摘要：玉米是我國重要的糧食作物之一，也是常用的飼料作物，選育優(yōu)良玉米品種對保障糧食安全和促進農(nóng)業(yè)發(fā)展有非常重要的作用。通過使用單倍體育種技術(shù)，可以將純系的育種時間從6～7代縮短為1～2代，從而加快育種進程，提升優(yōu)良品種的選育效率。對玉米單倍體育種技術(shù)研究進展和高效評價方法進行綜述，包括誘導(dǎo)系的選擇和加倍方法的篩選。目前，DH系生產(chǎn)的工程化水平顯著提高。在單倍體評價過程中，通過田間觀察篩選、分子檢測篩選、全基因組選擇技術(shù)開展了DH系的高效評價研究。玉米單倍體育種技術(shù)與全基因組選育技術(shù)的有機結(jié)合，有助于高效篩選出符合育種要求的DH系，進一步提升單倍體工程化應(yīng)用效率，在育種過程中具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：單倍體；DH系；玉米；篩選；全基因組選擇

Development Status and Efficient Application Prospect of

Maize Haploid Breeding Technology

XU Liyuan，WANG Liming，REN Zhengpeng，SHE Ning?an，WANG Limei，

LIU Fang，MA Xiaochuan，LI Hailiang，CUI Mingliang

（Hefei Fengle Seed Industry Co.，Ltd.，Hefei 230088）

玉米育種過程中一個關(guān)鍵的步驟是穩(wěn)定純系的獲得，單倍體育種技術(shù)通過誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體植株并進行染色體加倍，迅速獲得純合的自交系，這一過程相較于傳統(tǒng)方法大大縮短了育種周期，僅需一代即可達到純合狀態(tài)，從而快速鎖定目標(biāo)性狀。經(jīng)過世界各地的學(xué)者和專家在高效誘導(dǎo)系創(chuàng)制、單倍體的穩(wěn)定加倍技術(shù)以及分子生物學(xué)工具整合等方面的不斷突破，玉米單倍體遺傳改良取得了顯著進展，誘導(dǎo)系的效率得到了大幅提升，使得在實驗室條件下更可靠地產(chǎn)生單倍體植株成為可能。同時，通過細(xì)胞學(xué)方法和分子標(biāo)記技術(shù)準(zhǔn)確鑒定單倍體，并利用化學(xué)或物理方法促進染色體自然加倍，已形成了一個高效的單倍體育種體系。該技術(shù)具有明顯的工程化特征，目前已開始大規(guī)模應(yīng)用[1]。我國在這一領(lǐng)域不斷完善技術(shù)、提升效率，每年產(chǎn)出雙單倍體（DH）系數(shù)量可達千萬以上，該技術(shù)已被列為現(xiàn)代玉米核心育種技術(shù)[2]。

