摘 要：以殼聚糖（CS）、聚氧化乙烯（PEO）和絲素蛋白（SF）為原料，采用同軸靜電紡絲制備了具有核-殼結(jié)構(gòu)的CSPEO-SF纖維。通過SEM、TEM和FTIR等對纖維形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征分析，研究纖維的溶脹率、孔隙率和機(jī)械性能，并對其抗菌性能和體外生物活性進(jìn)行評估。結(jié)果表明：所制備的纖維具有核殼結(jié)構(gòu)，孔隙率均在80%以上，溶脹率最大可達(dá)675%，斷裂強(qiáng)度最高可達(dá)7.85 MPa；該纖維對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有顯著抗菌性，并且具有良好的體外生物活性，在骨組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：殼聚糖；絲素蛋白；同軸靜電紡絲；抗菌；體外生物活性

中圖分類號：TB332

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1009-265X（2024）07-0048-10

殼聚糖（Chitosan，CS）由甲殼素經(jīng)脫乙酰基處理得到。殼聚糖的結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)的粘多糖相似，并且分子鏈上含有大量帶正電的氨基，因而具有優(yōu)異的抗菌性能和生物相容性，經(jīng)常用于食物保鮮和生物醫(yī)用等方面。通常將聚氧化乙烯（Polyvinyl oxide，PEO）與殼聚糖混合配制成紡絲液，通過靜電紡絲制備出光滑無珠均勻性較好的納米纖維［1-3］。絲素蛋白（Silk fibroin，SF）是一種具有一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，一級結(jié)構(gòu)由氨基酸構(gòu)成，二級結(jié)構(gòu)通常是β-折疊［4］。絲素蛋白具有優(yōu)秀的生物相容性和機(jī)械性能，常被用于生物醫(yī)學(xué)的基底材料，但其較差的黏附性和親水性限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。

骨組織是生物體最重要的支撐結(jié)構(gòu)，它的結(jié)構(gòu)非常堅硬，在提供支撐和保護(hù)身體的同時，還具有較輕的質(zhì)量，使身體易于移動［5］。盡管骨骼具有自我再生的能力，但先天性或后天性疾?。▌?chuàng)傷、疾病、感染等）可能導(dǎo)致骨組織缺陷，超出其自愈范圍［6］。此外，感染部位存在細(xì)菌感染和血液供應(yīng)受限等危險，導(dǎo)致自愈和骨組織恢復(fù)失?。?］。此時，患者通常需要手術(shù)干預(yù)來幫助愈合，恢復(fù)骨組織的結(jié)構(gòu)及其功能完整性［8］。因此，設(shè)計一種可靠的骨組織修復(fù)材料非常重要。

靜電紡絲是一種帶電聚合物流體在高壓靜電場驅(qū)動下產(chǎn)生射流而形成纖維的技術(shù)［9］。由于通過靜電紡絲制備的纖維具有優(yōu)秀的納米級形貌和較高的孔隙率，且具有類似天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，被廣泛用于組織工程領(lǐng)域［10］。同軸靜電紡絲是在傳統(tǒng)的靜電紡絲的基礎(chǔ)上進(jìn)行了升級，能夠以一種較為簡便的方式制備出具有芯-殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合纖維，在藥物釋放、組織工程等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。同軸靜電紡絲將芯層材料和殼層材料各自優(yōu)良的性能結(jié)合起來，有效實現(xiàn)納米纖維的功能化［11］。將可紡性好的纖維紡絲溶液作為殼層，能有效帶動難以電紡的芯層紡絲溶液，從而改善其紡絲性能［12］。

本文以CS、PEO和SF為原料，通過同軸靜電紡絲制備CSPEO-SF核殼結(jié)構(gòu)納米纖維；然后通過與戊二醛（Glutaric dialdehyde，GA）交聯(lián)改善納米纖維的耐水性能，探究其微觀結(jié)構(gòu)和理化性能；最后評估其抗菌性能和體外生物活性，為后續(xù)骨組織工程修復(fù)提供參考。

