摘" 要： 旨在探究奶源大腸桿菌是否存在異質性耐藥現(xiàn)象，對異質性耐藥大腸桿菌及其耐藥亞群的生物學特性進行研究，探究其可能的異質性耐藥機制。本研究采用微量肉湯稀釋法測定從生牛乳中分離得到的1 株大腸桿菌 D1的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），采用 K-B 紙片擴散法對大腸桿菌的異質性耐藥情況進行初篩，采用菌落譜型分析（population analysis profile，PAP）進行確證，并通過耐藥穩(wěn)定性測試和生物膜試驗探究大腸桿菌的異質性耐藥特征，最后通過全基因組測序和重測序分析產(chǎn)生異質性耐藥的機制。結果發(fā)現(xiàn)，該株大腸桿菌對多黏菌素E表現(xiàn)為中介，對磺胺異惡唑耐藥，對其余抗生素表現(xiàn)為敏感，K-B 紙片擴散法篩出 2 種大腸桿菌-抗菌藥物異質性耐藥組合。PAP 確證顯示，D1-阿莫西林-克拉維酸的 MIC/最高非抑菌濃度（maximum noninhibitory concentration，MNIC）的比值為 8 ，耐藥亞群的發(fā)生頻率為 2.45×10-6，確證為多西環(huán)素異質性耐藥菌株。傳代穩(wěn)定性表明耐藥亞群不能穩(wěn)定遺傳，而生長試驗不存在生長滯后現(xiàn)象，耐藥亞群的生物膜產(chǎn)量極顯著大于親本菌株。全基因組測序結果發(fā)現(xiàn)，耐藥亞群與親本菌株之間存在基因突變，而突變基因 txR 是一種特定的轉錄調節(jié)因子，可能導致大腸桿菌對多西環(huán)素產(chǎn)生異質性耐藥。奶源大腸桿菌存在多西環(huán)素異質性耐藥的現(xiàn)象，提示臨床中應合理使用多西環(huán)素抗生素，因此在使用多西環(huán)素進行臨床治療時應更加注意異質性耐藥的發(fā)生，需采用有效的檢測方法，為臨床防控和合理使用抗生素提供指導。

關鍵詞： 奶源大腸桿菌；異質性耐藥；耐藥亞群；全基因組

中圖分類號：S852.612

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5813-12

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.043

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

收稿日期：2024-06-04

基金項目：自治區(qū)天山英才項目（2023TSYCCX0034）；國家自然科學基金（32060797）；自治區(qū)重大科技專項資助項目（2022A02006-3-2）

作者簡介：高姣姣（1999-），女，陜西榆林人，碩士生，主要從事乳品病原微生物研究，E-mail：2816996289@qq.com

*通信作者：趙艷坤，主要從事奶及奶制品營養(yǎng)與安全研究，E-mail：yankunzhao90@163.com

Characterization of Heterogeneous Drug-resistant Escherichia coli and Its Drug-resistant Subpopulations from Milk Sources

GAO" Jiaojiao1，2， ZHENG" Nan3， SHAO" Wei1， CHEN" He2， MA" Xianlan2， ZHAO" Yankun1，2，3*

（1.Xinjiang Meat and Milk Herbivore Nutrition Laboratory， College of Animal Science， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China;

2.Ministry of Agriculture and Rural Affairs Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-Products， Key Laboratory of Agro-Products Quality and Safety of Xinjiang， Institute of Quality Standards amp; Testing Technology for Agro-Products， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830091，" China;

3.Key Laboratory for Quality amp; Safety Control for Milk and Dairy Products of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193，" China）

