá)分析

為了解SbF3'5'H基因在黃芩花發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化，在三個(gè)花發(fā)育階段分別進(jìn)行基因表達(dá)分析。以藍(lán)紫花F1幼蕾時(shí)期的表達(dá)量為對(duì)照，結(jié)果（圖10）顯示，隨著花發(fā)育階段的推進(jìn)，三種黃芩SbF3'5'H基因相對(duì)表達(dá)量均呈先升高后降低的趨勢(shì)，均在F2中蕾期表達(dá)量最高，其次是F1幼蕾時(shí)期，F(xiàn)3盛花期表達(dá)量最低：藍(lán)紫花和白花黃芩不同花發(fā)育階段間差異顯著或極顯著，玫紅花不同階段間差異不顯著。不同材料間比較，白花中SbF3'5'H基因表達(dá)量整體最高，其次是藍(lán)紫花，玫紅花中表達(dá)量最低。

3 討論與結(jié)論

F3'5'H基因是花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因之一，負(fù)責(zé)形成藍(lán)色飛燕草素。本研究在前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，通過(guò)RT -PCR方法克隆獲得三種花色黃芩F3'5'H基因的全長(zhǎng)cDNA序列，分別為1527、1 520、1 527 bp。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，玫紅花黃芩SbF3'5'H-r基因有7 bp缺失，其造成的移碼突變可能導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止。生物信息學(xué)分析顯示，三個(gè)SbF3'5'H蛋白均屬于細(xì)胞色素P450基因家族，定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，N端含有跨膜結(jié)構(gòu)域，不含信號(hào)肽，與前人，分析結(jié)果一致，符合CYP450發(fā)揮催化作用的特點(diǎn)。CYP450蛋白是依賴于血紅素的單加氧酶，血紅素對(duì)于其功能發(fā)揮必不可少。但SbF3'5'H-R蛋白由于C端缺失部分氨基酸導(dǎo)致CYP450結(jié)構(gòu)域不完整，缺少血紅素結(jié)合基序和負(fù)責(zé)血紅素與底物蛋白穩(wěn)定結(jié)合的“ExxR”基序以及保守的底物識(shí)別位點(diǎn)SRS5 -6、潛在的5'羥化位點(diǎn)CR2，這些序列的缺失很有可能導(dǎo)致SbF3'5'H-R羥化酶功能喪失。酶蛋白完整的三維結(jié)構(gòu)是其行使催化功能的前提，三維建模顯示SbF3'5'H-B/W和SbF3'5'H-R蛋白分屬于不同的蛋白模型。綜上，SbF3'5'H-r基因序列缺失導(dǎo)致的移碼突變影響了SbF3'5'H-R蛋白的結(jié)構(gòu)域及二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，推測(cè)可能因此影響SbF3'5'H-R酶的活性。

基因表達(dá)分析顯示，三種黃芩SbF3'5'H基因均是在中蕾期表達(dá)量最高，盛花期表達(dá)量最低，與基因表達(dá)先于蛋白翻譯和代謝物積累的規(guī)律相符。不同花色黃芩間，玫紅花SbF3'5'H基因表達(dá)量明顯低于藍(lán)紫花，白花中表達(dá)量最高。

前期代謝組數(shù)據(jù)顯示，缺少藍(lán)色飛燕草素可能是玫紅花黃芩產(chǎn)生花色變異的主要原因，結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)玫紅花黃芩SbF3'5'H-r基因7 bp的缺失造成的蛋白翻譯缺陷，可能導(dǎo)致SbF3'5'H-R蛋白喪失正常的羥化酶功能，另外玫紅花中SbF3'5'H基因表達(dá)量明顯較低，也可能阻礙了飛燕草素的正常合成，但玫紅花色形成是由SbF3'5'H-R酶功能喪失還是基因表達(dá)量低導(dǎo)致或者是兩者共同作用的結(jié)果，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。白色黃芩花中沒(méi)有檢測(cè)到花青素成分，而SbF3‘5'H-w基因序列與SbF3'5'H-b基因無(wú)差異，且白花中SbF3'5'H基因表達(dá)量高于藍(lán)紫花，推測(cè)白花形成可能受花青素合成途徑中其他結(jié)構(gòu)基因或轉(zhuǎn)錄因子影響，具體原因有待于進(jìn)一步研究。

基金項(xiàng)目：山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（Q-2022083）；山東省中醫(yī)藥研究院科研孵化基金項(xiàng)目（2022SACM-4）；國(guó)家中醫(yī)藥管 理局中藥資源保障能力提升工程項(xiàng)目（[2023119號(hào)）；中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目（2060302）；山東省科技型中小企業(yè)創(chuàng)新能力提升工程項(xiàng)目（2022TSGC1059、2023TSGC0444）；濟(jì)南市農(nóng)業(yè)應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（CX202112）