摘要：淀粉熟化是當(dāng)前釀造工業(yè)生產(chǎn)的必要環(huán)節(jié)，費時耗能，與當(dāng)前資源節(jié)約、綠色環(huán)保、節(jié)約糧食的時代主題相悖。水解生料淀粉的微生物在四川麩醋釀造過程中扮演著重要角色。因此，該研究從四川麩醋醋醅中分離篩選出一株產(chǎn)生料淀粉酶的革蘭氏陽性桿狀菌Bacillus funiculus A2，在BPA培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)16 h即可達(dá)到穩(wěn)定期，能在69 ℃范圍內(nèi)生長，其乙醇耐受性為9%，最低生長pH為3.5。通過模擬四川麩醋生產(chǎn)工藝進(jìn)行醋醅發(fā)酵，探究Bacillus funiculus A2接種量對麩醋理化性質(zhì)的影響。結(jié)果表明，接種Bacillus funiculus A2對醋醅水分含量、pH、總酸含量和還原糖含量的影響較小；增大接種量可促進(jìn)醋醅發(fā)酵體系乙醇快速消耗，提高醋醅發(fā)酵的淀粉利用率。該研究為四川麩醋釀造的提質(zhì)降耗和工藝改進(jìn)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：四川麩醋；生料淀粉；Bacillus funiculus；模擬發(fā)酵

中圖分類號：TS264.22""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號：1000-9973（2024）11-0007-07

Isolation， Screening and Application of High-Yield Raw Starch Hydrolase Strains from Sichuan Bran Vinegar

XIAO Xiong-jun， TANG Zi-hao， ZENG Lin-min， LIU Ming-xin， LIU Min，

ZHENG Chi-chong， MAO Xiang

（College of Bioengineering， Sichuan University of Science amp; Engineering， Yibin 644000， China）

Abstract： Starch ripening is a necessary link in the current brewing industry production， which is time-consuming and energy-consuming and contradicts the current theme of resource conservation， green environmental protection and grain conservation. Microorganisms that hydrolyze raw starch play an important role in the brewing process of Sichuan bran vinegar. Therefore， in this study， a Gram-positive rod-shaped bacterium Bacillus funiculus A2 which produces raw amylase is isolated and screened from the fermented grains of Sichuan bran vinegar. This strain reaches a stable stage after being cultured at 30 ℃ for 16 h in BPA medium and could grow in the range of 69 ℃， and its ethanol tolerance is 9% and the minimum growth pH is 3.5. The effects of Bacillus funiculus A2 inoculation amount on the physicochemical properties of bran vinegar are studied by simulating the production process of Sichuan bran vinegar.The results show that inoculation of Bacillus funiculus A2 has little effect on moisture content， pH， total acid content and reducing sugar content in fermented grains， and the increase of inoculation amount could promote the rapid consumption of ethanol in the fermentation system of vinegar grains and improve the utilization rate of starch in fermentation of vinegar grains. This study has provided a theoretical basis for improving the quality， reducing the consumption and improving the process of Sichuan bran vinegar brewing.

Key words： Sichuan bran vinegar; raw starch; Bacillus funiculus; simulated fermentation

收稿日期：2024-04-21

基金項目：四川輕化工大學(xué)“652”科研創(chuàng)新團(tuán)隊計劃資助（SUSE652B003）；四川輕化工大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（S202110622029）

作者簡介：肖雄峻（1991—），男，初級實驗師，碩士，研究方向：發(fā)酵工程。

*通信作者：毛祥（1989—），男，助理研究員，博士，研究方向：食品發(fā)酵生物技術(shù)。

淀粉是微生物生長、繁殖和代謝的重要能源物質(zhì)，在發(fā)酵食品工業(yè)中必不可少。目前工業(yè)發(fā)酵微生物大多只能利用熟化后的淀粉，即經(jīng)高溫糊化或膨化后的淀粉，能直接酶解生料淀粉進(jìn)行微生物發(fā)酵的菌群相對較少[1]。若能將直接酶解生料淀粉的微生物應(yīng)用于釀造生產(chǎn)，將極大地降低能源消耗及企業(yè)投資和運行成本，在傳統(tǒng)食品釀造工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