Abstract：" The aim of this study was to investigate whether heteroresistance exists in milk-derived Escherichia coli， and to characterize the biology of heteroresistance E. coli and its resistant subgroups， in order to explore possible heteroresistance mechanisms.The minimum inhibitory concentration （MIC） of one E. coli strain named D1 which isolated from raw cow's milk was determined by micro broth dilution method. The heteroresistance of E. coli was initially screened by the K-B paper diffusion method， and confirmed by the population analysis profile （PAP）， and the heteroresistance characteristics of E. coli were investigated by resistance stability test and biofilm assay， finally， the mechanism of heterogeneous resistance was analyzed by whole genome sequencing and resequencing. The results showed that this E. coli was intermediary to polymyxin E， resistant to sulfisoxazole， and showed sensitivity to the rest of the antibiotics， and two E. coli-antimicrobial heteroresistance combinations were screened out by K-B paper diffusion assay.PAP confirmation showed that the MIC/maximum noninhibitory concentration （MNIC） ratio of E. coli was 8， and the occurence frequency of the resistant subgroups was 2.45×10-6， confirming D1 to be a heteroresistance doxycycline-resistant strain. The stability of transmission showed that the resistant subpopulation could not be inherited stably， while there was no growth lag in the growth test， and the biofilm production of the resistant subpopulation was significantly greater than that of the parental strain. Whole genome sequencing revealed that there was a gene mutation between the resistant subpopulation and the parental strain， and the mutant gene txR is a specific transcriptional regulator that may lead to heteroresistance to doxycycline in E. coli. In conclusion， the existence of heteroresistance to doxycycline in E. coli from milk sources suggests that doxycycline antibiotics should be used rationally in the clinic， therefore， more attention should be paid to the occurrence of heteroresistance when using doxycycline in clinical treatment， and effective detection methods need to be used to provide guidance for clinical prevention and control and rational use of antibiotics.

Key words： milk-derived Escherichia coli; heteroresistance; resistant subgroups; whole genome

*Corresponding author： ZHAO Yankun，E-mail：yankunzhao90@163.com

大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli），又叫大腸埃希菌，是腸桿菌科埃希菌屬的一個物種。E.coli 是一種革蘭陰性的條件致病菌，主要引起奶牛乳腺炎和犢牛瀉腹［1-2］。在臨床實踐中，抗生素通常用來治療E. coli疾病，其中治療E. coli感染的常用抗生素有氟苯尼考、氨芐西林、多西環(huán)素等，多西環(huán)素是使用較為廣泛的四環(huán)素類藥物［3-4］。但由于抗菌藥物的不合理使用，導致E. coli的耐藥性增加，使得抗菌藥物治療效果降低，對E. coli疾病的控制和公共衛(wèi)生安全構成了重大威脅［5］。同時抗菌藥物的殘留對奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失［6］。此外，已有報道E. coli對磷霉素［7］、黏菌素［8］、β-內酰胺類/β-內酰胺酶抑制劑［9-10］存在異質性耐藥（heteroresistance，HR）。

異質性耐藥是指在一個細菌菌群中的一個亞群能夠在抗生素濃度至少比最低抑菌濃度高8倍的情況下生長，且不影響優(yōu)勢亞群的生長［11-13］。當選用根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的肉湯稀釋法篩選的“敏感”藥物治療時，會導致HR細菌中的部分耐藥細菌亞群無法徹底清除，進而發(fā)展成為完全耐藥菌株［14］。HR是抗藥性發(fā)展到臨床耐藥性的中間階段，也是臨床抗菌藥物治療失敗的主要原因之一。近年來，越來越多的試驗證明，細菌群中存在少量耐藥亞群會導致抗生素治療失敗，并可能與疾病治療失敗有關［12，15］。然而，對四環(huán)素類大腸桿菌異質性耐藥的研究較少，大多研究集中在大腸桿菌對于黏菌素類抗生素的異質性耐藥［16-18］。對于奶源中 E. coli的異質性耐藥流行情況的相關報道較少，其異質性耐藥機制也尚不明確。因此，深入分析奶源E. coli的異質性耐藥流行情況對于有效預防和控制奶牛源大腸桿菌感染尤為重要。

為探究奶源中E. coli的HR現(xiàn)象和相關耐藥特征，本研究選取從生牛乳中分離的1株E. coli進行耐藥性檢測，采用紙片擴散法對E. coli進行HR的初篩，PAP法進行確證，并開展耐藥穩(wěn)定性測定和生物膜試驗探究E. coli的HR特征，通過全基因組測序分析HR菌株，為臨床治療E. coli感染提供有效的借鑒和幫助。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 試驗菌株