1 實驗

1.1 原料及試劑

蠶繭（湖州中維繭絲經(jīng)營有限公司）；殼聚糖（CS，脫乙酰度95%，國藥化工集團(tuán)有限公司）；聚氧化乙烯（PEO，重均分子質(zhì)量2×106，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲酸（FA，AR 88%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；冰醋酸（杭州高精細(xì)化工有限公司）；無水乙醇（EtOH，AR，杭州雙林化工試劑有限公司）；戊二醛（GA，AR 50%，上海麥克林生化科技有限公司）；無水氯化鈣（CaCl2，AR，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；透析袋（截留分子質(zhì)量12000，上海麥克林生化科技有限公司）；去離子水（實驗室自制）。

1.2 實驗設(shè)備

磁力攪拌器（S82-1型，上海志威電器有限公司）；電子天平（CFA1004型，寧波市鄞州華豐儀器廠）；冷凍干燥機(jī)（FD-1A-50型，上海比朗儀器制造有限公司）；靜電紡絲機(jī)（JDFO5型，長沙納儀儀器科技有限公司）；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（Ultra55型，德國Carl Zeiss公司）；X射線衍射儀（布魯克AXS有限公司）；材料測試機(jī)（Instron5943型，美國Instron儀器公司）；傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet5700型，美國Thermo Electron公司）；立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（LX-B50L型，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）；凈化工作臺（SW-CJ-2D型，上海葉拓科技）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；恒溫培養(yǎng)搖床（THZ-100型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 紡絲液的準(zhǔn)備

取一定量蠶繭和透明皂加入到1000 mL去離子水中，以98 ℃加熱2 h后清洗干凈，于60 ℃烘干后得到脫膠處理的蠶絲。取10 g脫膠后的蠶絲溶解，在摩爾比1∶2∶8（CaCl2∶C2H5OH∶H2O）的三元溶液中，利用去離子水透析2～3 d，經(jīng)過離心去除雜質(zhì)，得到純凈的絲素蛋白水溶液；然后通過冷凍干燥得到絲素蛋白（SF）。取1 g凍干SF溶解在9 g甲酸中，室溫下磁力攪拌直至完全溶解，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SF紡絲液，作為芯層紡絲液。取不同質(zhì)量比的CS和PEO溶解在70%乙酸溶液中，室溫下充分?jǐn)嚢柚敝寥芙?，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的CSPEO紡絲液作為殼層紡絲液。

1.3.2 CSPEO-SF同軸纖維膜的制備

利用同軸靜電紡絲技術(shù)制備同軸纖維，將SF溶液和CSPEO溶液分別裝入10 mL注射器上，并連接在同一個同軸針頭上，同軸針頭型號為（18+14） G。其中CSPEO作為殼層溶液，SF作為芯層溶液。滾筒用離型紙包裹作為纖維膜的接收裝置，調(diào)整滾筒與針頭的距離為15 cm。紡絲參數(shù)設(shè)置為電壓22 kV，殼層推進(jìn)速度0.5 mL/h，芯層速度0.4 mL/h，紡絲時間為10 h，紡絲結(jié)束后置于60 ℃烘箱中干燥待用。

1.3.3 纖維膜交聯(lián)改性

用無水乙醇稀釋50%GA溶液配置成3%GA溶液，將復(fù)合纖維裁剪成1 cm×1 cm的方塊并浸泡在3%GA溶液中，交聯(lián)反應(yīng)12 h；用去離子水充分沖洗交聯(lián)后的纖維2～3次，以除去纖維表面未反應(yīng)的GA；將沖洗干凈的纖維膜進(jìn)行冷凍干燥12 h得到改性GA@CSPEO-SF纖維。

1.4 測試與表征

1.4.1 形貌結(jié)構(gòu)分析

利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）觀察纖維表面形貌，120 kV透射電子顯微鏡（TEM）觀察纖維的核殼結(jié)構(gòu)，并用ImageJ軟件測量纖維直徑。

