摘要：本研究從重慶榮昌某養(yǎng)鴨場(chǎng)疑似患鴨疫里氏桿菌的病死鴨體內(nèi)采取病料，經(jīng)分離純化后，獲得一株細(xì)菌，采用生化試驗(yàn)和16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，分離株的生化試驗(yàn)符合鴨疫里氏桿菌的特性，16S rRNA基因序列與RA strain1120的同源性達(dá)到99.7%，確定該分離菌為鴨疫里氏桿菌。雛鴨致病性試驗(yàn)，試驗(yàn)組肌肉注射分離菌液0.2 mL（2.6×108 CFU），接種3 d后，雛鴨出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，7 d后，雛鴨全部死亡。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)慶大霉素、頭孢氨芐、多西環(huán)素、卡那霉素、氨芐西林等多種藥物耐藥。

關(guān)鍵詞：鴨疫里氏桿菌；16S rRNA；同源性；藥敏試驗(yàn)

鴨疫里氏桿菌病是鴨、雞等禽類(lèi)的一種急性高度接觸性傳染病，主要侵害1～2月齡特別是1月齡內(nèi)的雛鴨，其發(fā)病率和死亡率都較高，分別可達(dá)90%和75%以上[1]。感染后，病鴨出現(xiàn)食欲減退或不食，呼吸道癥狀，口鼻有黏性汁液流出，關(guān)節(jié)腫大，跛行[2]，排黃綠色稀糞并有神經(jīng)癥狀等[3]，該病存在于我國(guó)各養(yǎng)鴨地區(qū)并呈全球流行性，給我國(guó)以及世界各養(yǎng)鴨國(guó)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展都造成了重創(chuàng)。

鴨疫里氏桿菌病的病原鴨疫里氏桿菌（riemerella anatipestifer，RA）隸屬于里默桿菌屬，為革蘭氏陰性菌，菌體呈多形態(tài)，如小桿狀、橢圓形以及長(zhǎng)絲狀，無(wú)鞭毛，不形成芽孢。RA的生長(zhǎng)需要較高的營(yíng)養(yǎng)條件，在巧克力瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，若接種于普通培養(yǎng)基上則不會(huì)生長(zhǎng)。RA的血清型共有21種，命名為血清1-21型，程安春等[4]于二十世紀(jì)初，通過(guò)研究又發(fā)現(xiàn)了RA的四種新的血清型。目前，在我國(guó)流行的有血清1-8型以及10、11、13、14型。

近年來(lái)，抗生素廣泛用于細(xì)菌性傳染病的治療，在其發(fā)揮治療作用的同時(shí)，由于其在臨床上的濫用，已造成了嚴(yán)重耐藥性的發(fā)生，其中關(guān)于鴨疫里氏桿菌抗藥的報(bào)道也逐漸增多，因此對(duì)該菌進(jìn)行耐藥性鑒定有利于為臨床用藥提供依據(jù)[5]。

1 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)動(dòng)物和材料

1）試驗(yàn)動(dòng)物：10日齡健康雛鴨（櫻桃谷鴨）購(gòu)自重慶永健生物技術(shù)有限公司，所有試驗(yàn)用鴨經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)為鴨疫里氏桿菌陰性。

2）主要試劑：鮮血瓊脂培養(yǎng)基；巧克力瓊脂培養(yǎng)基；馬丁肉湯；LB營(yíng)養(yǎng)肉湯；抗菌藥物藥敏紙片；細(xì)菌生化管；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒；PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒；引物；DNA膠回收試劑盒；DNA Marker；核酸染色劑；10×Loading Buffer購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1）病料來(lái)源與采集。重慶榮昌某養(yǎng)鴨場(chǎng)3～6周齡的鴨發(fā)病，死亡率達(dá)12%。無(wú)菌操作，從該鴨場(chǎng)病死鴨采集病料。

2）病原分離。將病樣接種于巧克力瓊脂平板上，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，勾取疑似的單個(gè)菌落進(jìn)行下一步純化，最后獲得純化菌株，命名為RA40，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

3）形態(tài)學(xué)觀察。將RA40培養(yǎng)于巧克力瓊脂平板中，置于37 ℃恒溫箱中，48 h后觀察其生長(zhǎng)狀況、菌落特性。勾取培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落涂片，經(jīng)革蘭氏染色，通過(guò)鏡檢，對(duì)細(xì)菌形態(tài)特點(diǎn)進(jìn)行觀察記錄。

4）生化試驗(yàn)。分離菌株分別進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖）、吲哚試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)等，置于37 ℃恒溫箱48 h，觀察并記錄結(jié)果。