標準菌株：大腸桿菌 ATCC25922；試驗菌株：大腸桿菌 D1 由本實驗室2022年在湛江燕塘澳新牧業(yè)采集的生鮮乳樣本中分離鑒定并保存。

1.1.2" 主要試劑與儀器

麥康凱培養(yǎng)基、LB 肉湯、Mueller-Hinton 瓊脂培養(yǎng)基（MHA）、0.85% 生理鹽水（每支9 mL）均購自北京陸橋技術股份有限公司；藥敏板、Kirby-Bauer（K-B）藥敏紙片購自一諾康（天津）生物科技有限公司；一次性接種環(huán)、培養(yǎng)皿、“L”型涂布棒、離心管、移液槍、購自新疆鼎峰生物科技有限公司。電子天平、濁度儀、電熱恒溫培養(yǎng)箱、立式壓力蒸汽滅菌鍋、臺式高速離心機等。

1.2" 方法

1.2.1" 藥物敏感性試驗

根據(jù) CLSI［19］測試 D1 菌株對 16 種抗菌藥物的敏感性。用麥氏濁度儀調整菌液至 0.5 麥氏濁度，接種至含有不同濃度藥物的 96 孔板中，測試以下抗菌藥物：氨芐西林（ampicillin，AMP）、阿莫西林-克拉維酸（amoxicillin/clavulanic acid，AMC）、頭孢噻吩（cephalothin，CEP）、頭孢噻呋（ceftiofur，CET）、美羅培南（meropenem，MEC）、鏈霉素（straptomycin，S）、卡那霉素（kanamycin，K）、慶大霉素（gentamicin，CN）、四環(huán)素（tetracycline，TET）、多西環(huán)素（doxycycline，DO）、氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)FC）、多黏菌素E（polymyxinE，PE）、利福昔明（Rifaximin，RIF）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、磺胺異惡唑（sulfisoxazole，SIZ）和復方新諾明（sulfamethoxazole，SXT）。將藥敏板放置于 35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 18～20 h，凡細菌生長的小孔中，呈彌散狀渾濁或圓形沉淀，在無細菌生長的孔內所含最低抗菌藥物濃度即最低抑菌濃度（MIC），空白對照孔應無細菌生長。測量 MIC 值，判定結果分為敏感、中介或耐藥，折點判定參照 CLSI。

1.2.2" K-B 藥敏試驗

用無菌接種環(huán)挑取新鮮菌落接種到0.85%的生理鹽水中，震蕩均勻，調制成0.5麥氏濁度（1×108 CFU·mL－1）的菌懸液，吸取 100 μL 菌懸液接種于 MHA 平板上，用“L”型涂布棒將培養(yǎng)基表面涂均勻，至培養(yǎng)基表面完全干燥，用無菌鑷子夾取藥敏紙片貼到平板中心位置。將貼有藥敏紙片的平板倒置于培養(yǎng)箱內，控制溫度范圍為 37± 1 ℃，培養(yǎng) 18～24 h后，觀察結果。如果培養(yǎng)基表面抑菌圈內出現(xiàn)明顯的菌落生長則判定為疑似異質性耐藥。

1.2.3" 菌落譜型分析（population analysis profile，PAP）

利用 PAP 法，依次制備抗生素濃度為 0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg·mL－1 的 MHA 平板，用無菌接種環(huán)挑取新鮮菌落接種于0.85%的生理鹽水中，震蕩均勻，調制成0.5麥氏濁度（1×108 CFU·mL－1）的菌懸液，然后進行梯度稀釋，分別稀釋成 103、104、105、106、107 和 108 的菌懸液。將不同梯度的菌懸液分別接種到不同抗生素濃度的 MHA 平板上，用“L”型涂布棒涂布均勻，每個梯度設置兩個平行。將接種菌懸液并涂布均勻的 MHA 平板倒置于 37 ℃± 1 ℃ 的培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)24～48 h。從培養(yǎng)箱取出抗生素平板，對每個平板上生長的菌落進行計數(shù)，再根據(jù)之前的稀釋倍數(shù)換算成實際生長的菌落數(shù)，以抗生素濃度（μg·mL－1）為橫坐標，lg（CFU·mL－1）為縱坐標進行作圖，若 MIC 與最高非抑菌濃度（MNIC）的比值大于 8，且耐藥亞群頻率大于 1×10-7，則可以確認為是HR菌株［12］。對照菌株為大腸桿菌標準菌株 ATCC25922。