1.4.2 化學(xué)組成分析

利用傅里葉紅外光譜儀（FTIR），選用ATR模式，在4000～400 cm-1的波數(shù)區(qū)域內(nèi)對復(fù)合纖維進(jìn)行掃描分析化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.4.3 結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析

利用X射線衍射儀（XRD）測試?yán)w維的結(jié)晶性能，掃描范圍為5°～80°。

1.4.4 力學(xué)性能測試

利用萬能材料測試機(jī)對纖維膜進(jìn)行力學(xué)性能測試，夾頭間距為10 mm，樣品寬5 mm，長20 mm，測試環(huán)境為（20±2）℃，相對濕度為（55±3）%。

1.4.5 孔隙率測試

根據(jù)阿基米德原理，以無水乙醇為介質(zhì)，采用比重瓶測定樣品的孔隙率，每個樣品重復(fù)3次實驗?？紫堵蔖通過式（1）計算得到：

P/%=m1-m3-m0m1-m3×100（1）

式中：P為樣品的孔隙率，%；m1為乙醇和比重瓶的總質(zhì)量，g；m2為加入樣品后反復(fù)抽真空后乙醇和比重瓶的質(zhì)量，g；m3為反復(fù)抽取真空并取出樣品后乙醇和比重瓶的質(zhì)量，g；m0為樣品的干重，g。

1.4.6 溶脹率測試

將纖維裁剪為20 mm×20 mm的方塊并稱重，然后將裁剪下來的纖維膜浸泡在pH為7.4的PBS緩沖液中，置于37 ℃恒溫?fù)u床中進(jìn)行溶脹測試。分別在10、20、30、40、50、60 min時取出樣品，用濾紙吸取表面水并稱重。溶脹率和吸水率分別通過式（2）—（3）計算：

r溶脹/%=（mt-m0）/m0×100（2）

r吸水/%=（mt-m0）/mt×100（3）

式中：m0為樣品初始干重，g；mt為該時間溶脹纖維的質(zhì)量，g。

1.4.7 抗菌性能測試

選取稀釋涂板法來評價不同納米材料抗菌性能。將單克隆菌落加入到20 mL營養(yǎng)肉湯中，在搖床37 ℃下培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)速設(shè)置為200 r/min。用PBS緩沖液將培養(yǎng)后的菌液稀釋到對應(yīng)的濃度范圍，取3 mL菌液與15 mg纖維膜混合并37 ℃下培養(yǎng)24 h。取100 μL培養(yǎng)后的菌液滴入LB固體培養(yǎng)基，用無菌的涂布棒進(jìn)行涂布，之后將平板置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃條件下再培育24 h。取出培養(yǎng)皿，對培養(yǎng)皿上的菌落進(jìn)行計數(shù)，通過式（4）并計算抑菌率：

r抑菌/%=（A-B）/A×100（4）

式中：A為無樣品菌液培養(yǎng)的菌落數(shù)，個；B為與樣品培養(yǎng)后菌液的菌落數(shù)，個。

1.4.8 體外生物活性研究

通過SBF浸泡測試樣品的體外生物活性，具體方法如下：首先將纖維浸泡在SBF溶液中，置于恒溫?fù)u床中于37 ℃培養(yǎng)，每天更換一次SBF，間隔固定天數(shù)取出浸泡過的纖維，經(jīng)過干燥處理后用掃描電子顯微鏡觀察外觀形貌。

