摘要：為揭示紫花苜蓿（Medicago sativa）生長調節(jié)因子（GRF）響應干旱脅迫中的生理功能及響應機制，以勁能5020為試驗材料，基于全基因組分析，對紫花苜蓿GRF家族成員進行鑒定和生物信息學分析，并采用RT-qPCR方法分析相關基因在干旱脅迫下的表達模式。結果表明，在紫花苜蓿中共鑒定出8個GRF編碼基因的非冗余成員，可定位于7條染色體上。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，紫花苜蓿GRF（MsGRF）可分為4個亞家族，同一亞家族的MsGRF都包含共同的高度保守基序、基因結構及多種順式作用元件，表明MsGRF具有潛在的功能多樣性。RNA-seq、qPCR表達模式表明，MsGRF在幼嫩組織和根系中具有較高的表達活性。RT-qPCR進一步表明，8個MsGRF成員中，6個基因（MsGRF1、MsGRF3、MsGRF5、MsGRF6、MsGRF7、MsGRF8）在干旱脅迫下上調表達，其中MsGRF1相對表達水平45.8～83.1，表達活性最高、契合度最佳。綜上，MsGRF在紫花苜蓿抗干旱過程中具有重要作用，推測MsGRF1是紫花苜蓿耐旱的關鍵基因。

關鍵詞：紫花苜蓿；生長調節(jié)因子；全基因組；干旱脅迫；表達分析

中圖分類號：S541.9 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）12-0045-08

生長調節(jié)因子（GRF）是植物重要的轉錄因子，廣泛分布于綠色植物中，在調節(jié)植物生長發(fā)育以及植物對非生物脅迫的響應中扮演著重要角色［1］。生長調節(jié)因子（GRF）是轉錄因子的重要家族成員之一，GRF在N端區(qū)域包含2個特征和保守的功能域，即QLQ域（Gln、Leu、Gln）和WRC域（Trp、Arg、Cys）［ ］。QLQ結構域包含GRF相互作用因子（GIF）相互作用的位點［4］，而WRC結構域包含DNA結合基序和核定位信號，WRC結構域由DNA結合的C3H基序和核定位信號（NLS）組成，因此QLQ域比WRC域更為保守［5］。所有真核生物都含有QLQ，WRC為植物特異性結構域，GRF的C端區(qū)域、氨基酸殘基的種類和數(shù)量差異較大，這使得不同植物、同植物不同基因型，同基因型不同成員的相似度均較低［6］。由于C端結構域差異較大，且C末端區(qū)域的長度決定著蛋白質的大小，因此植物GRF蛋白往往具備功能多樣性［7］。

GRF參與植物早期生長發(fā)育，在植物組織或器官的形成中發(fā)揮重要的調控作用，如葉拓展、莖伸長和根系分化［8］。這些轉錄因子直接影響植物形態(tài)建成，進而影響植物生理代謝強度及產(chǎn)量。水稻（Oryza sativa）的OsGRF1是在植物中發(fā)現(xiàn)的第一個GRF成員，基因克隆顯示其可編碼赤霉素生物合成蛋白從而誘導莖伸長，且其他GRF成員可以通過調節(jié)細胞增殖來調節(jié)目標植物葉片的形狀和大?。?］。在模式植物擬南芥中，與野生型相比，AtGRF1、AtGRF2和AtGRF5過表達植株的葉片更厚，但包括GRF3-1、GRF5-1、GRF1-1、GRF2和GRF3突變體的葉片比寬型植物?。?］。目前，一些研究表明，GRF基因可抑制KNOX基因表達以調節(jié)關鍵生物合成基因GA20氧化酶來抑制S-腺苷甲硫氨酸（SAM）循環(huán)中的GA生物合成或通過控制降解GA的GA2氧化酶水平，從而調節(jié)細胞增殖［9］。

大多數(shù)GRF基因是microRNA396（miR396）的靶基因，有證據(jù)表明miR396可以通過轉錄后調控直接抑制GRF表達［10］。目前，GRF基因家族的鑒定和功能已在多種植物中進行了研究，在擬南芥中鑒定得到GRF 9個［4］、大豆22個［11］、水稻12個［12］、黑果枸杞［13］、玉米15個［14］、馬鈴薯12個［15］、谷子18個［16］。紫花苜蓿（Medicago sativa）是多年生豆科植物，紫花苜蓿富含蛋白質、礦物質、維生素等營養(yǎng)成分，是一種高產(chǎn)優(yōu)質的重要飼料作物［17，18］。然而，由于紫花苜蓿的遺傳復雜性和對環(huán)境脅迫的不耐受性，尤其是干旱脅迫，導致苜蓿產(chǎn)量和品質不穩(wěn)定［19］。研究紫花苜蓿發(fā)育過程和逆境耐受機制，對于培育優(yōu)質苜蓿種質資源至關重要。本研究對紫花苜蓿GRF基因家族進行了全基因組分析，表征了GRF的系統(tǒng)發(fā)育關系、基因結構及順式作用元件，檢測了不同GRF成員響應干旱的轉錄譜，研究結果有助于揭示紫花苜蓿的耐旱機制以及為未來紫花苜蓿的基因工程改良提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和培養(yǎng)方法

