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        基于表型性狀和SCoT分子標記的白術(shù)種質(zhì)遺傳多樣性分析

        2024-12-31 00:00:00董薇許蘭杰安素妨余永亮楊青譚政委李春明孫瑤蘇小雨梁慧珍
        江蘇農(nóng)業(yè)科學 2024年19期

        摘要:為了評價筆者所在課題組自選126個白術(shù)種質(zhì)的遺傳多樣性,利用表型性狀和SCoT標記相結(jié)合的方法對126個白術(shù)種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明,5個表型性狀變異系數(shù)范圍為17.23%~24.51%,其中變異系數(shù)最大的性狀為葉寬,變異系數(shù)最小的是葉長;5個性狀的多樣性指數(shù)范圍為1.71~2.53,葉長的多樣性指數(shù)最高;冠幅與株高呈極顯著負相關(guān),而與葉長和莖粗呈極顯著正相關(guān)。在歐氏距離為7.2處將126個白術(shù)單株聚為6類,其中第Ⅰ類表現(xiàn)出高株短窄葉型,第Ⅱ類表現(xiàn)出矮株短窄葉型,第Ⅲ類表現(xiàn)出高株長闊葉型。15條SCoT引物在126個白術(shù)種質(zhì)間共檢測出84個等位基因,平均每個引物可檢測5.60個,變化范圍為2~8個;PIC值變化范圍為0.63~0.86,平均為0.78。有效等位基因數(shù)范圍為1.31~2.01,平均值為1.31;Nei’s多樣性指數(shù)值為0.20~0.50,平均值為0.35,Shannon’s多樣性指數(shù)為0.36~0.81,平均值為0.57。Structure群體結(jié)構(gòu)分析表明,當K=6時,ΔK最高,126個白術(shù)種質(zhì)中有87個材料的Q≥0.6,占所有供試材料的69.05%,說明各群體中大部分種質(zhì)親緣關(guān)系相對單一。本研究明確了126個白術(shù)種質(zhì)的表型特征和親緣關(guān)系,為指導親本選配和高效育種提供重要依據(jù)。

        關(guān)鍵詞:白術(shù);表型性狀;SCoT;遺傳多樣性分析

        中圖分類號:S567.23+3.032" 文獻標志碼:A

        文章編號:1002-1302(2024)19-0192-06

        收稿日期:2024-04-03

        基金項目:國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(編號:CARS-21);河南省重大科技專項(編號:221100310400);河南省重點研發(fā)專項(編號:231111110800);中央本級重大增減支項目(編號:2060302);河南省農(nóng)業(yè)科學院自主創(chuàng)新專項基金(編號:2024ZC040);河南省農(nóng)業(yè)科學院新興學科發(fā)展專項(編號:2024XK01);河南省科技攻關(guān)項目(編號:242102110248、242102110260)。

        作者簡介:董 薇(1985—),女,河北邢臺人,碩士,助理研究員,從事中藥材遺傳育種相關(guān)研究,E-mail:dongwei720@qq.com。

        通信作者:梁慧珍,博士,研究員,從事中藥材遺傳育種相關(guān)研究,E-mail:lhzh66666@163.com;許蘭杰,副研究員,從事中藥材遺傳育種相關(guān)研究,E-mail:xulanjie18@126.com。

        中藥材白術(shù)來源于菊科植物白術(shù)(Atractylodes macrocephala Koidz.)的干燥根莖,主要產(chǎn)于浙江、安徽、福建、四川、江西、湖南等,河南周口和商丘等地也有栽植[1-2。白術(shù)富含揮發(fā)油和多糖成分,其揮發(fā)油主要成分有蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、杜松酯和棕櫚酸等,具有解表散寒、祛風止痛、宣通鼻竅、燥濕止帶、消腫排膿等功能3-6。白術(shù)作為我國一種常用大宗中藥材,具有2 000多年的栽培歷史。白術(shù)屬于異花授粉的多年生草本植物,生產(chǎn)上的白術(shù)品種多為農(nóng)家種,農(nóng)戶多自留、自繁、自用,長期以來忽視提純復(fù)壯和新品種選育,導致多代有性繁殖后代多混雜、品種質(zhì)量參差不齊[6。

