摘要：為探究飼料中添加不同含量的枯草芽孢桿菌對大口黑鱸（Micropterus salmoides）幼魚生長性能、飼料效率、消化酶活性、免疫力和腸道健康的影響。將枯草芽孢桿菌按照0.0%（BS0）、0.2%（BS0.2）和0.4%（BS0.4）的重量比分別添加至基礎(chǔ)飼料中，開展為期60 d養(yǎng)殖試驗。結(jié)果顯示，BS0.4組終末體重、增重率和特定生長率顯著高于BS0組（Plt;0.05），而BS0.2組與BS0組、BS0.4組均差異不顯著（Pgt;0.05）。BS0.2組肌肉粗蛋白質(zhì)活性顯著高于BS0組（Plt;0.05），而與BS0.4組差異不顯著（Pgt;0.05）。BS0.2和BS0.4組血清總蛋白含量顯著高于BS0組（Plt;0.05）；BS0.4組溶菌酶活性顯著高于BS0組和BS0.2組（Plt;0.05），BS0.4組堿性磷酸酶活性顯著高于BS0組（Plt;0.05）。BS0.4組肝臟總超氧化物歧化酶和腸道胰蛋白酶顯著高于BS0組（Plt;0.05），而與BS0.2組差異不顯著（Pgt;0.05）。飼料中添加復(fù)合枯草芽孢桿菌對腸道絨毛長度和寬度無顯著影響（Pgt;0.05），而BS0組腸道肌層厚度顯著低于BS0.2、BS0.4組（Plt;0.05）。綜上，添加0.2%～0.4%復(fù)合枯草芽孢桿菌能夠促進大口黑鱸幼魚生長、提高肝臟抗氧化力和血清免疫力。

關(guān)鍵詞：大口黑鱸；枯草芽孢桿菌；生長；免疫力；腸道健康

中圖分類號：S965.211 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）12-0195-06

大口黑鱸別稱加州鱸，具有肉質(zhì)鮮美、無肌間刺、生長快、抗病力強和市場價值高等特點，已成為我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一，形成了苗種繁育、養(yǎng)殖、加工、飼料和銷售的完整產(chǎn)業(yè)鏈［1］。據(jù)統(tǒng)計，2022年大口黑鱸養(yǎng)殖總產(chǎn)量為80.2萬t，占淡水魚類養(yǎng)殖產(chǎn)量的2.96%［2］。然而，在大口黑鱸集約化養(yǎng)殖過程中，飼料營養(yǎng)質(zhì)量不均、投喂過量、低氧和高溫脅迫及養(yǎng)殖環(huán)境惡化等導(dǎo)致魚體健康受損和病害爆發(fā)等，造成嚴重的經(jīng)濟損失［3］。水產(chǎn)養(yǎng)殖中往往采用抗生素對病害進行防控，但這會導(dǎo)致耐藥性和藥物殘留、引起水產(chǎn)品安全等問題，因此急切需要尋找安全高效、無害、無殘留的抗生素替代品。

微生物制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中維持水質(zhì)、提高生產(chǎn)力、養(yǎng)分循環(huán)、功能性飼料開發(fā)、廢物處理、病害防控及最大限度地減少抗生素和藥物濫用等方面發(fā)揮著重要的作用［4］。已有多種益生菌被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，其中，芽孢桿菌是研究和應(yīng)用較為廣泛的一種益生菌［5］?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）是廣泛存在于土壤和腐敗生物體中的革蘭氏陽性菌芽孢桿菌屬的一種，該菌具有安全、無致病性和耐藥性、繁殖迅速、對環(huán)境條件的耐受性強以及能夠生產(chǎn)多種酶、代謝物和其他生物活性化合物等優(yōu)點，被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列入飼料添加劑目錄［5-6］?？莶菅挎邨U菌能夠很好地在動物腸道內(nèi)存活和定殖，飼料中適量添加單一芽孢桿菌或合生元具有促生長、改善腸道健康、提高免疫力和抗病力等益生效果［4-5］。有關(guān)枯草芽孢桿菌在大口黑鱸上的研究集中在單一種類，而對復(fù)合芽孢桿菌的應(yīng)用研究較少。因此，本研究采用枯草芽孢桿菌制劑飼喂大口黑鱸60 d，通過測定其生長、血液生化指標、肝臟抗氧化力和腸道結(jié)構(gòu)等指標，評估枯草芽孢桿菌在大口黑鱸上的應(yīng)用效果，以期為大口黑鱸配合飼料研發(fā)和可持續(xù)養(yǎng)殖提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