試驗2023年2—5月于河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院植物培養(yǎng)室中進行。供試紫花苜蓿（Medicago sativa）品種為勁能5020，購自河南合博草業(yè)有限公司。

1.2 紫花苜蓿GRF基因的全基因組分析

1.2.1 紫花苜蓿GRF基因家族成員的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

擬南芥（Arabidopsis thaliana，At）、大豆（Glycine max，Gm）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula，Mt）和水稻（Oryza sativa，Os）的GRF通過搜索NCBI的基因數(shù)據(jù)庫下載。為了鑒定紫花苜蓿中潛在的GRF蛋白序列，在Figshare數(shù)據(jù)庫（https：//figshare.com/articles/dataset/）中下載得到所有的紫花苜蓿GRF，并設置為隱馬爾可夫模型文件。并基于上述作物的GRF蛋白序列進行BLAST搜索，使用簡單模塊化架構研究工具數(shù)據(jù)庫（http：//smart.embl-heidelberg.de/）檢查候選序列以鑒定包含WRC結構域（PF08879）和QLQ結構域（PF08880）的GRF蛋白序列，然后使用HMMER v3.03對HMM進行搜索和檢索序列，并采用SMART4（http：//smart.embl.de/）和Batch-CDD （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）重復篩選以去除GRF保守結構域不完整的蛋白質，從而獲得非冗余序列，并命名為MsGRF。

1.2.2 MsGRF的理化性質表征與系統(tǒng)發(fā)育分析

采用ExPASy工具（https：//web.expasy.org/protparam/）分析推定MsGRF蛋白質序列的蛋白質長度、分子量（Mw）及等電點（PI）；采用NCBI的開放閱讀框（ORF）工具（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/gorf.html）確定ORF的長度。隨后，采用Clustal W6進行多序列比對，并導入所有AtGRF、GmGRF、OsGRF、MtGRF、MsGRF蛋白序列，使用MEGA 7.0在線軟件（https：//www. megasoftware.net/）中的鄰接法生成系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設置為1 000，其余參數(shù)為默認值［20］。

1.2.3 MsGRF染色體定位、基因結構和啟動子順式元件分析

紫花苜蓿GRF基因的染色體位置從基因組組裝平臺（https：//figshare.com/projects/whole_genome_sequencing_and_assembly_of_Medicago_sativa/）獲取，并采用TBtools（shttps：//github.com/CJ-Chen/TBtools）繪制染色體分布圖。采用基因結構顯示服務器（GSDS）（http：//gsds.gao-lab .org/）以獲得紫花苜蓿GRF家族成員的內含子-外顯子特征。利用MEME在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）對保守基序進行預測。使用PlantCARE 10預測MsGRF啟動子上游2 000 bp序列中的順式作用元件，并采用TBtools可視化順式作用元件。

1.3 MsGRF基因轉錄組數(shù)據(jù)的獲取與表達分析

利用MsGRF家族成員的基因序列在紫花苜蓿參考轉錄組數(shù)據(jù)庫（https：//figshare.com/projects/）進行blast比對，下載獲得的默認格式文件轉換為 .fastq 格式，再將fastq通過.Trim Galore軟件（http：//bioinformatics.babraham.ac.uk/）進行質控。質控后的高質量序列采用利用RNA-Seq數(shù)據(jù)量化軟件kallisto軟件（0.43.1版本）進行定量，定量獲取的數(shù)值以TPM表示，通過TBtools進行熱圖可視化［21］。

1.4 相關MsGRF的篩選及qRT-PCR分析

1.4.1 供試紫花苜蓿植物的培養(yǎng)方法

挑選飽滿尺寸一致的種子在0.8%次氯酸鈉中消毒3 min，以流動蒸餾水沖洗5次；采用豆科植物育苗基質將紫花苜蓿種子在人工氣候室中培養(yǎng)28 d，土壤含水率保持為80%～85%，干旱處理則加入15 mL 5%的甘露醇模擬干旱脅迫。在各時間點取樣時采用PBS緩沖液進行快速沖洗并液氮速凍保存于-80 ℃環(huán)境以用于植株RNA提取。