1.2.4" 耐藥亞群穩(wěn)定性測試

將最高抗生素濃度下生長的菌落接種在不含抗生素的 MHA 平板上，傳代 30代，每傳代5代測一次最低抑菌濃度。觀察耐藥亞群穩(wěn)定性的變化情況，若仍然保持耐藥表型即為穩(wěn)定異質性耐藥菌株，若恢復敏感即為不穩(wěn)定異質性耐藥菌株。

1.2.5" 生長曲線測試

生長試驗是為了觀察親本菌株與耐藥亞群在相同培養(yǎng)條件下生長速度是否存在顯著差異，以此來鑒別異質性耐藥亞群是否存在生長滯后的現(xiàn)象。將異質性耐藥菌株及其亞群的單菌落接種到 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min－1 培養(yǎng)過夜。先制備濃度為1×107 CFU·mL－1 的菌懸液，吸取10 μL加入每孔含有100 μL LB肉湯的96孔板中，37 ℃、180 r·min－1搖床上孵育，每隔1 h測1次OD600值，共測定24 h，根據(jù)OD600值繪制生長曲線，比較生長速率，重復3次。

1.2.6" 生物膜試驗

分別取培養(yǎng)過夜的異質性耐藥親本菌株和亞群，稀釋 50 倍后，接種到含有 LB 肉湯的玻璃試管中，LB 肉湯為陰性對照，設置3個平行試驗，37 ℃ 靜置培養(yǎng) 24 h。使用酶標儀測量 OD600，以確定總生物量。使用 PBS 緩沖液洗滌3次，倒置晾干，結晶紫草酸銨染色 15 min，單蒸水沖洗后晾干；每孔加入 150 μL 95% 酒精，室溫反應 30 min，并測定每個樣品的 OD570。將生物膜形成確定為 OD570/OD600 比率，以此測試樣品之間的生長差異最小化。試驗每組設置3個平行。統(tǒng)計學顯著性（P≤0.05）通過獨立 t 檢驗，以 P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

1.2.7" 全基因組測序

將大腸桿菌在麥康凱平板上進行劃線，挑取菌落接種到 LB 肉湯中 37 ℃ 培養(yǎng) 16 h，5 000 r·min－1 室溫離心 5 min 收集菌體，棄上清保留沉淀菌體，加入無菌水清洗1～2次，然后轉移到離心管。將菌體送至美吉生物科技有限公司進行測序。

將基因的氨基酸序列與各數(shù)據(jù)庫進行比對，得到對應的功能注釋信息。對大腸桿菌分離株進行基礎注釋分析，包括 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫、Gene Ontology（GO）數(shù)據(jù)庫、Cluster of Orthologous Groups of proteins（COG）數(shù)據(jù)庫；進行特定基因功能分析，包括 Virulence Factors of Pathogenic Bacteria（VFBD）毒力因子注釋分析、The Comprehensive Antibiotic Resistance Database（CARD）綜合性抗菌藥物耐藥性數(shù)據(jù)庫注釋、Transporter Classification Database（TCDB）轉運蛋白分類數(shù)據(jù)庫分析、Pathogen Host Interactions（PHI）病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫注釋、Carbohydrate-Active enZYmes Database（CAZy）碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫；進行比較基因組分析、SNP 和 InDel 注釋分析、遺傳進化分析。

2" 結" 果

2.1" 藥物敏感性測定結果

對E. coli D1 菌株進行16 種抗菌藥物的藥物敏感性試驗，發(fā)現(xiàn)D1菌株對氨芐西林、阿莫西林-克拉維酸、頭孢噻呋、美羅培南、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、復方新諾明表現(xiàn)為敏感，對多黏菌素 E 表現(xiàn)為中介，對磺胺異惡唑表現(xiàn)為耐藥，結果見表1。

2.2" 異質性耐藥初篩結果

根據(jù)耐藥性的判定結果，選擇 D1 菌株對抗菌藥物表現(xiàn)為敏感的抗生素進行異質性耐藥的初篩。結果共計篩出2種大腸桿菌-抗菌藥物異質性耐藥組合，即 E.coli D1 對多西環(huán)素和阿莫西林-克拉維酸疑似異質性耐藥（圖1）。