以魚粉和魚加工副產(chǎn)物為蛋白質(zhì)源，魚油為脂肪源，補充酵母、血粉、磷蝦粉、玉米蛋白粉、多維、多礦和膽堿等配制基礎(chǔ)飼料，以基礎(chǔ)飼料作為對照組。枯草芽孢桿菌制劑（活菌數(shù)1×1010" CFU/g）為商品制劑。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0.0%、0.2%、0.4%枯草芽孢桿菌制劑配制3種飼料，分別標記為BS0、BS0.2和BS0.4，使飼料中枯草芽孢桿菌活菌數(shù)分別為0、1.8×1010、3.8×1010 CFU/kg。飼料原料粉碎，過60目篩，均勻混合，采用雙螺桿制粒機擠壓成顆粒料（直徑1.5 mm），60 ℃烘干，-20 ℃ 保存?zhèn)溆?。飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗在日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院水生物繁養(yǎng)殖實訓(xùn)中心循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行。試驗用魚購自金澄福生物科技（蘇州）有限公司，為人工孵化的同一批大口黑鱸魚苗。正式試驗前，試驗用魚暫養(yǎng)于玻璃纖維養(yǎng)殖缸，采用飼料BS0馴化2周，使其適應(yīng)試驗飼料和養(yǎng)殖條件。

挑選健康無病、規(guī)格一致［（7.65±0.07） g/尾］的大口黑鱸幼魚270尾，隨機分為3個處理組，每組3個平行，每個平行30尾，放養(yǎng)于循環(huán)水養(yǎng)殖玻璃缸（1.00 m×0.45 m×0.45 m）。試驗開始前禁食 24 h，每天飽飼投喂2次（07：00和18：00）。整個養(yǎng)殖期間，水流速度為0.3 L/min，水溫度24.5～26.2 ℃，溶氧量6.0～6.5 mg/L，氨氮含量≤0.10 mg/L，pH值為7.8～8.0，光照12 h/d。試驗時間為2022年10—11月，養(yǎng)殖周期60 d。

1.3 樣品收集與指標測定

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，大口黑鱸禁食24 h后，分別統(tǒng)計每缸魚數(shù)量和體重，以計算生長率和成活率；每個養(yǎng)殖缸隨機取5尾，分別測量每尾魚的體重、體長，剝離肝臟和內(nèi)臟團，并稱重，取肌肉冷凍保藏，用于測定肌肉成分；取腸道和肝臟并保存于-20 ℃冰箱，分別用于測定消化酶和抗氧化酶活性；每缸隨機取3尾魚，-20 ℃保存，用于測定全魚營養(yǎng)成分。每缸隨機取5尾魚，MS-222麻醉，尾靜脈抽血1.5 mL，至于4 ℃冰箱中靜置2 h，5 000 r/min 離心10 min，取上清液，-80 ℃保存，用于測定血清生化指標。每缸選取2尾魚，分離腸道并固定于4%多聚甲醛，用于腸道切片制作。

血清生化指標的測定：采用全自動生化分析儀（邁瑞B(yǎng)S-400，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）活性以及總蛋白（TP）、葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）含量。采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定溶菌酶活性。

抗氧化指標的測定：將肝臟樣品加入生理鹽水（質(zhì)量 ∶體積=1 ∶9）、高速勻漿、離心（4 ℃，3 000 r/min）10 min，取上清液，用于測定總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性、總抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛（MDA）含量?？寡趸笜说臏y定均采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

消化酶活性的測定：采用酶比色法和酶淀粉比色法分別測定腸道脂肪酶和淀粉酶活性。消化酶活性的測定均采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

體成分測定：采用索氏抽提法、凱氏定氮法、灼燒法和烘干恒重法分別測定魚體和肌肉粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、灰分、水分含量。