1.4.2 紫花苜蓿RNA的提取及RT-qPCR分析

將紫花苜蓿樣品（250 mg）采用液氮快速研磨，按照RN38EASYspin Plus植物提取試劑盒相關說明提取樣品總RNA，采用使用Thermo Scientific的反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄cDNA。采用Primer 6.0軟件設計擴增引物（表1），以Actin作為內參基因。PCR體系、擴增條件及熱循環(huán)程序參照蘇倩等的方法［22］，使用Thermo Scientific Stepone plus 6x熒光定量PCR儀的實時檢測系統(tǒng)進行RT-qPCR分析，采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2019進行數(shù)據(jù)整理，采用DPS 14.0進行單因素方差分析，采用相應在線繪圖工具、R軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 MsGRF家族的理化性質特征分析

同源性搜索在紫花苜蓿基因組中獲得了22個推定的GRF蛋白序列，在去除不完整QLQ、WRC結構域序列后，根據(jù)Figshare數(shù)據(jù)庫中蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）和NCBI數(shù)據(jù)庫中擬南芥（Arabidopsis thaliana）的分類，采用遞次命名法從紫花苜蓿基因組識別出8個完整的生長調節(jié)因子成員MsGRF1～MsGRF8?；贓xPASy檢測相關MsGRF物理和化學特性可知，紫花苜蓿GRF基因家族蛋白質長度224～516 aa，分子量在25.38～56.22 ku，等電點為6.28～10.25，其中僅MsGRF6為酸性蛋白（等電點gt;7.0），其他均為堿性蛋白。亞細胞定位預測顯示，紫花苜蓿MsGRF3、MsGRF5位于細胞質中，其他6個MsGRF成員均位于細胞核中；且所有蛋白親水指數(shù)均為正值，表示成員均為疏水蛋白（表2）。

2.2 MsGRF家族成員鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

為了系統(tǒng)地揭示紫花苜蓿生長調節(jié)因子蛋白（MsGRF）、擬南芥生長調節(jié)因子蛋白（AtGRF）、大豆生長調節(jié)因子蛋白（GmGRF）、蒺藜苜蓿生長調節(jié)因子蛋白（MtGRF）、水稻生長調節(jié)因子蛋白（OsGRF）成員的進化關系，基于氨基酸序列的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。通過對MsGRF與上述不同植物蛋白質序列的同源比較分析，8個MsGRF、9個AtGRF、20個GmGRF、8個MtGRF、12個OsGRF，共67個生長調節(jié)因子蛋白可分為5個不同的亞家族。其中，C組是數(shù)量最少的亞家族，包含2個成員，A組是數(shù)量最多的亞家族，包含18個成員。對MsGRF進行分組，結果顯示A、B、D、E亞家族分別包含3、1、3、1個成員。

2.3 MsGRF基因結構和蛋白質序列比對分析

由圖2-A可知，基因結構顯示服務器（GSDS）預測MsGRF的外顯子-內含子結構以深入了解紫花苜蓿在基因進化過程中的變異情況，結果表明，MsGRF1擁有最多的內含子（10個），其他MsGRF成員外顯子數(shù)量在3～7個，且內含子長度可達 2.8 kb；而所有的MsGRF成員皆含有5個或6個外顯子。

為了更好地了解GRF蛋白序列的特征，對覆蓋QLQ和WRC結構域的最保守區(qū)域進行了分析。結果表明，8個MsGRF蛋白都具有相同的QLQ和WRC氨基酸序列，并且這2個結構域之間的序列高度保守，而TQL結構域僅存在于一些與擬南芥GRF成員相似的MsGRF成員（MsGRF1、MsGRF3）C端（圖2-B）。

2.4 MsGRF啟動子中的順式元件分析

使用PlantCARE數(shù)據(jù)庫分析了8個MsGRF基因的上游序列，分析結果表明，紫花苜蓿GRF啟動子區(qū)域包含光照響應、MYB轉錄因子、植物激素元件（ABA、GA、SA、Me-JA）以及厭氧誘導元件等一系列元件（圖3），這些順式元素是響應非生物應激反應的重要組成部分。例如，MsGRF7、MsGRF8含有與冷脅迫相關的順式元件，而MsGRF8、MsGRF6、MsGRF2、MsGRF1含有脫落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（Me-JA）、水楊酸（SA）及赤霉素（GA）等激素反應元件；MsGRF3、MsGRF4、MsGRF5的啟動子特異地含有1個與分生組織表達相關的元件，表明這些GRF基因可能與分生組織的生長發(fā)育有關。