國內(nèi)外學(xué)者對生料淀粉的利用做了大量研究，已報道了許多能產(chǎn)生料淀粉酶的微生物類群，如霉菌[2]、乳酸菌[3]、芽孢桿菌[4]、假單胞菌[5]、放線菌[6]和酵母菌[7]等。其中大多數(shù)產(chǎn)生料淀粉酶的微生物因淀粉糖化、液化條件要求苛刻，且食醋釀造環(huán)境酸度高，限制了其在麩醋釀造過程中的淀粉利用。近年來，對水解生料淀粉酶工程菌株構(gòu)建的研究較多[8]，如Cripwell等[9]利用基因重組技術(shù)構(gòu)建Saccharomyces cerevisiae，使其同時具備水解生料淀粉和酒精發(fā)酵功能，到目前為止已有數(shù)株改造成功的案例，卻無應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的報道。此外，還有部分學(xué)者研究了淀粉酶水解對生料淀粉的作用機(jī)制，并改造提升了酶解效率[10-12]，這些研究有利于增加淀粉在其他領(lǐng)域應(yīng)用的發(fā)展。四川麩醋因以麩皮為原料而得名，麩皮中含有約11%～33%的生淀粉[13]，在麩醋釀造過程中，淀粉殘余量高，造成嚴(yán)重的資源浪費[14]。因此，從環(huán)境相似的條件（如醋醅）下篩選高產(chǎn)水解生料淀粉酶活力的菌株，并原位應(yīng)用于四川麩醋的發(fā)酵生產(chǎn)，對麩醋釀造產(chǎn)業(yè)的提質(zhì)降耗、節(jié)省成本具有重要的理論和應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麩醋醋醅：醋醅發(fā)酵階段發(fā)酵15 d的四川麩醋醋醅樣，取自四川宜賓某麩醋生產(chǎn)廠，醋曲亦為該麩醋廠提供；實驗所用化學(xué)試劑（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；微生物培養(yǎng)所需試劑（均為生物純）；麩皮、面粉等：均購自宜賓本地農(nóng)貿(mào)市場；高活性釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司；黑曲霉孢子：濟(jì)寧玉園生物科技有限公司。

富集培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，pH自然，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。待培養(yǎng)基冷卻后，在無菌條件下加入10.0 g/L于160 ℃干熱滅菌2 h的小麥淀粉。

篩選培養(yǎng)基：初篩培養(yǎng)基在富集培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加20 g/mL的瓊脂粉，復(fù)篩培養(yǎng)基同富集培養(yǎng)基。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（BP）：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，pH自然，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。固體培養(yǎng)基添加20 g/mL的瓊脂粉（BPA）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

ME204E/02電子天平、FE28 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BXM-75立式壓力蒸汽滅菌器、BG2-140電熱鼓風(fēng)干燥箱、BSP-400生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZHJH-C1118C超凈工作臺、ZWY-211C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；優(yōu)普UPT-I-20T超純水機(jī) 四川優(yōu)普超純科技有限公司；A390紫外可見分光光度計 翱藝儀器（上海）有限公司；XHF-DY高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀 賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 目的菌株的富集篩選

準(zhǔn)確稱取25.00 g麩醋醋醅加入225 mL無菌富集培養(yǎng)基中，混勻后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。對富集培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，分別取10-5，10-6，10-7倍的菌液涂布平板，置于37 ℃培養(yǎng)24～48 h。在長出的各單菌落邊緣滴加稀碘液（0.1 mol/L），觀察菌落周圍是否出現(xiàn)變色圈，并用游標(biāo)卡尺測定變色圈直徑（D）與菌落直徑（d）[15]，挑選出D/d比值較大的6株菌株進(jìn)行復(fù)篩。菌落邊緣出現(xiàn)變色圈說明該菌株能產(chǎn)生料淀粉酶，而變色圈直徑與菌落直徑的比值大小說明產(chǎn)酶能力的大小，所以通過D/d的比值確定初篩菌株。