2 結(jié)果與討論

2.1 CSPEO-SF同軸纖維微觀形貌分析

圖1為同軸靜電紡絲的流程圖和單根纖維的TEM圖。兩種紡絲液分別裝在兩個注射器內(nèi)，使用同軸靜電紡絲專用針頭連接，分別用兩個推進(jìn)泵控制核殼層的流速。當(dāng)兩種溶液在噴嘴處形成復(fù)合液滴后，施加電壓使其形成泰勒錐，電場力大于液滴表面張力后，具有核殼結(jié)構(gòu)的射流從液滴射出，在牽伸過程中射流發(fā)生劇烈的鞭動和細(xì)化，同時伴隨著溶劑的揮發(fā)，最后在接收板上固化形成具有核殼結(jié)構(gòu)的納米纖維。通過TEM圖可以觀察到纖維具有明顯的皮芯結(jié)構(gòu)，且皮芯層界面分界清晰，芯層直徑約為155.82 nm，殼層直徑約為251.56 nm。

圖2為不同比例CS、PEO和SF含量的纖維膜的SEM圖和直徑分布圖?？梢杂^察到成功制備出了平滑、均勻、連續(xù)且無串珠的納米纖維，纖維的直徑大約在100～200 nm之間，并且纖維間形成明顯的三維結(jié)構(gòu)。通過直徑分布圖可以觀察到：隨著CS含量的增加，纖維的直徑開始減小。這可能是由于CS分子帶正電荷，紡絲液的電導(dǎo)率隨CS比例增加而增大，使得帶電液滴所受電場力增大，纖維更快地被拉伸變細(xì)，最后得到更細(xì)的納米纖維。加入芯層SF之后，纖維直徑開始增大，并且將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% 的SF溶液作為芯層紡絲液制備的纖維會產(chǎn)生串珠現(xiàn)象。這可能是SF濃度過低，通電后紡絲液粘度達(dá)不到噴射出流體的臨界值，只能形成不穩(wěn)定的串珠或者液滴，將SF溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大到10%后能明顯改善這一問題。通過對比直徑分布圖發(fā)現(xiàn)：同軸纖維的直徑分布離散度明顯大于單軸纖維，說明同軸纖維的直徑分布較寬，有超細(xì)纖維的產(chǎn)生，這是由于同軸靜電紡絲過程中紡絲液體系復(fù)雜，射流拉伸不穩(wěn)定，紡絲過程中被拉伸的小纖維堆積產(chǎn)生超細(xì)纖維。

2.2 纖維交聯(lián)

為了提高纖維的耐水性能，便于后續(xù)實驗，需要用戊二醛（GA）對纖維進(jìn)行交聯(lián)改性處理。圖3（a）為GA交聯(lián)的機(jī)理，圖3（b）和圖3（c）交聯(lián)前后纖維（C7P3S10）SEM圖，圖3（d）為交聯(lián)前后纖維的耐水性測試，圖3（e）為纖維交聯(lián)前后的應(yīng)力-應(yīng)變曲線圖。其交聯(lián)機(jī)理為GA中醛基與CS的氨基作用生成新基團(tuán)醛亞胺（—CN—）。從圖3（b）和圖3（c）比較可以看出通過GA交聯(lián)后纖維直徑略微增加，部分纖維發(fā)生黏連；圖3（d）觀察到GA處理前的纖維與水接觸后開始溶解消失變?yōu)橥该髂z狀物質(zhì)，難以保持原來的纖維膜形狀；而GA處理后纖維接觸水后依然保持原狀，說明纖維的耐水性增加。圖3（e）的交聯(lián)前后纖維應(yīng)力-應(yīng)變曲線顯示交聯(lián)后纖維的斷裂應(yīng)力從4.34 MPa升高到6.93 MPa，斷裂應(yīng)變由25%下降為20%。這是由于纖維經(jīng)過GA交聯(lián)處理后，復(fù)合纖維分子鏈上的部分氨基與GA分子中的醛基發(fā)生反應(yīng)形成剛性亞胺鍵，從而使主要由氫鍵、范德華力等作用力形成的自連網(wǎng)絡(luò)，被更強(qiáng)的共價鍵形成的網(wǎng)絡(luò)所取代，分子間空間距離減小，纖維柔韌性和延展性降低，納米纖維膜的強(qiáng)度和脆性均得到顯著提升。