1 單倍體誘導(dǎo)系研究進展

玉米首個誘導(dǎo)系Stock6，該誘導(dǎo)系為孤雌生殖，但農(nóng)藝性狀差，其誘導(dǎo)率平均只有2.52%，自交結(jié)實困難[3]，嚴(yán)重限制了單倍體技術(shù)的發(fā)展。經(jīng)過幾十年的研究和探索，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)通過將高油玉米育種材料與Stock6進行雜交篩選，得到誘導(dǎo)率達5.80%的誘導(dǎo)系——農(nóng)大高誘1號[4]，取得較大突破。2007年才卓等[5]育成的吉高誘系3號，其平均誘導(dǎo)率可達10.40%，有明顯的顯色標(biāo)記，植株整體花粉量大，抗病抗逆性強。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)2017年通過全基因組測序技術(shù)克隆了玉米單倍體誘導(dǎo)基因（ZmPLA1）[6]，發(fā)現(xiàn)該基因是最有可能的qhir1區(qū)域的候選基因。隨后利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)敲除ZmPLA1進行基因功能驗證，結(jié)果顯示ZmPLA1敲除系對測試植株HIR的影響與Stock6相似。2019年Zhong等[7]采用圖位克隆技術(shù)，定位了qhir8的候選基因，命名為ZmDMP，同時突變ZmPLA1和ZmDMP，誘導(dǎo)率可達到7.00%。2022年Jiang等[8]解析玉米單倍體誘導(dǎo)關(guān)鍵基因發(fā)生的分子機制，研究發(fā)現(xiàn)，精細(xì)胞中活性氧（ROS）增多是誘導(dǎo)玉米單倍體產(chǎn)生的關(guān)鍵因素，通過對關(guān)鍵因素的剖析，鑒定了一個全新的誘導(dǎo)單倍體發(fā)生的新基因ZmPOD65，研發(fā)出用化學(xué)試劑處理花粉從而誘導(dǎo)單倍體發(fā)生的新方法。Chen等[9]通過共表達轉(zhuǎn)錄因子ZmC1 和ZmR2形成紫胚玉米新種質(zhì)與高效單倍體誘導(dǎo)系CAU6融合，創(chuàng)制出不受材料背景的影響、單倍體鑒別準(zhǔn)確率達99.10%的玉米誘導(dǎo)系MAGIC1（Maize Anthocyanin Gene InduCer 1）和升級版MAGIC2，使得鑒別單倍體胚時間從傳統(tǒng)的授粉后21d縮短到了9d，同時保持了高準(zhǔn)確率。玉米單倍體誘導(dǎo)系的不斷創(chuàng)新，使得單倍體誘導(dǎo)過程越來越便捷、單倍體籽粒產(chǎn)出效率越來越高。籽粒高油誘導(dǎo)系、紫根苗誘導(dǎo)系、超前顯色誘導(dǎo)系等一系列改良提升了誘導(dǎo)系在不同環(huán)境條件下的適應(yīng)性，確保誘導(dǎo)效率和鑒定準(zhǔn)確率不受地域、季節(jié)變化的影響，使該技術(shù)能夠在全球范圍內(nèi)推廣使用。

2 玉米單倍體加倍技術(shù)研究進展

2.1 自然加倍法 利用玉米誘導(dǎo)系材料誘導(dǎo)單倍體，通過自然加倍成DH系，是構(gòu)建玉米DH系的一種操作簡便且快速有效的方法。較早時期Eder等[10]通過試驗證實不同基因型母本誘導(dǎo)率之間有顯著差異，張如養(yǎng)等[11]將不同類群的骨干自交系作為母本材料，利用6個玉米單倍體誘導(dǎo)系對自交系進行誘導(dǎo)，得出6個不同誘導(dǎo)系的誘導(dǎo)率依次為京科誘043（6.06%）gt;京科誘044（5.45%）gt;京科誘045（5.24%）gt;京科誘006（4.11%）gt;京科誘041（2.45%）= 京科誘005（2.45%）。徐國良等[12]以雜交種不同種質(zhì)的混粉群體及單交種為母本材料，得出不同種質(zhì)材料的單倍體自交結(jié)實率差異較大的結(jié)論，Reid群最高為13.01%，Lancaster群較低為2.30%。黎亮等[13]以20個雜交種為母本材料進行單倍體誘導(dǎo)，結(jié)果表明高頻材料的單倍體頻率約為低頻材料的5倍。李國良等[14]通過試驗證明農(nóng)大高誘1號對塘四平頭、旅大紅骨、Lancaster、Reid 四大種質(zhì)類群和熱導(dǎo)地方種質(zhì)群的平均誘導(dǎo)率為3.90%，不同類群間存在顯著差異，其中對Reid群誘導(dǎo)率最高，對熱導(dǎo)地方種質(zhì)類群最低。蔡泉等[15]研究結(jié)果表明，5個誘導(dǎo)系（高誘1號、高誘2號、Y01、Y02、Y04）中單倍體誘導(dǎo)率最高的是Y04，達到8.90%，最低的是高誘2號，為6.16%，不同群體間Reid血緣的誘導(dǎo)率較高，5個誘導(dǎo)系平均達到了8.54%，Lancaster血緣的誘導(dǎo)率最低，平均為6.38%。在誘導(dǎo)系實際應(yīng)用過程中，要根據(jù)母本材料類型制定試驗計劃，才能收獲理想DH系株數(shù)。