1.3.2 菌株的復(fù)篩

用接種環(huán)分別取1環(huán)初篩獲得的6株菌株接種到復(fù)篩培養(yǎng)基上，37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)2 d。取發(fā)酵液20 mL，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，即為粗酶液，采用DNS法于50 ℃條件下測定各菌株水解生料淀粉酶的活力，選擇水解生料淀粉酶活力最強的一株菌株為后續(xù)試驗的出發(fā)菌株。

1.3.3 菌株的鑒定

對各菌株的菌落形態(tài)、菌落顏色、菌落大小及菌株形態(tài)進(jìn)行觀察，完成菌株的初步鑒定。同時采用生工生物工程（上海）股份有限公司細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒，參照使用說明對目的菌株基因組DNA進(jìn)行提取。利用擴(kuò)增引物27F（5′-AGAGTTTGATAG-AGTTTGATC-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACG-ACTT-3′）對菌株的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系50 μL，2×GS Taq PCR混合物25 μL，上游引物27F（10 μmol/L）和下游引物1492R（10 μmol/L）各2 μL，菌株DNA模板1 μL，無菌重蒸水20 μL，PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃，10 min。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物送往成都擎科偉業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，對測序結(jié)果使用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對分析菌株的同源性，最后通過MEGA 11軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Neighbor-Joining法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，自展值設(shè)定為1 000次重復(fù)計算。

1.3.4 菌株特性分析

為明確目的菌株的應(yīng)用特性，分別對菌株生長特性、溫度、pH和乙醇耐受性等進(jìn)行評估。取1環(huán)菌株接種于250 mL BP液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min培養(yǎng)數(shù)天，期間每2 h取樣一次，測定菌液的OD600值，繪制生長曲線。此外，于9 mL BP液體培養(yǎng)基中接種對數(shù)生長期菌株菌懸液（OD600為1）1 mL，置于依次設(shè)置不同初始溫度（10，15，20，25，30，35，40，45，50，55 ℃），180 r/min避光培養(yǎng)24 h，取200 μL用酶標(biāo)儀測定各培養(yǎng)液的OD600值，評估菌株的生長溫度范圍；同理，于37 ℃條件下對目的菌株的pH耐受性（用乙酸調(diào)節(jié)pH為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0）、乙醇耐受性（0%、1%、5%、7%、9%、11%）進(jìn)行評估。以等體積的無菌BP液體培養(yǎng)基代替菌懸液作為空白對照，每組試驗3個生物學(xué)重復(fù)。

1.3.5 目的菌株發(fā)酵麩醋醋醅的制備工藝

取50 mL富集培養(yǎng)基加入150 mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，以1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0為梯度進(jìn)行試驗，在無菌條件下，用滅菌后的生理鹽水洗下斜面上的菌株，搖勻，吸取1 mL加入富集培養(yǎng)基中，于37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h，取出后，在600 nm處測定吸光度，根據(jù)吸光度判斷菌株的生長情況，得出菌株的耐酸性。

1.3.6 目的菌株發(fā)酵麩醋醋醅的制備工藝

參照工廠生產(chǎn)麩醋的工藝[16]，接種目的菌株發(fā)酵生產(chǎn)醋醅，評估目的菌株對麩醋釀造的影響。首先將大米（110 g）與水按照1∶10的比例混合，浸泡4 h后于105 ℃蒸煮糊化20 min，冷卻至室溫。其次接種0.02 g黑曲霉孢子、0.1 g釀酒酵母，攪拌混勻后置于30 ℃發(fā)酵7 d，期間每12 h攪拌混勻一次，然后以總體積計，按1∶5 000的比例接種醋曲，混勻后均分為4組，分別接種OD600為1的水解生料淀粉芽孢桿菌菌懸液0，5，10，15 mL/100 mL，同時加入9倍大米質(zhì)量的麩皮、4.5%（以大米質(zhì)量計）的無菌小麥粉，翻拌均勻，制成醋醅，置于30 ℃發(fā)酵20 d。期間每2 d翻醅一次，每4 d取樣一次，用于后續(xù)分析。