腸道組織切片：將固定好的腸道樣品進行乙醇梯度脫水、石蠟包埋、切片（厚度為4 μm）、蘇木精和伊紅染色、中性樹膠封片。采用正置光學(xué)顯微鏡（Nikon Eclipse E100）拍照，并測量絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度。

1.4 計算公式

成活率=試驗結(jié)束時魚尾數(shù)/試驗開始時魚尾數(shù)×100%；

特定生長率（SGR，%/d）=（lnFBW-lnIBW）×100/試驗周期（d）；

增重率（WGR）=（FBW-IBW）/IBW×100%；

攝食率（FI，%/d）=100×試驗期間投料量/［（魚終末體重+魚初始體重）／2×養(yǎng)殖周期］；

飼料系數(shù)（FCR）=飼料投喂量/魚體凈增重；

蛋白質(zhì)效率（PER）=魚體凈增重/蛋白質(zhì)攝入量；

臟體比（VSI）= 內(nèi)臟重/體重×100%；

肝體比（HSI）=肝臟重/體重×100%；

肥滿度（CF，g/cm3）= 體重/體長3。

式中：IBW為初始體重，g；FBW為終末體重，g。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。若處理組間顯著差異，再用Duncan＇s新復(fù)極差法進行多重比較。Plt;0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌對生長性能的影響

由表2可知，隨著枯草芽孢桿菌添加量的增加，試驗魚終末體重（FBW）、特定生長率（SGR）和增重率（WGR）逐漸增加，其中，0.4%組FBW、WGR和SGR顯著高于對照組（Plt;0.05），而0.2%組與對照組、0.4%組均差異不顯著（Pgt;0.05）。添加枯草芽孢桿菌對大口黑鱸幼魚成活率、攝食率、飼料系數(shù)、蛋白質(zhì)效率、肥滿度、臟體比和肝體比均無顯著影響（Pgt;0.05）。

2.2 枯草芽孢桿菌對體成分的影響

由表3可知，飼料中添加枯草芽孢桿菌對大口黑鱸幼魚全魚水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分含量及肌肉水分、粗灰分、粗脂肪含量無顯著影響（Pgt;0.05）。0.2%組肌肉粗蛋白質(zhì)含量顯著高于對照組（Plt;0.05），而與0.4%組差異不顯著（Pgt;0.05）。

2.3 枯草芽孢桿菌對血清生化指標的影響

由表4可知，添加枯草芽孢桿菌對血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性和葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）含量無顯著影響（Pgt;0.05）；0.2%和0.4%組血清總蛋白（TP）含量顯著高于對照組（Plt;0.05），而0.2%和0.4%組差異不顯著（Pgt;0.05）；0.4%組溶菌酶（LZM）活性顯著高于對照組和0.2%組（Plt;0.05），對照組與0.2%組差異不顯著（Pgt;0.05）。0.4%組堿性磷酸酶（ALP）活性顯著高于對照組（Plt;0.05），而與0.2%組差異不顯著（Pgt;0.05）。

2.4 枯草芽孢桿菌對抗氧化力的影響

由表5可知，飼料中添加枯草芽孢桿菌對試驗魚肝臟CAT活性、T-AOC及MDA含量無顯著影響（Pgt;0.05），0.4%組肝臟T-SOD活性顯著高于對照組（Plt;0.05），而與0.2%組差異不顯著（Pgt;0.05）。

2.5 枯草芽孢桿菌對消化酶活性和腸道結(jié)構(gòu)的影響

由表6可知，飼料中添加枯草芽孢桿菌對大口黑鱸腸道脂肪酶和淀粉酶活性無顯著影響（Pgt;0.05）；0.4%組腸道胰蛋白酶顯著高于對照組（Plt;0.05），而與0.2%組差異不顯著（Pgt;0.05）。腸道切片結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌對腸道絨毛長度和寬度無顯著影響（Pgt;0.05），而對照組腸道肌層厚度顯著低于BS0.2、BS0.4組（Plt;0.05）（表7、圖1）。