        種質(zhì)資源遺傳多樣性越高越有利于篩選優(yōu)異性狀,在資源應(yīng)用和開發(fā)方面具有的優(yōu)勢越強,因此開展中藥材種質(zhì)資源評價工作非常重要[7-11。中藥材種質(zhì)資源評價的方法較多,主要包括形態(tài)學標記、細胞學標記、同工酶標記和DNA分子標記技術(shù)[12。由于形態(tài)學標記具有直觀、簡便的特征,DNA分子標記具有精準的特征,這2種技術(shù)相對應(yīng)用較多,劉逸慧等用12個ISSR標記對浙江磐安86個白術(shù)個體和5個蒼術(shù)個體[13,孫靚等采用13條ISSR對356個樣品[14,王宗寬等采用20個RAPD技術(shù)對45個於術(shù)76、白術(shù)天臺和於術(shù)86個體進行遺傳多樣性分析,均表明白術(shù)具有較高的遺傳多樣性[15。中藥材良種選育是保證藥材質(zhì)量的重要措施,而豐富的種質(zhì)資源將為新品種選育提供親本材料支撐。蔣小剛等采用14對SRAP引物對8個白術(shù)主產(chǎn)區(qū)的52個資源進行分析,表明該批材料具有豐富的遺傳多樣性。為了評價筆者所在課題組自選的126個白術(shù)種質(zhì)的遺傳多樣性,本研究分別從表型性狀和SCoT標記對其進行遺傳多樣性分析,為白術(shù)新品種選育及品質(zhì)改良奠定理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        1.1.1 樣品

        126個白術(shù)種質(zhì)均為自選材料,來自于河南、浙江等地方品種變異株,由河南省農(nóng)業(yè)科學院中藥材研究所梁慧珍研究員鑒定為白術(shù)。資源收集后于2021年9月6日將種子播種于河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)開發(fā)基地試驗田,3次重復(fù),隨機區(qū)組排列,每份材料種植6行,行長2 m,行寬0.6 m,株距0.4 m。

        1.1.2 試劑

        新型植物基因組DNA提取試劑盒(Plant Genomic DNA Extraction Kit 36302-01,上海吐露港生物科技公司)、2×Tag Master Mix(深圳輝諾生物科技有限公司)、SCoT引物(河南尚亞生物有限公司合成)、瓊脂糖(Monad Biotech)[16

        1.1.3 儀器

        電泳儀(北京六一DYY-3C型電泳儀);高通量組織研磨儀(Heros-Mole TL2010S,鼎昊源科技);凝膠成像儀(天能Tanon-2500);超微量分光光度計(K5500 Plus);PCR儀(Eppendorf AG型);電子天平AL204(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 DNA提取

        2022年8月11日,每份材料取5株中部新鮮葉片,用DNA提取試劑盒提取白術(shù)基因組DNA。DNA質(zhì)量用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,帶型模糊者重新提取基因組DNA,DNA原液在-20 ℃下保存?zhèn)溆?,使用前稀釋?0 ng/μL。

        1.2.2 SCoT引物來源及PCR擴增

        80條SCoT引物由河南尚亞公司合成。利用BZ24、BZ47、BZ73表型差異較大的種質(zhì)作為DNA模板對80對SCoT引物進行PCR擴增,并對擴增產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,篩選出15條SCoT條帶清晰、多態(tài)性較高、擴增穩(wěn)定的引物,用于126個白術(shù)種質(zhì)PCR擴增(表1)。

        1.2.3 PCR擴增體系

        SCoT-PCR體系中的擴增條件參考許蘭杰等的方法[17并略作修改,反應(yīng)體系總體積為10 μL,包括引物1.0 μL、5.5 μL 2×Tag Master Mix、1 μL DNA模板,2.5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s,55~55 ℃退火35 s,72 ℃延伸40 s,30個循環(huán);72 ℃延伸7 min;4 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后,對反應(yīng)產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

        1.2.4 表型性狀調(diào)查

        2022年9月10—20日選取白術(shù)地上部分5個主要表型性狀進行調(diào)查,包括株高(cm)、葉長(cm)、葉寬(cm)、莖粗(cm)、冠幅(cm)。

        1.3 數(shù)據(jù)分析

        采用Excel 2007進行各個性狀的平均值、變異系數(shù)等計算;采用SPSS 25.0中 “ward法”進行系統(tǒng)聚類;利用Popegen 1.32軟件計算多態(tài)性條帶百分比、有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)等指標;利用Structure 2.3.4進行126個白術(shù)種質(zhì)居群分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 表型性狀遺傳多樣性分析