2.3 化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

圖4為不同纖維的FTIR光譜圖。在SF的光譜圖中，1700～1600 cm-1、1600～1500 cm-1和1300～1200 cm-1處的特征譜帶分別歸因于酰胺I（CO拉伸振動）、酰胺II（N—H彎曲振動）和酰胺III（C—N拉伸振動和N—H彎曲振動），這些特征峰均為絲素的二級結(jié)構(gòu)。CSPEO的光譜圖中，3200～3400 cm-1左右的寬峰為多糖分子的N—H峰和O—H拉伸振動峰。

2879 cm-1為CH2的拉伸振動峰，1470 cm-1和1355 cm-1分別歸因于CS酰胺中的N—H和C—H基團(tuán)的振動峰，1583 cm-1為N—H變形振動峰；1060、1107 cm-1和1145 cm-1的三重峰屬于C—O—C伸縮振動峰，962 cm-1處的峰是由醚基團(tuán)的振動引起的，839 cm-1處的峰與PEO主鏈的螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)。從FTIR分析顯示CS與PEO混紡后化學(xué)結(jié)構(gòu)不變，沒有產(chǎn)生額外的化合物，兩者只存在物理混合，依靠氫鍵連接。經(jīng)過GA交聯(lián)后的纖維光譜圖中1583 cm-1處N—H變形振動峰減弱，1627 cm-1處的CN亞胺峰增強(qiáng)，證明交聯(lián)過程中GA的醛基（CO）與殼聚糖的氨基（—NH2）反應(yīng)成功產(chǎn)生了醛亞胺基團(tuán)（—C=N—）。

圖5為GA處理前后CSPEO-SF纖維的XRD圖。從圖5中可以觀察到在GA處理前的纖維在2θ為19.3°和23.4°處顯示兩個衍射峰，這屬于CS分子晶型I和PEO的（120）、（112）晶面的相關(guān)峰，表明CS分子上游離的氨基和羥基之間形成了氫鍵并且與PEO通過氫鍵結(jié)合，兩者在靜電紡絲過程中形成了結(jié)晶相，PEO晶體結(jié)構(gòu)能完整保持在納米纖維中。此外，在2θ為35°～45°之間觀察到一個低強(qiáng)度的寬峰，這歸因于CS的非晶態(tài)性質(zhì)。經(jīng)過GA處理后，可以觀察到2θ為19.3°和23.4°處的兩個尖峰消失，在2θ為25°左右出現(xiàn)饅頭峰，說明該纖維膜的結(jié)晶度下降，這是GA分子的加入導(dǎo)致的。GA分子鏈上的醛基與CS上氨基作用形成了亞氨基團(tuán)，破壞了纖維中氫鍵等分子間作用力，限制了分子的活動能力，破壞了原分子鏈的規(guī)整性，最后導(dǎo)致纖維的結(jié)晶能力的明顯降低。

2.4 力學(xué)性能分析

纖維膜的拉伸過程主要分為3個階段：第一階段由于纖維膜中大量纖維相互堆疊，纖維間的粘力賦予纖維膜較大的抗形變能力，此階段的拉伸曲線有較大斜率；第二階段由于纖維沿應(yīng)力方向出現(xiàn)了取向和滑移，拉伸強(qiáng)度緩慢增大，拉伸曲線斜率?。坏谌A段時，纖維達(dá)到斷裂應(yīng)力，應(yīng)變不再增大，應(yīng)力急速下降。