2.5 MsGRF的染色體定位分析

為確定紫花苜蓿生長調節(jié)因子基因在染色體上的位置和相關基因擴增片段區(qū)域，以97%序列相似性為標準將MsGRF映射到相應染色體錨定支架上，TBtools可視化顯示8個MsGRF均可被定位到7條染色體上（圖4），且不均勻地分布于不同染色體臂的遠端區(qū)域。其中7號染色體擁有最多的MsGRF（MsGRF3、MsGRF4），其他染色體上均包含1個MsGRF。

2.6 MsGRF基因在不同組織中的RNA-seq表達譜分析

根據(jù)轉錄組數(shù)據(jù)分析了紫花苜蓿的6種組織，包括根瘤、花序、分枝莖、幼嫩莖、主莖、根系；其中，MsGRF1在多種組織中表現(xiàn)出較高的表達水平，尤其是在根系和幼嫩莖中。3個基因（MsGRF2、MsGRF3、MsGRF4）在所有組織中均具有相對較低的表達水平。MsGRF7基因在根瘤中的表達水平高于其他基因。MsGRF5、MsGRF6和MsGRF8在幼嫩莖和花序中的表達量比在其他組織中要高（圖5-A）。通過qPCR分析，發(fā)現(xiàn)MsGRF4在花中表現(xiàn)出最高的表達水平，這與圖5-A的結果大體一致。分析表明，MsGRF1基因在根系和花序中的表達水平遠高于主莖和葉片，同時亦高于所有其他MsGRF基因（圖5-B）。

2.7 干旱脅迫下MsGRF基因的RT-qPCR分析

綜合圖5可知，MsGRF在根系的表達水平較高，因此以根系為主要測定對象，探索了干旱脅迫下各基因的實時表達水平。由圖6可知，在不同時間點（0、2、4、8、12、24 h）下不同MsGRF表達模式存在明顯差異。其中，MsGRF2、MsGRF4全部時間點鐘中的表達水平皆較低。MsGRF3、MsGRF5、MsGRF6、MsGRF7、MsGRF8在干旱處理0 h時處于較高水平，而后略微增加，而在干旱處理24 h后皆具有最低水平。就MsGRF1表達水平而言，干旱處理0 h時，表達水平較低，而在處理2、4、8、12 h中均保持較高的相對表達量（58.0～83.1），在處理24 h后，相對表達量降低，但仍處于較高水平（45.8）。

3 討論與結論

生長調節(jié)因子是植物特有的轉錄因子，可作用調節(jié)早期植物形態(tài)發(fā)生和根部發(fā)育，在作物產(chǎn)量和抗性遺傳改良中發(fā)揮著關鍵作用［23］。本研究中，在紫花苜蓿中鑒定得到22個待定蛋白，多重序列比較進一步發(fā)現(xiàn)僅8個GRF成員（MsGRF）同時含有完整的QLQ結構域和WRC基序。GRF的數(shù)量因植物而異，一般而言，植物中GRF成員的數(shù)量在8～27個之間［24］。以往的研究表明，大豆、水稻、番茄、玉米以及馬鈴薯中的GRF基因數(shù)量更多；植物物種間GRF基因數(shù)量的差異可能歸因于基因的串聯(lián)重復和片段復制。ExPASy檢測表明，MsGRF蛋白質長度224～516 aa，分子量25.38～56.22 ku，所有的MsGRF成員均為疏水蛋白，且大多數(shù)成員呈堿性。亞細胞定位預測表明，除MsGRF3、MsGRF5位于細胞質外，其余MsGRF成員均位于細胞核中。

基因的結構和氨基酸結構是決定其轉錄水平與表達強弱的重要條件，基因結構已被確定為該基因可編輯性的重要特征之一［25］。本研究中，所有的MsGRF成員的QLQ結構域和WRC基序皆存在于N末端（圖2-B）。這一觀察結果與水稻、擬南芥和大豆等模式植物［12-16］觀察到的結果一致。本研究發(fā)現(xiàn)QLQ和WRC的N末端結構是MsGRF家族的基本構架，但TQL結構域的C端僅存在于少數(shù)MsGRF成員中，因此推測 MsGRF蛋白的功能多樣性可能取決于C端結構域的多樣性［5］。本研究中，基因結構分析表明，不同MsGRF成員的外顯子數(shù)量差異較小，但內含子數(shù)量差距較大（3～10個）；這與擬南芥的內含子特征相似，表明MsGRF的系統(tǒng)發(fā)育關系與其相應的基因結構和保守基序具有密切關系［4］。內含子特征與基因進化有關，更多和更長的內含子往往存在于高表達的基因中，并可能導致基因的功能多樣化［26］。