3 討論

3.1 對生長和飼料利用的影響

在集約化養(yǎng)殖和飼料非糧型蛋白源應(yīng)用中，往往通過補充飼料添加劑來改善養(yǎng)殖魚類的生長和健康。芽孢桿菌等益生菌在動物腸道內(nèi)代謝產(chǎn)生氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，還可提高食欲和消化酶活性以及改善腸道結(jié)構(gòu)，從而提高飼料消化利用率，促進生長［4-5］。本研究結(jié)果表明，大口黑鱸幼魚生長性能隨著枯草芽孢桿菌添加量的增加而逐漸增加，其中，0.4%組促生長效果明顯。類似的，在低高蛋白質(zhì)（28%和32%）飼料中分別添加0.1%和0.3%枯草芽孢桿菌DSM 32315顯著提高尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）生長性能［7］。添加 104～1010 CFU/kg枯草芽孢桿菌顯著提高真鯛（Pagrus major）生長性能和飼料利用率［8］。研究者在對雜交鱘（Acipenser baeri[XZ（15#]♂[XZ）]×Acipenser schrenkii♀［9］、大黃魚（Larimichthys crocea）［10］、尼羅羅非魚［11-14］和日本鰻鱺（Anguilla japonica）［15］的研究中也得到類似結(jié)果?？莶菅挎邨U菌的益生作用可歸結(jié)于分泌消化酶、抗菌化合物和胞外蛋白物質(zhì)、競爭排斥以及對腸道微生物的協(xié)同效應(yīng)等［5， 10］。相反的，在大口黑鱸［3， 16-17］和羅非魚［18］的飼料中添加芽孢桿菌對生長性能無影響?？莶菅挎邨U菌對魚類生長的結(jié)果存在差異可能與試驗魚種類、飼料原料組成、營養(yǎng)組成、添加量、養(yǎng)殖環(huán)境等有關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加合生元或復(fù)合益生對魚類的生長、先天免疫和抗病能力最有利［4］。

3.2 對體成分的影響

本研究結(jié)果顯示，添加枯草芽孢桿菌對大口黑鱸全魚粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、水分、粗灰分含量，肌肉水分、粗脂肪、粗灰分含量以及軀體指數(shù)均無顯著影響，但可提高肌肉粗蛋白質(zhì)含量。在真鯛［8］和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［19］的研究中得到了類似的結(jié)果。然而，飼料中添加枯草芽孢桿菌并未對尼羅羅非魚體成分產(chǎn)生影響［7］。魚類的體成分可能與魚的種類、飼料組成、營養(yǎng)物質(zhì)濃度、養(yǎng)殖條件和飼喂方法等有關(guān)。

3.3 對消化酶的影響

本研究中，隨著枯草芽孢桿菌添加量的增加，腸道消化酶活性逐漸升高，其中，0.4%組胰蛋白酶顯著高于對照組。類似的，飼料中分別添加1×104、1×106 CFU/g 芽孢桿菌均可提高大口黑鱸腸道蛋白酶和淀粉酶活性，且與添加量呈正相關(guān)［17］。在真鯛［8］、雜交鱘［9］、尼羅羅非魚［12-13， 20］和凡納濱對蝦［21］的研究中也發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌顯著提高魚蝦消化酶活性。芽孢桿菌等益生菌可產(chǎn)生脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶等，這些酶類可促使飼料大分子營養(yǎng)物質(zhì)降解為小分子物質(zhì)以及彌補動物內(nèi)源性消化酶的不足，芽孢桿菌還可產(chǎn)生游離氨基酸和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，有助于促進動物的生長發(fā)育［5， 22］。