不同地域加倍效果也不同，要根據(jù)品種的加倍時間，選擇合適的加倍地點。段民孝等[16]在甘肅、北京、海南3個地方開展玉米自然加倍試驗，結(jié)果表明：同一材料自然加倍效率隨著種植地點不同差異明顯，比較有利的時間、地點是甘肅春季播種和海南冬季播種。慈佳賓等[17]在長春、榆樹和白城分別種植同一種玉米基礎(chǔ)材料，研究得出在長春種植加倍率顯著高于榆樹和白城。蔡泉等[18]在海南和黑龍江設(shè)4個玉米材料組合加倍，經(jīng)過驗證，黑龍江平均加倍率（4.42%），海南平均加倍率（7.61%）。

2.2 人工加倍法 人工加倍單倍體過程要使用加倍試劑，考慮藥劑的毒性、對環(huán)境的影響和成本因素，一般使用秋水仙素配合助滲劑（二甲基亞砜）以及細(xì)胞分裂素等[19]，將秋水仙素濃度控制在0.06%加倍效果最佳。也有研究人員通過使用除草劑達到加倍效果，惠國強等[20]比較了3種除草劑對玉米單倍體成熟胚的加倍效果，發(fā)現(xiàn)10μmol/L的甲基胺草磷的效果最好，對先玉335、中地88和鄭單958的加倍率分別為 85.16%、80.20%和 66.30%。

人工加倍方法使用較為廣泛的有浸種、切芽、注射、組織培養(yǎng)加倍等[21]。通過研究不同的加倍方法可提高單倍體技術(shù)的應(yīng)用范圍，文科等[22]對單倍體不同加倍方法進行對比，證明對植株傷害比較嚴(yán)重的是浸根法和注射法，加倍效果最好的是浸種法。張坤明等[23]將種子浸泡在秋水仙素溶液中12h表現(xiàn)最佳，其成活率、散粉率、結(jié)實率分別達到了78.57%、57.14%、19.64%。王賀等[24]將單倍體種子在秋水仙素溶液（0.07%）中浸芽處理8h，加倍率達16.5%。劉俊等[25]利用秋水仙素溶液（0.06%），使用浸根、滴注心葉、注射生長點的方法分別對單倍體籽粒進行加倍，結(jié)果證實注射生長點的方法可以使單倍體成株散粉率和結(jié)實率得到提升，平均加倍率達到23%。人工加倍過程中處理方式、藥劑濃度、單倍體籽粒處理時間等因素不同，加倍效果存在較大差異，在加倍過程中要多次嘗試，選擇適合的加倍方案。

3 玉米DH系高效評價方法

由于玉米DH系生產(chǎn)具有階段性，育種家需要短期聚集大量的人員完成階段性工作，因此一些DH系生產(chǎn)服務(wù)公司應(yīng)運而生。DH系生產(chǎn)服務(wù)公司的成熟技術(shù)，使國內(nèi)單倍體育種規(guī)模越來越大。巨大的生產(chǎn)量，帶來的問題是眾多新生產(chǎn)的DH系如果全部測配，必定浪費較多的人力物力與時間，技術(shù)應(yīng)用的主要瓶頸是DH系大規(guī)模生產(chǎn)和材料評價能力之間效率不同，單倍體工程化育種的重點逐步向高效評價DH系轉(zhuǎn)變，總結(jié)部分評價方法如下。

3.1 田間觀察篩選

3.1.1 “兩步法”測配 DH系鑒定評價需要考慮到不同環(huán)境和不同品種，評價過程中規(guī)劃測試小區(qū)的計算方法是DH系數(shù)量×測驗種數(shù)量×測試環(huán)境數(shù)量。如每份基礎(chǔ)材料產(chǎn)生1000個DH系，在5個不同生態(tài)區(qū)，使用3種不同測驗種進行測交，要1.5萬個小區(qū)，對很多育種單位來說，土地租賃面積有限，增加測試區(qū)域難度較大。為了降低經(jīng)濟成本，減少土地使用量，可以采取“兩步法”進行選擇，第1年使用一個測驗種在較少地點進行測試，經(jīng)過篩選后，第2年再利用多個測驗種在多地進行測試[26]。