2.3" 異質性耐藥確證結果

將異質性耐藥疑似菌株和標準菌株大腸桿菌 ATCC25922 同時用 PAP 法驗證菌株是否為異質性耐藥，結果如圖 2，D1-多西環(huán)素的MIC為128，MNIC為 16，MIC/MNIC的比值為8，且在多西環(huán)素濃度為128 μg·mL－1（最高濃度且有菌落生長）平板上的菌落數(shù)與無抗生素平板上的菌落數(shù)相比得到耐藥亞群的發(fā)生頻率為 2.45×10-6，大于 1.0×10-7，判定 D1 為多西環(huán)素異質性耐藥菌株；D1-阿莫西林克拉維酸的 MIC 為16，MNIC為8，比值為2，所以判定 D1-阿莫西林克拉維酸不是異質性耐藥菌株。

2.4" 異質性耐藥菌株的耐藥穩(wěn)定性

挑取最高抗菌藥物濃度平板上生長的菌，即為耐藥亞群，在無抗菌藥物濃度的平板上傳代30次，每5代測定1次MIC值，耐藥亞群D1-R的第一代從128 μg·mL－1多西環(huán)素培養(yǎng)基上挑取，在無抗生素的培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)。結果顯示耐藥亞群D1-R的初始MIC值為 2 μg·mL－1，D1-R在第一代就恢復為敏感表型，表現(xiàn)出極不穩(wěn)定的異質性耐藥表型，但MIC值仍為親本菌株D1的8倍。

2.5" 生長適應性代價

生長曲線試驗結果表明，親本菌株 D1 與耐藥亞群 D1-R 的生長速率無顯著差異（圖3）。本結果表明該現(xiàn)象并非緩慢生長的持留菌現(xiàn)象，耐藥亞群較其親本菌株未表現(xiàn)出明顯的生長滯后現(xiàn)象。

2.6" 生物被膜測定

生物被膜的產(chǎn)生量也是細菌產(chǎn)生耐藥的主要原因之一，因此，明確異質性耐藥菌株和其亞群的生物被膜生成能力是否發(fā)生變化，可以提供有關的耐藥性的信息。通過生物被膜的產(chǎn)量的定量分析，耐藥亞群 D1-R 的生物膜產(chǎn)量極顯著大于親本菌株 D1（圖 4）。

2.7" 全基因組測序分析

2.7.1" 基因組基本特征分析結果

D1 株基因組大小為 5 088 075 bp，基因組 GC 含量為50.84%，預測到編碼基因有4 816 個，編碼基因總長度為4 440 414 bp，串聯(lián)重復序列有 53 個，tRNA 基因有89個，rRNA基因有22個，還預測到D1存在24個基因島和7個前噬菌體，并且繪制了D1的基因組圈圖（圖5）。

2.7.2" 基因功能注釋分析

2.7.2.1" COG數(shù)據(jù)庫注釋結果：將D1的基因編碼蛋白序列與COG數(shù)據(jù)庫進行比對，總共注釋到24種功能的4 042個基因，有COG注釋的基因占所有基因的83.93%。編碼碳水化合物的運輸和代謝（Carbohydrate transport and metabolism）相關功能基因是最多的，有417個；編碼氨基酸轉運和代謝（Amino acid transport and metabolism）相關功能基因有381個；編碼轉錄（Transcription）相關功能基因有334個，具體結果如圖6A所示。

2.7.2.2" GO數(shù)據(jù)庫注釋結果：將D1的基因編碼蛋白序列與GO數(shù)據(jù)庫進行比對，D1中共有3 825個基因得到注釋，占所有基因的79.42%。其中生物過程中調控DNA觸發(fā)的轉錄（regulation of DNA-templated transcription）和磷酸化（phosphorylation）是基因富集程度最高的2個途徑；細胞組成中膜的組成部分（integral component of membrane）和質膜（plasma membrane）是基因富集程度最高的2個途徑；分子功能中的DNA結合（DNA binding）和ATP結合（ATP binding）是基因富集程度最高的2個途徑，具體結果如圖6B所示。

2.7.2.3" KEGG數(shù)據(jù)庫注釋結果：將D1的基因編碼蛋白序列與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，總共有3 394個編碼基因得到注釋，分為細胞學過程（Cellular processes）、環(huán)境信息處理（Environmental）、遺傳信息處理（Genetic）、人類疾?。℉uman diseases）、新陳代謝（Metabolism）、以及有機系統(tǒng)（Organismal systems）這6個KEGG一級功能類別上，進一步可細分為42個KEGG二級功能類別。其中，注釋到的最多編碼基因類別是全球地圖和概覽地圖（Global and overview maps）和碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）分別是 966 341 個，具體結果如圖6C所示。