        2.1.1 表型性狀變異系數(shù)和多樣性指數(shù)分析

        本研究對126個白術(shù)栽培群體的株高、葉長、葉寬、莖粗和冠幅等5個表型性狀進行觀察和分析(表2)。5個表型性狀平均值為0.64、0.71、0.50、0.53、0.69 cm,其變異系數(shù)范圍為18.04%~24.64%,平均為20.58%。其中變異系數(shù)最大的性狀為葉寬,變異系數(shù)最小的是葉長,變異系數(shù)全部大于15.00%。說明這5個表型性狀間存在較大變異,多樣性豐富,有利于后續(xù)的品種篩選。

        2.1.2 表型性狀相關(guān)性分析

        莖粗與葉寬呈極顯著負相關(guān),冠幅與株高呈極顯著負相關(guān),而與葉長和莖粗呈極顯著正相關(guān)(表3)。

        2.1.3 表型性狀的聚類分析

        在歐氏距離為7.2處將126個白術(shù)單株聚為6類,第Ⅰ類包含24個單株,第Ⅱ類包含22個單株,第Ⅲ類包含6個單株,第Ⅳ類包含37個單株,第Ⅴ類包含15個單株,第Ⅵ類包含22個單株。對6個居群的株高、葉長、葉寬、莖粗和冠幅等性狀進行分析,結(jié)果表明,第Ⅰ類24個單株的5個表型性狀的平均值為65.60、10.31、2.55、0.42、11.50 cm,變幅為52.20~76.40、6.90~14.60、1.40~3.62、0.28~0.55、8.75~15.60 cm,表現(xiàn)出高株短窄葉型,其中BZ110的株高為 76.40 cm,BZ47的株高為52.20 cm。第Ⅱ類22個單株的5個表型性狀的平均值為50.13、10.16、3.19、0.39、11.66 cm,變幅為40.10~60.10、7.20~12.20、2.30~4.10、0.26~0.52、8.65~12.25 cm,表現(xiàn)出矮株短窄葉型,其中BZ24的株高為40.10 cm,BZ49的株高為60.10 cm;BZ118葉長為7.20 cm,BZ91葉長為12.20 cm。第Ⅲ類6個單株的5個表型性狀的平均值為64.83、11.85、5.14、0.27、9.77 cm,變幅為50.60~90.80、10.80~15.80、4.02~6.20、0.18~0.40、7.40~13.60 cm,表現(xiàn)出高株長闊葉型,其中BZ123的株高為90.80 cm,BZ73的株高為50.60 cm、BZ125的冠幅為7.40 cm,BZ73的冠幅為13.60 cm,BZ73的葉寬為6.20、BZ125的葉寬為4.02。第Ⅳ類37個單株的5個表型性狀的平均值為61.61、11.86、2.91、0.55、13.64 cm,變幅為45.30~81.70、8.60~15.00、2.00~4.20、0.39~0.84、10.00~15.95 cm,表現(xiàn)出莖粗最大,其中BZ29的莖粗為0.84 cm。第Ⅴ類15個單株的5個表型性狀的平均值為51.00、13.98、2.92、0.38、13.44 cm,變幅為31.55~66.00、12.40~16.50、2.00~3.70、0.30~0.44、8.90~16.00 cm。第Ⅵ類14個單株的22個表型性狀的平均值為53.19、12.46、3.30、0.46、16.44 cm,變幅為40.10~65.20、10.00~16.50、2.30~4.40、0.39~0.60、14.35~19.05 cm(表4)。

        2.2 分子遺傳多樣性分析

        2.2.1 SCoT標記分析

        以120個白術(shù)種質(zhì)為材料,采用15個SCoT標記進行分析。結(jié)果(表5)表明 15個SCoT標記在126個白術(shù)種質(zhì)間可獲得清晰可辨條帶84條,其中多態(tài)性條帶79條,多態(tài)性條帶比率占94.05%;多態(tài)性條帶數(shù)范圍在2~8個,平均為5.27個。各引物多態(tài)性指數(shù)變化范圍在0.63~0.86之間,平均為0.78,其中SCoT16、SCoT54、SCoT23、SCoT03、SCoT20、SCoT37、SCoT53等的多態(tài)性指數(shù)大于0.80。15個標記的有效等位基因數(shù)變化范圍為1.31~2.01,平均為1.31;Nei’s基因多樣性指數(shù)變化范圍在0.20~0.50之間,平均為0.35;Shannon信息指數(shù)變幅為0.36~0.81,平均為0.57。表明126份白術(shù)單株間存在較高的遺傳多態(tài)性。