5）16S rRNA基因的擴(kuò)增及測(cè)序。挑取細(xì)菌的單個(gè)菌落接種至5 mL LB營(yíng)養(yǎng)肉湯，37 ℃振蕩培養(yǎng)48 h。根據(jù)細(xì)菌基因組提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行細(xì)菌基因組提取，PCR擴(kuò)增16S rRNA基因。PCR擴(kuò)增采用25 μL體系：Premix Ex Taq12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板DNA 4 μL，ddH2O 6.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，經(jīng)35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳，將結(jié)果截圖保存；PCR產(chǎn)物按照PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行膠回收，并將回收產(chǎn)物交由生物公司對(duì)細(xì)菌的基因組進(jìn)行測(cè)序。

6）致病性試驗(yàn)。取一周齡健康雛鴨10只隨機(jī)分成2組，一組為試驗(yàn)組，肌肉注射分離菌培養(yǎng)菌液0.2 mL（2.6×108 CFU） ，另一組為空白對(duì)照組，分別隔離飼養(yǎng)、觀察并記錄雛鴨的生理狀況。

7）藥敏試驗(yàn)。用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，吸取30 μL菌液（2.6×108 CFU），均勻涂布于巧克力瓊脂平板表面，待完全吸收后，將各藥敏片貼附在平板的合適位置。置于37 ℃培養(yǎng)箱中48 h，觀察抑菌情況。判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）藥敏紙片擴(kuò)散法規(guī)則標(biāo)準(zhǔn)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 培養(yǎng)特性及形態(tài)學(xué)觀察

RA40菌株于37 ℃培養(yǎng)48 h，在巧克力瓊脂平板上，呈圓形、凸起、邊緣整齊、光滑透明的菌落（圖1）。革蘭氏染色為陰性菌，菌體呈桿狀、橢圓等多種形態(tài)。單個(gè)或成雙存在（圖2）。

2.2 生化鑒定結(jié)果

2.3 16S rRNA基因擴(kuò)增及測(cè)序

經(jīng)16S rRNA基因擴(kuò)增，獲得凝膠電泳片段與目的片段大小相符（圖4）。PCR產(chǎn)物根據(jù)PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟，進(jìn)行膠回收，再送至生物公司進(jìn)行細(xì)菌基因測(cè)序。

2.4 細(xì)菌的基因序列鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)16S rRNA基因的測(cè)序，獲得大小為1 420 bp的基因序列（見(jiàn)附錄），通過(guò)NCBI的Blast檢索系統(tǒng)，選擇與其相關(guān)性較高的序列，通過(guò)DNA star軟件進(jìn)行同源性分析（圖4）和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建（圖5）。發(fā)現(xiàn)該分離菌株與RA strain-11202的同源性達(dá)99.7%，說(shuō)明該分離菌為鴨疫里氏桿菌。

2.5 致病性試驗(yàn)結(jié)果

接種3d后，雛鴨出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，表現(xiàn)為精神萎靡、食欲不振、不愿走動(dòng)、下痢等。接種7 d后，雛鴨全部死亡，剖檢可發(fā)現(xiàn)氣囊、心包、肝周病變。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 分析與討論

本研究從重慶榮昌某鴨場(chǎng)病死鴨采集病料，分離純化得到一株細(xì)菌，對(duì)該菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定和生化試驗(yàn)，初步判斷為鴨疫里氏桿菌。為了進(jìn)一步得到確切的結(jié)果，可使用現(xiàn)代分子生物技術(shù)。目前，16S rRNA基因序列測(cè)定技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于細(xì)菌的鑒定。通過(guò)該技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增、電泳、測(cè)序，同時(shí)將所測(cè)得的基因序列通過(guò)NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行同源性分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，結(jié)果如圖5、圖6顯示，RA40與RA strain11202同源性最高，為99.7%，因此確定該菌株為鴨疫里氏桿菌。

通過(guò)藥敏試驗(yàn)篩選出病原菌的敏感藥物是臨床治療傳染病的重要原則。藥敏試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA40對(duì)慶大霉素、多西環(huán)素、卡那霉素、氨芐西林、頭孢氨芐等抗菌藥物耐藥，僅對(duì)四環(huán)素、紅霉素等幾種藥物敏感。本次試驗(yàn)結(jié)果表明RA已呈現(xiàn)出多重耐藥，且與已有研究報(bào)道的藥物敏感結(jié)果有一定的差異。因此，在實(shí)際臨床治療的過(guò)程中，應(yīng)該嚴(yán)格地開(kāi)展藥物篩選，合理用藥，以保證療效和避免耐藥性的產(chǎn)生。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從榮昌某發(fā)病鴨場(chǎng)病死鴨采集病料，分離純化得到一株細(xì)菌，采用生化試驗(yàn)和16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)進(jìn)行分析，鑒定出該菌株為鴨疫里氏桿菌。致病性試驗(yàn)結(jié)果表明小劑量RA菌液即可導(dǎo)致一周齡雛鴨全部死亡。藥敏試驗(yàn)鑒定發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)慶大霉素、多西環(huán)素、卡那霉素、氨芐西林、頭孢氨芐等抗菌藥物耐藥，僅對(duì)四環(huán)素、紅霉素等幾種藥物敏感。

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