3.4 對抗氧化力和免疫力的影響

抗氧化酶是評價動物應(yīng)激反應(yīng)和免疫反應(yīng)的重要指標，其活性與動物的抗氧化能力密切相關(guān)，可作為魚類健康的重要評估指標之一［23］。CAT和SOD是常見的酶類抗氧化物，SOD可以有效清除動物體內(nèi)羥基自由基和超氧陰離子等自由基，以保護機體免受氧化應(yīng)激損傷，是機體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線［24］。LZM和ALP是衡量魚類免疫力的重要非特異免疫酶，在參與機體的新陳代謝和免疫力等方面發(fā)揮非常的重要作用［25］。枯草芽孢桿菌所含有的多種生物活性物質(zhì)可調(diào)節(jié)/激活宿主的細胞和體液免疫系統(tǒng)［26］。枯草芽孢桿菌的細胞壁成分或其孢子可刺激黏膜淋巴細胞誘導(dǎo)魚類免疫系統(tǒng)［5］。孢子的免疫功能是因為其能夠到達胃腸道的Peyer＇s斑塊并將抗原傳遞給吞噬細胞/B細胞，進而刺激宿主的細胞和體液免疫反應(yīng)［4-5］。本研究結(jié)果顯示，飼料中添加枯草芽孢桿菌可提高大口黑鱸血清TP含量、LZM和ALP活性及肝臟T-SOD活性，說明枯草芽孢桿菌可提高大口黑鱸免疫力和抗氧化能力。類似地，低高蛋白質(zhì)（28%和32%）飼料中分別添加0.1%和0.3%枯草芽孢桿菌DSM 32315顯著提高了尼羅羅非魚血漿LZM活性、T-AOC、補體C3和IL-10 mRNA水平及抗氨脅迫的能力，還可以緩解低蛋白飼料引起的肝臟炎癥［7］。飼料中添加1.5 g/kg枯草芽孢桿菌DSM 32315可顯著提高大口黑鱸血清溶菌酶活性和補體C3和C4水平及促炎因子（IL-1β、IL-8和TNF-α）表達［16］。真鯛［8］、雜交鱘［9］、大黃魚［10］、日本鰻鱺［15］、大口黑鱸［3， 17］、尼羅羅非魚［11-14， 20］、凡納濱對蝦［21］和草魚（Ctenopharyngodon idella）［26］的飼料中補充枯草芽孢桿菌可提高其免疫力和抗氧化能力。值得注意，刺參體腔液、大口黑鱸血清比腸道對益生菌的免疫響應(yīng)更強烈［17， 27］，這說明水產(chǎn)動物的免疫反應(yīng)具有組織特異性，這可能與其在免疫反應(yīng)中的功能不同有關(guān)［28］。

3.5 對腸道健康的影響

水產(chǎn)動物腸道絨毛數(shù)量、長度及肌層厚度等形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化會影響腸道屏障，從而影響魚體機能和健康［29］。飼料中添加0.5%～1.0%或1.5～3.0 g/kg 枯草芽孢桿菌均可顯著增加大口黑鱸中腸絨毛長度、數(shù)量和肌層厚度［3， 16］。不同飼料蛋白質(zhì)水平條件下，枯草芽孢桿菌可改善尼羅羅非魚腸道絨毛寬度和長度，且低飼料蛋白組效果更明顯［7］。本研究中，添加枯草芽孢桿菌對腸道絨毛長度和寬度無顯著影響，但可增加腸道肌層厚度，這說明添加枯草芽孢桿菌有利于維持大口黑鱸腸道結(jié)構(gòu)的穩(wěn)固性和完整性。類似的，在飼料中添加芽孢桿菌飼料也能改善羅非魚［11， 20］、日本鰻鱺［15］、歐洲龍蝦［30］和虎龍斑［31］等魚蝦的腸道形態(tài)。腸道形態(tài)的改變可能是由于碳水化合物的完全利用和短鏈脂肪酸的產(chǎn)生引起的［15， 20］。

4 結(jié)論

綜上所述，在本試驗條件下，飼料中添加 0.2%～0.4%枯草芽孢桿菌可促大口黑鱸幼魚生長、提高肝臟抗氧化力和血清免疫力。

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收稿日期：2023-12-29

基金項目：日照市重點研發(fā)計劃（編號：2021ZDYF010129）；日照市自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年基金（編號：RZ2021ZR15）。

作者簡介：王裕玉（1983—），男，山東日照人，博士，副教授，主要從事水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料研究。E-mail：wangyy20210@163.com。

通信作者：孔祥青，高級工程師，主要從事水產(chǎn)增養(yǎng)殖研究。E-mail：rzdgyj2008@126.com。