1.3.7 DNS法測定水解生料淀粉酶活力

在孫玲玉等[17]報道的DNS法測定淀粉含量的基礎(chǔ)上進(jìn)行了微調(diào)，用于測定各菌株水解生料淀粉酶活力。具體步驟：在25 mL比色管中加入2 mL 50 ℃預(yù)熱混勻的生淀粉懸液、2 mL pH為5的磷酸鹽緩沖液和1 mL粗酶液，置于50 ℃下恒溫水浴中反應(yīng)1 h，水浴期間每5 min搖晃一次，避免淀粉沉淀，反應(yīng)結(jié)束后取出，加入1 mL 2 mol/L的氫氧化鈉終止反應(yīng)，冷卻后加入3 mL DNS溶液，沸水浴5 min，取出冷卻后加入去離子水定容至25 mL，于540 nm波長處測定吸光度值，計算水解生料淀粉酶的酶活力。同時以提前滅酶處理后的各菌株粗酶液為空白對照。酶活力的定義：1 mL粗酶液在50 ℃、pH 5.0條件下每分鐘水解可溶性淀粉生成1 μg葡萄糖為一個酶活力單位（U/mL）。酶活力（E）計算公式如下：

E（U/mL）=N×V×F×1 000C×T。

式中：E為生料淀粉酶活力（U/mL）；N為水解淀粉后的葡萄糖生成量（mg/mL）；F為粗酶液的稀釋倍數(shù)；1 000為mg換算成μg的系數(shù)；V為反應(yīng)體系的體積（mL）；C為粗酶液的體積（mL）；T為反應(yīng)時間（min）。

1.3.8 目的菌株發(fā)酵醋醅理化分析

為評估水解生料淀粉酶菌株對麩醋釀造的影響，對麩醋釀造過程中的關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行了測定。采用直接干燥法測定醋醅的含水量；采用酸堿中和滴定法測定醋醅的總酸含量；采用酸度計法測定游離酸含量的變化；采用重鉻酸鉀比色法測定醋醅的乙醇含量[18]；采用DNS法測定醋醅的還原糖和淀粉含量[17]。醋醅淀粉含量的測定：在10.00 g醋醅中加入100 mL蒸餾水，煮沸2 h使淀粉充分糊化，取出冷卻至60 ℃，加入0.1 g α-淀粉溶液（40 U/g原料），60 ℃水浴30 min至完全液化（碘液不顯藍(lán)色）。加熱煮沸，冷卻后定容至250 mL，過濾，取濾液50 mL，加入10 mL 6 mol/mL鹽酸，水解1 h。用NaOH中和過量的鹽酸并定容至100 mL，過濾，取濾液用DNS法測定還原糖含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 高產(chǎn)生料淀粉酶菌株的篩選分離

通過富集培養(yǎng)、梯度稀釋和平板涂布對水解生料淀粉酶菌株進(jìn)行富集、培養(yǎng)和篩選，利用平皿生化反應(yīng)-淀粉酶水解圈試驗[15]對其進(jìn)行功能鑒別。從四川麩醋醋醅中篩選出6株產(chǎn)生料淀粉酶能力較高的菌株，由圖2可知，變色圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值（D/d值）均大于3.0，其中菌株A4的D/d值最大，為3.9，其次為A2。D/d值只能初步定性說明菌株產(chǎn)生料淀粉酶的能力，不能定量反映各菌株產(chǎn)生料淀粉酶的能力，因此對初篩的6株菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗，采用DNS法測定菌株水解生料淀粉酶活力，篩選出產(chǎn)酶能力最佳的菌株。

淀粉酶是微生物細(xì)胞分泌的胞外酶，因此測定發(fā)酵液中淀粉酶活力即可判斷菌株的產(chǎn)酶能力。6株初篩獲得的菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)2 d后，各發(fā)酵液均有生料淀粉酶活力。其中，A2菌株的產(chǎn)酶能力最大，酶活力為（272.9±15.8） U/mL，其次是1號菌株，酶活力為（230.8±7.28） U/mL，二者酶活力差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），因此將A2菌株作為后續(xù)試驗研究的目的菌株。