基因表達受不同途徑的順式作用元件和反式作用因子的復雜相互作用調節(jié)［27］，之前的研究表明，生長調節(jié)因子基因可被不同的順式元件模塊誘導［6，13，28］。本研究結果表明，MsGRF基因的啟動子包含各種應激反應元件，如冷反應、光誘導及植物激素元件。部分MsGRF成員基因啟動子中還具有防御和應激反應元件、厭氧誘導以及植物激素（ABA、GA、SA、Me-JA）元件，這些結果表明MsGRF基因也可能通過介導活性氧代謝系統(tǒng)從而參與應對非生物脅迫及植物生長發(fā)育。據(jù)報道，與AtGRF7同源的基因可以結合DREB2A啟動子并在非應激條件下抑制其表達。然而，值得注意的是，非生物脅迫會抑制AtGRF7表達，從而激活滲透脅迫響應基因［29］。本研究中，MsGRF1、MsGRF3、MsGRF4含有更多的ABA響應元件（ABRE元素）并且可能可以有效地響應滲透壓。因此，MsGRF1、MsGRF3、MsGRF4在調節(jié)苜蓿脅迫滲透壓方面可能與AtGRF7具有相似的功能。

水資源短缺造成的干旱脅迫是影響全球植物生長的主要非生物脅迫類型［30］，因此提高植物（如紫花苜蓿）的干旱耐受性極其重要［31］。本研究中，通過RNA-seq技術，發(fā)現(xiàn)幼嫩莖和根系中的MsGRF轉錄水平高于其他組織，且qPCR分析表明MsGRF在根系的轉錄水平較高。這些發(fā)現(xiàn)表明苜蓿中的GRF可能主要在調節(jié)種子發(fā)芽和根系發(fā)育過程中發(fā)揮作用。先前的研究已證實GRF可通過調節(jié)植物生長的復雜過程和對環(huán)境脅迫的反應來發(fā)揮作用［29］。例如，干旱脅迫下，OsGRF1可以調節(jié)赤霉酸（GA）誘導的莖伸長和轉錄活性［32］。對于干旱脅迫，綜合而言根系比其他器官更敏感，因此基于實時熒光定量（RT-qPCR）分析了根系MsGRF對干旱脅迫的響應。結果表明，8個MsGRF在干旱脅迫的不同時間點中均發(fā)生明顯變化，但不同MsGRF的表達模式存在一定差異，表明MsGRF成員在物種進化過程中受到了不同程度的影響。其中在干旱處理0 h時，MsGRF1相對表達量較低，此后的24 h內一直保持較高水平，表明MsGRF1在紫花苜蓿響應干旱脅迫反應中發(fā)揮關鍵作用。

本研究結果表明，從紫花苜蓿中共鑒定出8個MsGRF，可分為4個亞家族，分布于7條染色體上。這些MsGRF在氨基酸序列、基序組成方面表現(xiàn)出高度相似性，在基因結構具有一定差異性。8個MsGRF蛋白質的長度為224～516 aa，分子量為25.38～56.22 ku，絕大多數(shù)MsGRF為堿性蛋白且皆具有疏水性質?；赗NA-seq、qPCR分析表明，MsGRF主要在幼嫩部位和根系中具有較高的表達活性。RT-qPCR分析表明，8個MsGRF基因中，2個（MsGRF2、MsGRF4）在干旱脅迫下無明顯變化，6個（MsGRF1、MsGRF3、MsGRF5、MsGRF6、MsGRF7、MsGRF8）在干旱處理0 h時較低，隨著干旱處理時間的延長，呈被誘導上調表達而后降低；以MsGRF1表達水平最為顯著，表明MsGRF1可能是耐旱的關鍵候選基因。研究結果為揭示MsGRF的進化和功能提供了理論依據(jù)，也為紫花苜蓿的育種改良提供了潛在靶點。

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收稿日期：2024-02-28

基金課題：河南省科技計劃（編號：182102110469）。

作者簡介：孫龍飛（1985—），女，河南魯山人，碩士，講師，從事園林植物資源應用方向研究。E-mail：Zjjin0726@163.com。

通信作者：黃 萍，碩士，副教授，從事從事園林植物資源應用研究。E-mail：hhappy2000@163.com。