3.1.2 田間DH系種植篩選 在田間像測試雜交組合一樣高標(biāo)準(zhǔn)種植DH系，對所有DH系實施相同的灌溉、施肥、病蟲害防治措施。組配前后多次觀察、記錄，大量淘汰綜合性狀不符合育種要求的DH系。制定詳細(xì)的管理日志，記錄每次操作的時間、方法和用量，確保各處理組之間的一致性。從播種到收獲的全過程中，系統(tǒng)地記錄生長發(fā)育指標(biāo)（株高、分蘗數(shù)、開花期等）、產(chǎn)量、品質(zhì)參數(shù)等。利用現(xiàn)代信息技術(shù)，如無人機監(jiān)測、圖像識別等手段，可以提高數(shù)據(jù)收集的效率和準(zhǔn)確性。

3.2 分子檢測篩選 使用雜交F2世代開展單倍體誘導(dǎo)生產(chǎn)DH系比使用F1能夠獲得更多需要的材料。只選擇目標(biāo)基因F2個體用于DH系的生產(chǎn)，DH系的生產(chǎn)成本和評價成本將大大減少。分子檢測可以作為自交系DH系評價的第一個漏斗[27]，在F2世代誘導(dǎo)可以與分子檢測相結(jié)合，通過分子標(biāo)記技術(shù)（如SSR、SNP等）定期對種植的DH系進行遺傳純度驗證，確保植株的基因型保持一致，排除可能的突變或污染。

3.3 玉米DH系高效育種 設(shè)計育種正引領(lǐng)著作物育種領(lǐng)域的一場革命[28]，隨著智能設(shè)計育種階段的到來，單倍體育種技術(shù)結(jié)合基因編輯工具（如CRISPR-Cas9）、高通量分子標(biāo)記、全基因組選擇等[29]，極大地加速了優(yōu)良性狀的篩選和固定過程，標(biāo)志著玉米育種進入了前所未有的高效時代。高效育種體系能夠應(yīng)用的基礎(chǔ)條件需要有以下幾個方面：一定的DH系、高質(zhì)量的表型鑒定、經(jīng)濟的基因型分析、可靠的統(tǒng)計建模。開展全基因組選擇育種需要建立統(tǒng)計模型[30]，通過田間數(shù)據(jù)記載獲得每個個體的性狀表型值，對材料進行基因分型測序，獲得SNP基因型，并估計SNP效應(yīng)值用于后續(xù)分析。高通量分子標(biāo)記技術(shù)讓研究人員能夠大規(guī)模地對整個基因組進行掃描，識別與特定性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，以實現(xiàn)對表型的預(yù)測。通過設(shè)計育種[31]，使得在早期世代就能預(yù)測植株的表現(xiàn)成為可能，提高DH系選擇的準(zhǔn)確性，加快了優(yōu)良基因型的鑒定速度。目前國內(nèi)科研團隊提出了一種可以降低成本的體系構(gòu)建思路，育種家根據(jù)這些DH系本身的表型，先做篩選，淘汰掉大量有嚴(yán)重缺陷的DH系，僅把有希望的DH系做訓(xùn)練群體檢測基因型，建立統(tǒng)計模型進行篩選。

4 小結(jié)與展望

隨著單倍體技術(shù)應(yīng)用過程中各環(huán)節(jié)技術(shù)的不斷完善，該技術(shù)已在玉米育種工作中廣泛應(yīng)用。通過創(chuàng)制材料的DH系，可以增加玉米基礎(chǔ)材料的遺傳多樣性，得到新的突變體。在育種過程中對DH系的需求量增大，需要逐步擴大國內(nèi)低成本規(guī)?；疍H系生產(chǎn)系統(tǒng)，整合數(shù)據(jù)分析技術(shù)，建立高通量DH系評價，形成智慧育種新模式，縮短育種周期，構(gòu)建玉米高效育種材料選擇體系，促進玉米商業(yè)化育種進入精準(zhǔn)化的新階段，推動現(xiàn)代種業(yè)與人工智能、大數(shù)據(jù)等前沿科技深度融合，更快地響應(yīng)市場需求和環(huán)境變化，為全球糧食安全和可持續(xù)發(fā)展貢獻力量。

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（收稿日期：2024-06-11）

基金項目：安徽省重點研究與開發(fā)計劃（2023n06020023）

通信作者：崔明亮