2.2 高產(chǎn)生料淀粉酶菌株的鑒定

對A2菌株進(jìn)行形態(tài)觀察和革蘭氏染色（見圖3）發(fā)現(xiàn)，該菌株為好氧型革蘭氏陽性（G+，藍(lán)紫色）桿狀細(xì)菌，在BPA平板上的菌落呈白色凸起的圓形形態(tài)，不透明，邊緣光滑，表面光滑且濕潤，容易挑取且有不悅的氣味。

將測序結(jié)果（16S rDNA序列）與NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST工具進(jìn)行同源性對比分析，選擇相似度＞98%的10株菌進(jìn)行多重比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖4。

由圖4可知，A2菌株與Bacillus funiculus NAF001菌株有99%的同源性，結(jié)合菌株初步鑒定結(jié)果確定A2菌株為Bacillus funiculus，命名為Bacillus funiculus A2。

2.3 Bacillus funiculus A2菌株的發(fā)酵特性分析

2.3.1 Bacillus funiculus A2的生長特性

對菌株的生長特性進(jìn)行分析有利于在試驗過程中控制菌株的菌齡，保證接種菌株的活性。由圖5中a可知，繩索狀芽孢桿菌A2（Bacillus funiculus A2）的生長在接種后6 h處于延滯期，此時菌株生長緩慢，原因可能是菌株對新環(huán)境的調(diào)整適應(yīng)過程；在6～16 h時菌株生長進(jìn)入對數(shù)期，OD600值開始明顯增長，且增長速度較快；之后菌株生長濁度波動較平穩(wěn)，說明菌株開始進(jìn)入平穩(wěn)期。由于對數(shù)生長期的細(xì)菌形態(tài)相對穩(wěn)定、生物活性高且繁殖能力強，因此后續(xù)均采用對數(shù)生長期的菌體進(jìn)行接種試驗。

2.3.2 Bacillus funiculus A2的溫度耐受性

四川麩醋醋醅發(fā)酵一般控制在45 ℃以下，探究菌株的溫度耐受性對菌株的應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。由圖5中b可知，Bacillus funiculus A2在21～45 ℃生長能力較強，菌株的OD600值均大于1.0，37 ℃為該菌株的最適生長溫度，最高耐受溫度可達(dá)到69 ℃，這與大多數(shù)報道的解淀粉芽孢桿菌情況相似[19]。

2.3.3 Bacillus funiculus A2的乙醇、pH耐受性分析

在食醋釀造過程中，醋酸菌以乙醇為底物，氧化形成醋酸，從而形成了食醋的主體呈酸味物質(zhì)。因此，研究Bacillus funiculus A2菌株的乙醇耐受性、pH（乙酸調(diào)節(jié)）耐受性，可預(yù)判菌株在麩醋釀造過程中的生長情況。由圖6中a可知，該菌株能夠耐受9 mL/100 mL的乙醇，而為保障食醋釀造過程的正常進(jìn)行，一般要求乙醇濃度控制在8%以下，傳統(tǒng)麩醋因“三邊”同時發(fā)酵，醋醅中酒精濃度更低（＜2%）[20]，說明Bacillus funiculus A2菌株具有適應(yīng)麩醋釀造環(huán)境的潛力。由圖6中b可知，菌株能夠在pH＞3.5的條件下生長，具有較強的酸耐受性，能夠很好地適應(yīng)麩醋的發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)境，過高的酸性也會抑制其生長。

2.4 目的菌株對麩醋發(fā)酵醋醅理化特性的影響

2.4.1 接種Bacillus funiculus A2對四川麩醋醋醅含水量的影響

由圖7可知，從整個模擬麩醋釀造過程來看，接種不同濃度的Bacillus funiculus A2對麩醋醋醅水分含量的影響不大，含水量在64.3%～71.8%之間上下波動[21]，各階段的水分含量總體差異不大。在0～8 d各組含水量呈上升趨勢，可能是由于發(fā)酵初期原料豐富且微生物處于生長旺盛階段，代謝生成部分水，導(dǎo)致含水量上升。8～20 d含水量逐漸呈下降趨勢，醋醅發(fā)酵中后期，一方面因為微生物進(jìn)入次級代謝產(chǎn)物累積階段，代謝活動減緩；另一方面是醋醅在環(huán)境中因蒸發(fā)作用造成水分逐漸流失[22]。