        2.2.2 群體結(jié)構(gòu)分析

        參考余永亮等方法,采用STRUCTURE軟件對126個白術(shù)種質(zhì)進行遺傳結(jié)構(gòu)分析,當K=6時,峰值最高,表明分為6個類群更為合理(圖1)。第Ⅰ類為紅色部分,包含32個材料[18。第Ⅱ類為綠色部分,包含24個材料;第Ⅲ類為深藍色部分,包含16個材料。第Ⅳ類為黃色部分,包含18個材料。第Ⅴ類為紫色部分,包含20個材料。第Ⅵ類為淺藍部分,包含16個材料。

        126個白術(shù)單株在各個群體中的Q值分布見表6。126個白術(shù)單株中有87份材料Q≥0.6,占所有供試材料的69.05%;Q≥0.6、≥0.8、≥0.9的個體分別有35、31、21個,分別占27.78%、24.60%、16.67%,說明各群體中大部分單株親緣關(guān)系相對單一。

        3 討論與結(jié)論

        表型性狀具有直觀、便于觀察的特征,是種質(zhì)資源重要的評價指標。本研究對自選的126個白術(shù)種質(zhì)進行變異系數(shù)和多樣性指數(shù)進行分析,5個表型性狀的變異系數(shù)范圍為18.04%~24.64%,平均為20.58%;葉寬和莖粗變異系數(shù)最大,變異系數(shù)為24.64%和23.37%,與楊成前等得出的結(jié)論有一定的差異,株高、葉長、葉寬、莖粗、冠幅的變異系數(shù)為22.43%、10.47%、26.36%、20.69%、10.61%[18。5個表型性狀的多樣性指數(shù)范圍為1.71~2.53 可以利用性狀的變異幅度和多樣性指數(shù)來選育新品種。莖粗與葉寬呈極顯著負相關(guān),冠幅與株高呈極顯著負相關(guān),而與葉長和莖粗呈極顯著正相關(guān)。通過系統(tǒng)聚類聚為6類,第Ⅰ類為高株短狹葉型,其中BZ110的株高為 76.40 cm。第Ⅱ類為矮柱短狹葉型,其中BZ24的株高為40.10 cm BZ91葉長為12.20 cm。 第Ⅲ類為高株長闊葉型,其中BZ123的株高為90.80 cm、BZ73的葉寬為6.20 cm。第Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ類群為中間型。

        由于表型性狀易受土壤、水分、溫度、肥料等因子的影響[19-23,采用DNA分子鑒定將更加精準,本研究進一步采用SCoT分子鑒定技術(shù)對126個白術(shù)種質(zhì)進行遺傳多樣性分析。此外,本研究還采用15個SCoT引物對126個白術(shù)種質(zhì)進行PCR擴增,多態(tài)性條帶比率占94.05%,每條引物擴增條帶變化范圍在3~8個之間,平均為5.60個;多態(tài)性條帶數(shù)范圍在2~8個之間,平均為5.27個;各引物多態(tài)性指數(shù)變化范圍在0.63~0.86之間,平均為0.78;有效等位基因數(shù)變化范圍為1.31~2.01,平均為1.31;Nei’s基因多樣性指數(shù)變化范圍在0.20~0.50之間,平均為0.35;Shannon信息指數(shù)變幅為0.36~0.81,平均為0.57。表明126份白術(shù)個體間存在較高的遺傳多態(tài)性,采用SCoT標記在白術(shù)中具有多態(tài)性,可以用于白術(shù)基因型鑒定。

        STRUCTURE軟件作為劃分種質(zhì)群體結(jié)構(gòu)的主要方法,已在菊花、枸杞等中藥材中被廣泛應(yīng)用。本研究進一步將126個白術(shù)種質(zhì)進行STRUCTURE群體結(jié)構(gòu)分析,在K=6時,ΔK最大,可將126個白術(shù)種質(zhì)劃分味6個類群,分別包含32、24、17、18、20、29個材料[24-25。研究表明,STRUCTURE群體結(jié)構(gòu)中的Q值可以用來判斷供體材料的血緣關(guān)系的純度。在本研究中,126個白術(shù)單株中Q≥0.6、0.8、0.9的個體分別有35、31、21個,分別占27.78%、24.60%、16.67%,共有87份材料Q≥0.6,占所有供試材料的69.05%,說明各群體中大部分單株親緣關(guān)系相對單一。

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