2.7.3" 特定基因功能注釋

2.7.3.1" TCDB數(shù)據(jù)庫注釋結果：轉運蛋白分類數(shù)據(jù)庫（Transporter Classification Database，TCDB），通過比對TCDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.tcdb.org/）獲得每個樣本中的轉運蛋白相關基因。TCDB 數(shù)據(jù)庫轉移系統(tǒng)以5個級別進行分類，D1菌株共有1 204個基因在TCDB中得到注釋，注釋到最多的分別是初級活性轉運蛋白（Primary Active Transporter）（392個基因）和電化學電位驅動轉運蛋白（Electrochemical Potential-driven Transporters）（318個基因），如圖7A所示。

2.7.3.2" PHI數(shù)據(jù)庫分析結果：PHI全稱為Pathogen Host Interactions，即病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫。通過PHI數(shù)據(jù)庫注釋，獲得D1菌株中包含1 056個病原與宿主互作相關基因的信息。其中，有691個基因突變后毒力減弱，318個基因突變后不受影響，83個基因突變后可能會增加毒力，80個基因突變后喪失致病性，26個突變成效應子，18個突變后致死，3個突變后有化學耐藥性，另有2個突變后有化學敏感性，如圖7B所示。

2.7.3.3" CAZy數(shù)據(jù)庫注釋結果：碳水化合物在很多生物學功能中具有重要地位，通過研究碳水化合物相關酶可以得到大量有意義的生物學信息。碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫（Carbohydrate-Active enZYmes Database， CAZy）主要包含：糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases，GHs），糖基轉移酶（GlycosylTransferases，GTs），多糖裂合酶（Polysaccharide Lyases，PLs），碳水化合物酯酶（Carbohydrate Esterases，CEs），碳水化合物結合模塊（Carbohydrate-Binding Modules，CBMs），輔助氧化還原酶（Auxiliary Activities，AAs）等六大類蛋白質家族。通過 CAZy 數(shù)據(jù)庫（http：//www.cazy.org/）比對，CAZy 分析的結果統(tǒng)計如圖7C所示。

2.7.3.4" VFDB數(shù)據(jù)庫分析結果：D1 基因組中注釋到的毒力基因數(shù)共616個，其中注釋到營養(yǎng)/代謝因素毒力因子最多，這說明菌株D1可能通過調控營養(yǎng)/代謝毒力因子來抑制病原菌的生長（圖8）。

2.7.3.5" CARD數(shù)據(jù)庫分析結果：D1基因組共預測有11余類331個耐藥基因，包括氨基香豆素類抗菌藥物、膦酸抗菌藥物、氟喹諾酮類抗菌藥物、頭孢菌素抗菌藥物、噁唑烷酮類抗菌藥物、肽抗菌藥物、氨基糖苷類抗菌藥物、四環(huán)素抗菌藥物、碳青霉烯類、核苷類抗菌藥物（表2）。在各類耐藥基因中，以抗生素外排機制涉及的耐藥基因最多，涉及耐藥結節(jié)分化家族（RND）、主要易化子超家族（MFS）、ATP結合盒家族超家族（ATP）等41個基因（表3）。

2.7.4" 比較基因組分析

2.7.4.1" 基因組基本特征比較分析：

將親本菌株 D1 與耐藥亞群 D1-R 菌株進行了基本特征信息比較，D1 基本特征與 D1-R 相似，在同源基因上存在差異（圖9）。

2.7.4.2" SNP和 InDel 注釋分析：經(jīng)全基因測序分析 gene1615（txR）是一種特定的轉錄調節(jié)因子，使四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生耐藥性，參與 tet 35 的正常運作。耐藥亞群 D1-R 與親本菌株 D1 參考基因組比對發(fā)現(xiàn)在 gene1615 基因的下游1 651 655位置處發(fā)生非同義突變，堿基T突變?yōu)閴A基G，影響了氨基酸的排列順序，可能導致了多西環(huán)素的異質性耐藥。此外，未發(fā)現(xiàn)基因上存在插入和缺失突變。