2.4.2 接種Bacillus funiculus A2對四川麩醋醋醅乙醇含量的影響

由圖8可知，Bacillus funiculus A2接種量對麩醋醋醅中酒精發(fā)酵有顯著的影響，具體表現(xiàn)為發(fā)酵第4天時5%、10%和15%接種量組乙醇含量下降，這可能是由于產(chǎn)生的酒精在醋酸菌的作用下開始產(chǎn)生醋酸（見圖9），且接種量越大，環(huán)境中乙醇轉(zhuǎn)化成醋酸越多，所以乙醇含量逐漸下降。對照組（0%接種量組）乙醇含量變化不大，可能是由于環(huán)境營養(yǎng)物質(zhì)充足，酵母利用還原糖產(chǎn)生了酒精[20]。4 d后所有組的乙醇含量均相對穩(wěn)定，但對照組和5%接種量組乙醇含量明顯高于10%和15%接種量組，結(jié)合不同接種量的Bacillus funiculus A2對醋醅中乙酸含量的影響（見圖9）可知10%和15%接種量組的總酸含量明顯高于對照組和5%接種量組，由此可推測隨著Bacillus funiculus A2接種量的增加，可能是乙醇氧化成乙酸過程中酸化代謝得到增強，醋醅多邊發(fā)酵平衡被打破，致使醋醅乙醇含量減少[21]。

2.4.3 接種Bacillus funiculus A2對四川麩醋醋醅總酸含量和pH的影響

由圖9可知，接種Bacillus funiculus A2后，發(fā)酵醋醅中總酸含量均呈現(xiàn)上升的趨勢，且接種量越大，總酸形成越快。在發(fā)酵前4 d各組總酸含量增加較快，且10%和15%接種量組的總酸含量明顯大于對照組和5%接種量組，可能是由于發(fā)酵前期產(chǎn)酸微生物的生長和代謝活動旺盛，這些微生物適應(yīng)環(huán)境并大量繁殖，不僅將乙醇氧化成乙酸，而且將其他化合物氧化，導(dǎo)致總酸含量迅速增加[23]。同時接種量越大，水解生料淀粉芽孢桿菌降解的淀粉越多，從而可以積累更多的還原糖，而生成的還原糖不斷地轉(zhuǎn)化成各種酸性物質(zhì)。第4天后對照組和5%接種量組總酸含量的增加明顯減慢，而10%和15%接種量組總酸含量已達(dá)到相對穩(wěn)定，可能是由于發(fā)酵過程中原料的不斷利用，環(huán)境中積累了大量酸性物質(zhì)，致使微生物不利于生存在高酸度、低營養(yǎng)的環(huán)境中，且接種量越大，環(huán)境中的酸性物質(zhì)積累越多。對照組和5%接種量組在第8天后總酸含量達(dá)到相對穩(wěn)定。發(fā)酵第16～20天總酸含量處于上升階段，可能是由于前期積累的還原糖轉(zhuǎn)化成乙酸。

由圖10可知，發(fā)酵起始時（0 d）醋醅的pH較高，可能是由于此時才加入醋曲，大量的乙醇還未在醋酸菌的作用下轉(zhuǎn)化成乙酸，第4天時醋酸菌利用乙醇產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，4～20 d pH在4.1～4.5之間波動，說明在發(fā)酵過程中四川麩醋形成了一個緩沖體系，使pH始終處于動態(tài)平衡中[24]。