圖6為不同纖維的應(yīng)力-應(yīng)變圖。對于CSPEO復(fù)合纖維，其力學(xué)性能較差，C6P4、C7P3和C8P2的拉伸應(yīng)力分別為3.045、3.804 MPa和4.165 MPa；拉伸應(yīng)變?yōu)?%、6%和4%。這說明隨著CSPEO復(fù)合纖維中CS比例增加，纖維膜的拉伸應(yīng)力增大，而拉伸應(yīng)變減小。這是由于CS吡喃糖主鏈上分子內(nèi)和分子間強(qiáng)大的氫鍵作用導(dǎo)致其顯示出剛性和易碎的特性，而PEO分子由于其線性結(jié)構(gòu)和缺乏龐大側(cè)基的特點(diǎn)而顯示出柔韌的特點(diǎn)，因此在CSPEO復(fù)合纖維的拉伸曲線圖中，CS比例增加會增強(qiáng)纖維的拉伸強(qiáng)力但會降低纖維的柔韌性。純SF纖維的拉伸應(yīng)力為7.550 MPa，拉伸應(yīng)變?yōu)?2%，遠(yuǎn)強(qiáng)于CSPEO復(fù)合纖維，因此加入芯層SF之后能大大增強(qiáng)纖維的機(jī)械性能，分別最大增加到6.657、6.931 MPa和7.853 MPa，并且提高SF比例后纖維應(yīng)力應(yīng)變都能進(jìn)一步提高，分別是26%、20%和18%。形成這一結(jié)果的原因主要有兩個：一方面，SF的力學(xué)性能強(qiáng)于CSPEO復(fù)合纖維，SF可以作為增強(qiáng)材料摻入復(fù)合纖維體系中；另一方面，核殼結(jié)構(gòu)的纖維中，核層與殼層纖維排列緊密，內(nèi)部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，同時核殼界面結(jié)合良好，拉伸過程中有利于力的傳導(dǎo)和分布，使纖維呈現(xiàn)出較好的機(jī)械性能。利用強(qiáng)度和剛度更高的SF作為纖維的芯層，能夠承擔(dān)起主要負(fù)載的作用，有助于增強(qiáng)纖維的機(jī)械性能。

2.5 孔隙率分析

圖7為纖維膜的孔隙率圖。SF纖維的孔隙率為（72.89±3.17）%，而其他所有纖維的孔隙率均在80%以上，范圍是82.54%～88.85%，這種高孔隙率的結(jié)構(gòu)使纖維具有較高的比表面積，有利于細(xì)胞的黏附、遷移以及生長。由圖7可知，低濃度CS的纖維具有相對較低的孔隙率，這可能是因為在相同的交聯(lián)條件下，CS比例較低的纖維交聯(lián)程度更高，纖維間結(jié)構(gòu)更加緊密，導(dǎo)致纖維的孔隙率變小。雖然芯層SF的加入降低了纖維整體的孔隙率，但是仍能使孔隙率維持在80%以上，仍能符合組織工程的應(yīng)用要求。

2.6 溶脹率分析

作為組織工程用材料，納米纖維膜需要具有一定的溶脹保水性能，這樣有利于營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸，細(xì)胞信號傳導(dǎo)以及細(xì)胞的黏附與增殖。圖8分別為不同纖維在0～60 min的溶脹率變化曲線。從圖8中可以發(fā)現(xiàn)所有樣品的溶脹率在0～10 min處于快速上升的趨勢，后上升速度減緩，60 min左右達(dá)到溶脹平衡。纖維的溶脹主要由氫鍵引起，當(dāng)纖維中親水性基團(tuán)增加，纖維與水接觸后形成的氫鍵數(shù)量也隨之增加，纖維的溶脹性能增強(qiáng)。CS含量較低的纖維具有更高的溶脹性能，這主要有兩方面原因：一方面PEO分子鏈上的親水基團(tuán)更多，親水性能比CS好，CSPEO復(fù)合體系中PEO比例增加能使纖維更容易吸收大量的水，當(dāng)纖維浸入水中后，大量纖維孔隙的形成會使部分PEO溶解，并使水更易滲入纖維，導(dǎo)致溶脹率的增加；另一方面利用了GA作為交聯(lián)劑，CS比例小的纖維具有更高的交聯(lián)程度，分子間的氫鍵作用減弱，使原先被氫鍵束縛的部分親水基團(tuán)獲得自由，提高了纖維的親水性，同時纖維的納米結(jié)構(gòu)之間能吸引更多的水。芯層絲素的加入明顯降低了復(fù)合纖維的溶脹性，剛性絲素的加入使纖維變得更加堅硬，降低纖維膨脹的靈活性，因此纖維的溶脹率會有所下降，但得益于表面包覆的CSPEO，這種核殼纖維的溶脹率仍強(qiáng)于純SF纖維。