2.7.4.3" 遺傳進化分析：進化樹在生物學中，用來表示物種之間的進化關系，它給出的分支層次或拓撲圖形是分化或享有共同祖先的一種反映，樹枝的長度反映當這些事件發(fā)生時物種間的進化距離。親本菌株 D1 與耐藥亞群 D1-R 處于同一分枝上，與華中農(nóng)業(yè)大學 2024年提交的豬腎源分離得到的 E. coli ExPEC A338 菌株同源性最高［20］（圖10）。

3" 討" 論

目前，在臨床治療由 E.coli 感染時首選的是抗生素［21］。在治療中遇到異質性耐藥 E.coli 時，會導致異質性耐藥細菌中的耐藥亞群無法徹底清除，從而導致異質性耐藥 E.coli 感染治療失敗，會出現(xiàn)病程延長、反復感染，給臨床有效防控造成困擾，并影響?zhàn)B殖業(yè)的經(jīng)濟效益和健康發(fā)展［22］。因此，研究奶源 E.coli 異質性耐藥尤為重要。

本研究通過采用微量肉湯稀釋法的藥敏試驗對分離出的1株 E.coli 進行敏感性測定，結果顯示，分離株對頭孢噻吩、利福昔明、磺胺異惡唑耐藥，對其余抗生素表現(xiàn)為敏感。使用對該菌株敏感的藥物進行藥敏紙片擴散試驗，發(fā)現(xiàn)阿莫西林-克拉維酸和多西環(huán)素紙片抑菌圈內有散落的菌株出現(xiàn)。利用 PAP 法進行確證，結果表明菌株 D1 的 MIC/MNIC 的比值為 8 ，且耐藥亞群的發(fā)生頻率為 2.45×10-6，大于 1.0×10-7，判定 D1 為多西環(huán)素異質性耐藥菌株。Kuang等［18］研究豬源 E.coli 對黏菌素異質性耐藥的發(fā)生頻率介于 4.26×10-7～5.57×10-5。Liao等［16］研究 E.coli 對黏菌素異質性耐藥耐藥亞群發(fā)生頻率為 4.0×10-7～4.0×10-6。與本研究對比發(fā)現(xiàn)，E.coli 對黏菌素異質性耐藥的發(fā)生頻率相對較高。根據(jù)異質性耐藥菌的形成機制可分為穩(wěn)定性耐藥亞群和不穩(wěn)定性耐藥亞群［23］。本試驗中耐藥亞群 D1-R在第一代就恢復為敏感表型，表現(xiàn)出不穩(wěn)定的異質性耐藥，但MIC值仍為親本菌株D1的8倍。趙冰［24］在研究雞源 E.coli 對磷霉素異質性耐藥中得到的6株耐藥亞群，除1株耐藥亞群 XBH1在無抗生素下培養(yǎng)10 d后對磷霉素的耐藥相對穩(wěn)定外，其他5株耐藥亞群的敏感性均有不同程度的恢復，耐藥亞群對磷霉素的MIC值升高了2～8倍。鄺啟紅［25］在動物源E.coli對黏菌素和頭孢噻呋異質性耐藥的特性研究中篩選出的17株異質性耐藥亞群在不含多黏菌素的 LB 肉湯中連續(xù)培養(yǎng) 3 代后經(jīng)藥敏檢測，發(fā)現(xiàn)除 EPF42 菌對多黏菌素仍然耐藥外，其余 10 株菌對多黏菌素又重新恢復高度敏感。這些研究結果與本試驗是一致的。這表明耐藥亞群很少能達到臨床耐藥水平，盡管如此，這種現(xiàn)象不應被忽視，因為這些耐藥亞群的耐藥水平在持續(xù)的抗生素壓力下可能達到或超過臨床耐藥水平。

細菌生物被膜由微生物群落和自身分泌的胞外物質構成，大腸桿菌通過形成生物被膜加強了對宿主免疫系統(tǒng)和抗菌藥物的耐受性，是造成細菌產(chǎn)生耐藥性的原因之一［26-27］。生物被膜的自發(fā)突變、外部刺激因素、內部微環(huán)境和種間相互作用等過程導致生物被膜層內形成廣泛不同的亞群，生物被膜生物量越高［28-29］。通過生物膜的產(chǎn)量的定量分析，耐藥亞群 D1-R 的生物膜產(chǎn)量極顯著大于親本菌株 D1，因此生物膜產(chǎn)生量的增加可能是造成D1菌株產(chǎn)生異質性耐藥的原因之一。