2.4.4 接種Bacillus funiculus A2對四川麩醋醋醅還原糖含量的影響

由圖11可知，接種Bacillus funiculus A2后，發(fā)酵初期（0～4 d），醋醅中還原糖含量增量明顯高于對照組，結(jié)合醋醅淀粉含量變化結(jié)果（見圖12）可推測原因是大量的淀粉被降解，及時被微生物利用，導(dǎo)致還原糖含量增加。但隨著發(fā)酵的持續(xù)（4 d后），醋醅中還原糖含量逐漸減少，一方面是醋醅發(fā)酵體系中還原糖被轉(zhuǎn)化成乙醇[25]，另一方面可能是醋醅發(fā)酵末期發(fā)酵體系中次級代謝產(chǎn)物累積、酸度增加，微生物代謝、酶活性受到抑制，使得淀粉轉(zhuǎn)化成還原糖的能力減弱。直至發(fā)酵結(jié)束，醋醅發(fā)酵體系中還原糖含量大小仍為15%接種量組＞10%接種量組＞5%接種量組＞對照組，由此可以得出水解生料淀粉芽孢桿菌接種量的增加會促進(jìn)淀粉的利用，從而生成更多的還原糖。此外，10%接種量組和15%接種量組還原糖含量接近，表明繼續(xù)增加Bacillus funiculus A2的接種量對麩醋發(fā)酵體系淀粉水解的貢獻(xiàn)度不大，另外，增加該菌株的接種量還會增加菌株本身不悅氣味的風(fēng)險。

2.4.5 接種Bacillus funiculus A2對四川麩醋醋醅淀粉含量的影響

由圖12可知，在麩醋醋醅發(fā)酵過程中接種Bacillus funiculus A2后，體系各階段的殘余淀粉含量均低于對照組，且菌株接種量越大，殘余淀粉含量越少。醋醅發(fā)酵20 d后，各組淀粉含量相較于0 d時均下降了31.68%以上，15%接種量組相較于對照組淀粉利用率提高了近23.78%。但各組的總酸和pH變化較接近，原因可能是Bacillus funiculus A2接種量增加，淀粉水解后的營養(yǎng)成分被其他微生物所利用，沒有用于酸類物質(zhì)的增量發(fā)酵，或生成了高級有機(jī)酸，亦或轉(zhuǎn)化成其他風(fēng)味物質(zhì)，有待證明。此外，15%接種量組和10%接種量組醋醅殘余淀粉量接近，還原糖含量亦接近，進(jìn)一步說明了繼續(xù)增加Bacillus funiculus A2的接種量對提高麩醋發(fā)酵體系淀粉利用率的意義不大。

2.5 接種Bacillus funiculus A2對四川麩醋醋醅理化特性影響的聚類分析

為進(jìn)一步明確Bacillus funiculus A2菌株對麩醋發(fā)酵過程中理化特性的影響，借助Origin軟件對發(fā)酵結(jié)束的醋醅理化結(jié)果進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖13。

發(fā)酵結(jié)束的醋醅樣品被分為兩大類，對照組與5%接種量組聚在同一分支上，表明二者的理化特性相近，接種5%的Bacillus funiculus A2菌株對麩醋釀造體系理化特性的影響較小，卻能提高其淀粉利用率；另外，10%接種量組和15%接種量組聚在同一分支上，說明當(dāng)Bacillus funiculus A2接種量超過10%后，增加接種量對麩醋釀造體系的理化特性影響不顯著。綜上所述，接種10%的Bacillus funiculus A2菌株對麩醋發(fā)酵提高淀粉利用率有顯著作用。

3 結(jié)論

Bacillus funiculus A2是一株從高酸性環(huán)境——四川麩醋醋醅中分離得到的桿狀革蘭氏陽性菌（G+），能分泌較高酶活力的生料淀粉酶水解生料淀粉。其生長速度快（16 h達(dá)到穩(wěn)定期），在乙醇含量9%、溫度69 ℃、pH 3.5的環(huán)境中仍能保持較高的生物活性。接種Bacillus funiculus A2菌株模擬四川麩醋發(fā)酵，結(jié)果表明該菌株對四川麩醋發(fā)酵過程中醋醅水分含量、pH、總酸含量和還原糖含量的影響可以忽略，但增加其接種量能加速麩醋發(fā)酵體系中乙醇的氧化，同時提高淀粉的利用率。

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