2.7 抗菌性能分析

根據(jù)纖維理化性能的測試，選取同軸纖維綜合性能較為優(yōu)秀的C7P3S10進(jìn)行后續(xù)測試，記為CSPEO-SF。圖9為SF、CSPEO-SF、GA處理后的GA@CSPEO-SF與兩種細(xì)菌接觸培養(yǎng)之后的平板菌落照片以及抑菌率圖。由圖9可知，與SF纖維膜培養(yǎng)的菌液生成的菌落有較多的菌落，說明SF纖維膜的抗菌效果較差；而CSPEO-SF組的瓊脂上幾乎沒有菌落生成；GA@CSPEO-SF組的瓊脂上有少量菌落生長，生長密度小于SF組。

通過圖10的抑菌率柱狀圖可知，SF纖維膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率分別達(dá)到32.79%和13.17%，并未達(dá)到抗菌效果。CSPEO-SF對兩種細(xì)菌的抑菌率都幾乎達(dá)到了100.00%，具有良好的殺菌效果。GA@CSPEO-SF對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率分別達(dá)到了77.05%和47.33%，具有一定的抑菌效果，經(jīng)過GA交聯(lián)后纖維上部分的氨基轉(zhuǎn)化為醛亞胺基團(tuán)，導(dǎo)致纖維在交聯(lián)之后抑菌性能減弱。雖然對比交聯(lián)前纖維性能有所下降，但仍強(qiáng)于純SF纖維膜。所有纖維對大腸桿菌的抑菌效果均強(qiáng)于金黃色葡萄球菌。

2.8 體外生物活性分析

通過體外礦化實驗評估纖維的體外生物活性，圖11為兩種纖維在SBF中浸泡14 d的SEM圖以及EDS圖。如圖11所示，SF和CSPEO-SF纖維在SBF中浸泡14 d后表面被針狀的沉積物覆蓋，放大圖片可以觀察到這些針狀物均勻分布在纖維表面，導(dǎo)致難以觀察到裸露的纖維。通過EDS觀察到這些覆蓋在纖維表面的沉積物富含Ca、P元素，說明兩種纖維表面均覆蓋了羥基磷灰石，形成了致密的羥基磷灰石層，這兩種纖維均具有較好的體外生物活性；并且通過對比兩種纖維的SEM圖和EDS圖可以發(fā)現(xiàn)CSPEO/S纖維表面沉積的羥基磷灰石更多，Ca和P元素的占比也更高。通過計算Ca/P比，CSPEO-SF表面的Ca/P為1.68；SF表面的Ca/P為1.83，人骨中的Ca/P理論實際值為1.67，CSPEO-SF的Ca/P更接近人骨，說明CSPEO-SF纖維體現(xiàn)出更好的體外生物活性。

3 結(jié)論

本文通過同軸靜電紡絲制備了CSPEO-SF核殼型纖維，使用SEM、FTIR等表征了纖維的形貌及化學(xué)組成，同時分析了纖維的理化性能、生物活性和抗菌性能，主要結(jié)論如下：

a）成功制備出具有核殼結(jié)構(gòu)的納米纖維，纖維膜均具有三維多孔結(jié)構(gòu)，通過GA處理可增強(qiáng)纖維的耐水性能，纖維產(chǎn)生了新的基團(tuán)，結(jié)晶度下降。

b）相比于純SF纖維，CSPEO作為殼層的纖維力學(xué)性能下降，但孔隙率和溶脹率均有提升，孔隙率最高能達(dá)到88.85%，溶脹性能最高為675%。

c）通過選取纖維中各項性能較為均衡C7P3S10與SF比較生物活性與抗菌性能，發(fā)現(xiàn)CSPEO作為殼層的纖維生物活性更好，抗菌性能比純SF纖維更強(qiáng)，雖然GA處理后纖維抗菌性能有所下降，但是仍然強(qiáng)于純SF纖維。