利用全基因組測序分析E. coli D1菌株的分子生物學特性，結果顯示D1菌株基因組大小為5 088 075 bp，基因組GC含量為50.84%，預測到編碼基因有4 816個，編碼基因總長度為4 440 414 bp。在COG數(shù)據(jù)庫中注釋到24種功能的4 042個基因，有COG注釋的基因占所有基因的83.93%。與GO數(shù)據(jù)庫進行比對，其中生物過程中調控DNA觸發(fā)的轉錄和磷酸化是基因富集程度最高的2個途徑；細胞組成中膜的組成部分和質膜是基因富集程度最高的2個途徑；分子功能中的DNA結合和ATP結合是基因富集程度最高的2個途徑。在KEGG分析中注釋到的最多編碼基因類別是全球地圖和概覽地圖和碳水化合物代謝相關基因。還在TCDB數(shù)據(jù)庫、PHI數(shù)據(jù)庫和CAZy數(shù)據(jù)庫中獲得注釋。在VFDB數(shù)據(jù)庫和CARD數(shù)據(jù)庫中D1共預測到616個毒力基因和331個耐藥基因。

異質性耐藥的機制在基因層面還有可能是抗菌藥物耐藥相關基因突變導致的［29］。遺傳進化分析表示親本菌株D1與耐藥亞群D1-R處于同一分枝上，與華中農(nóng)業(yè)大學2024年提交的豬腎源分離得到的E.coli ExPEC A338菌株一致性最高［20］。通過比較基因組分析發(fā)現(xiàn)親本菌株D1和耐藥亞群D1-R的基本特征相似，在同源基因上存在差異。李聰聰?shù)龋?1］在銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星的異質性耐藥的研究中通過全基因組測序發(fā)現(xiàn) 11 株耐藥亞群中，有8株發(fā)生mexS突變，2株發(fā)生gyrA突變；除此之外，基因fleQ、PA2632和PAKAF_02255均分別在1株菌株中發(fā)生突變。Liao 等［16］研究E. coli對黏菌素異質性耐藥時發(fā)現(xiàn)，DC 8243的pmrB（L14R）發(fā)生突變和 DC 8471的 pmrB（P95L）發(fā)生突變。本研究中耐藥亞群D1-R與大腸桿菌D1參考基因組比對發(fā)現(xiàn)，在 gene1615 基因的染色體上1 651 655位置處發(fā)生非同義突變，堿基T突變?yōu)閴A基G，這可能導致了D1產(chǎn)生異質性耐藥。而gene1615（txR）是一種特定的轉錄調節(jié)因子，使四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生耐藥性，參與tet 35的正常運作。所以推測 D1 菌株產(chǎn)生異質性耐藥的機制還可能與轉錄有關。本試驗中的菌株數(shù)量有限，存在一定的局限性，后續(xù)將在會更大范圍內進行 E. coli異質性耐藥菌株篩查，并繼續(xù)從轉錄以及翻譯等層面，探索 D1 菌株的異質性耐藥的機制。

此外，異質性耐藥在金黃色葡萄球菌［32］、肺炎克雷伯菌［33］、鏈球菌［34］等都有被報道。目前對異質性耐藥現(xiàn)象的關注越來越多，更多的研究試圖闡明這種特別的耐藥機制［35］。盡管異質性耐藥現(xiàn)象很早就有發(fā)現(xiàn)，但是，由于其各亞群的組成在不同條件下是動態(tài)變化的，所以目前國內外有關動物源 E. coli 異質性耐藥的研究較少，大多都集中在人類醫(yī)學。然而人類的食物大都追溯到動物身上，所以研究動物源異質性耐藥是必行趨勢。

4" 結" 論

本研究中的大腸桿菌D1確證為多西環(huán)素異質性耐藥菌株，但耐藥亞群D1-R不能穩(wěn)定遺傳，而D1-R的生物膜產(chǎn)量極顯著大于D1，通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)大腸桿菌D1與耐藥亞群D1-R之間存在基因突變（txR）。因此，生物膜產(chǎn)生量的增加和抗菌藥物耐藥相關基因突變可能是大腸桿菌D1產(chǎn)生異質性耐藥的原因。

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（編輯" 范子娟）