綜上，本文制備的核殼型CSPEO-SF纖維在生物活性與抗菌性能方面優(yōu)異的表現(xiàn)可在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域中有良好的應(yīng)用前景。

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Preparation of coaxial electrostatically spun chitosan/polyethylene oxide-sericin

fibers and their bioactivity

ZHU" Lingqi，" LIU" Tao，" XU" Guoping，" QIU" Qiaohua，" AWOKE ANTENEH Tilahun，

ZHOU" Jiabao，" WANG" Yanmin

（College of Textile Science and Engineering （International Institute of Silk）， Zhejiang Sci-Tech

University， Hangzhou 310018， China）

Abstract：

At present， bone defects caused by trauma， infection， bone tumors， etc. are very common. Serious bone damage caused by major diseases often exceeds the bone's self-healing ability， but the bone tissue's own repair and regeneration ability is not quite satisfactory. In this case， it is necessary to find a good repair material to treat these bone injury diseases. As natural polymers， chitosan （CS） and silk fibroin （SF） are widely available and easy to obtain， and they will only degrade to water and carbon dioxide when implanted into the human body， so they have good biocompatibility and degradability. In this paper， CSPEO-SF nanofibers were prepared by coaxial electrostatic spinning technology. The shell layer of CS and PEO could ensure the fibers to have good hydrophilic properties， antimicrobial properties， and in vitro bioactivity， and the SF in the core layer served as a core template to ensure the fibers to have certain mechanical strength. Then， glutaraldehyde （GA） was used to transform some of the amino groups in the fibers into aldimine groups to improve the water resistance of the fiber membrane. Tests such as XRD and FTIR were carried out on the fibers before and after cross-linking， and it was found that the aldehyde-imide groups were successfully produced after cross-linking， and it was concluded from the SEM images that the fiber diameters increased after cross-linking， and the fracture strength increased， but the tensile strain decreased. Different nanofibers were prepared by varying the mass ratio of CS， PEO and SF， and it was observed from the SEM images that the fiber diameter increased with the increase in the mass proportion of PEO and SF. Subsequently， the mechanical properties， porosity and swelling properties were tested， and it was found that the increase of both CS and SF ratio decreased the flexibility， swelling properties and porosity of the fibers， but increased the mechanical properties of the fibers. All the fibers were able to reach a porosity of more than 80%， and a swelling rate of up to 675%. Finally， the results of the above tests were compared. The more balanced C7P3S10 samples were selected to compare with the SF fibers for the subsequent antimicrobial performance and in vitro bioactivity tests. Antimicrobial experiments were reflected by the dilution coating plate method. Firstly， the fibers were mixed with the appropriate amount of bacterial solution for 8 h， and then the cultured bacterial solution was coated onto agar medium for 24 h. In the meanwhile， the number of colonies on the medium was observed and recorded， and compared with the blank control group. The rate of bacterial inhibition was calculated， and it was found from the results of the experiment that although the antimicrobial performance of CSPEO-SF fibers after the cross-linking modification treatment was decreased， it was still stronger than that of SF fibers. The in vitro bioactivity experiment was conducted by immersing the fibers in simulated body fluid （SBF） at a ratio of 1.5 mg/mL for a period of time to observe the generation of hydroxyapatite （HA）， which revealed that the Ca/P ratio of HA on the surface of CSPEO-SF fibers was closer to that of human bone， and that the in vitro bioactivity of CSPEO-SF fibers was better than that of SF fibers. Through the above experiments， it can be concluded that CSPEO-SF fibers can have promising prospects in biomedical applications.

Keywords：

chitosan; silk fibroin; coaxial electrostatic spinning; antimicrobial; in vitro bioactivity