摘要：為提高以前體形式合成的蛋白質(zhì)折疊與成熟效率，以枯草桿菌蛋白酶SprD為研究對(duì)象，通過(guò)蛋白重組表達(dá)、氨基酸定點(diǎn)突變、包涵體純化結(jié)合體外復(fù)性、酶催化性能測(cè)定等方法比較各前體蛋白折疊成熟情況。結(jié)果表明，野生型前導(dǎo)肽介導(dǎo)的SprD前體蛋白可以在230 min內(nèi)完成成熟，時(shí)間較長(zhǎng)；成熟肽序列中E112A、S221A及S221C等突變導(dǎo)致相應(yīng)前體蛋白成熟時(shí)間延長(zhǎng)或成熟失??；而前導(dǎo)肽串聯(lián)表達(dá)和切割位點(diǎn)酪氨酸缺失等措施可以將蛋白成熟時(shí)間縮短至80～160 min，成熟效率提高0.5～2.0倍，且成熟酶催化能力不受影響。前導(dǎo)肽序列中單個(gè)氨基酸位點(diǎn)改變對(duì)蛋白成熟影響較小，但對(duì)酶催化能力提升有一定幫助。因此，前導(dǎo)肽介導(dǎo)的蛋白成熟與酶催化能力的改變是2個(gè)相對(duì)獨(dú)立的過(guò)程，前導(dǎo)肽表達(dá)方式與切割位點(diǎn)變化是促進(jìn)蛋白體外成熟的較優(yōu)方案。研究結(jié)果為加速蛋白成熟與蛋白改造提供了可參考方法。

關(guān)鍵詞：前導(dǎo)肽；SprD蛋白；蛋白復(fù)性；折疊；成熟

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0176

中圖分類號(hào)：Q816 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008‐0864（2024）09‐0054‐08

枯草桿菌蛋白酶是由芽孢桿菌類產(chǎn)生的一類絲氨酸蛋白酶，可以水解蛋白質(zhì)為肽段或氨基酸，被廣泛用于洗滌劑、羽毛降解和食品加工等行業(yè)[1]。這類蛋白以前體蛋白形式合成，并在自身前導(dǎo)肽作用下折疊為具有催化活性的成熟酶[2-4]。已報(bào)道的α-水解蛋白酶、脂肪酶、角蛋白酶等也具有同樣的特征[5-7]。成熟肽多由1個(gè)含275個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈構(gòu)成，歷經(jīng)折疊、自加工和前導(dǎo)肽釋放與降解等階段才得以成熟，保守D、H和S氨基酸構(gòu)成其催化中心三聯(lián)體[2-4]。在前2個(gè)階段，前導(dǎo)肽介導(dǎo)前體蛋白折疊和加工，并與自身形成穩(wěn)定的抑制復(fù)合物[8‐9]。前導(dǎo)肽從復(fù)合物中釋放與降解才最終預(yù)示著成熟酶的激活，這也是蛋白成熟速率的決定步驟[8-10]。然而，體外研究顯示，蛋白成熟需約240 min，時(shí)間較長(zhǎng)[8‐9]。為提高蛋白成熟效率，在單位時(shí)間獲取更多有活性功能的酶，本研究以枯草桿菌蛋白酶SprD為研究對(duì)象探索相關(guān)方法與途徑。

SprD蛋白（登錄號(hào)No. KC153302）是芽孢桿菌屬中發(fā)現(xiàn)的與枯草桿菌蛋白酶E 蛋白（No.CAA74536）具有相似氨基酸構(gòu)成與底物水解功能的成員，并在前導(dǎo)肽作用下完成體內(nèi)折疊與成熟[11]。但是，該蛋白折疊過(guò)程與成熟機(jī)制尚不清晰。研究發(fā)現(xiàn)，前導(dǎo)肽不僅促進(jìn)蛋白體內(nèi)成熟，還將其氨基酸信息印記至成熟肽，進(jìn)而使具有一致氨基酸序列的成熟肽具備不同催化能力，也即“蛋白記憶”模式[10]。基于此，改變前導(dǎo)肽序列提升酶催化能力的策略被廣泛采納。然而是否還有更優(yōu)的提升蛋白成熟方案需進(jìn)一步驗(yàn)證。大腸桿菌具有清楚的遺傳背景與表達(dá)體系，是研究蛋白重組表達(dá)的模式生物。本研究利用前體蛋白重組表達(dá)結(jié)合體外復(fù)性研究蛋白折疊成熟不僅排除了原宿主干擾，還為蛋白成熟效率及催化性能的提高提供可能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

E.coli DH5α 菌株、E.coli BL21（DE3）、產(chǎn)SprD蛋白酶的Bacillus sp. L010 由本試驗(yàn)室保存。pMD19-T為亞克隆載體，pET28a為表達(dá)載體。LB培養(yǎng)基由蛋白胨1%、酵母膏0.5%與氯化鈉1%組成，根據(jù)需要添加氨芐青霉素或卡那霉素，終質(zhì)量濃度分別為100、50 μg·mL-1。引物合成與測(cè)序由華大基因完成?；瘜W(xué)合成底物succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide （AAPF）購(gòu)自Sigma（美國(guó)）。pMD19-T、Ex Taq polymerase、限制性內(nèi)切酶等分子試劑購(gòu)于TaKaRa（日本）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 載體構(gòu)建

以Bacillus sp. L010 基因組為模板擴(kuò)增前體蛋白對(duì)應(yīng)的基因片段pro-sprD，并將其亞克隆至pMD19-T，經(jīng)序列測(cè)定驗(yàn)證后重組至表達(dá)載體pET28a（酶切位點(diǎn)為Nco I與Xho I）。采用重疊PCR進(jìn)行定點(diǎn)突變構(gòu)建含突變體前體蛋白的載體，具體方法參照文獻(xiàn)[12]。引物見(jiàn)表1。

1.2.2 蛋白誘導(dǎo)與重組表達(dá)

重組載體轉(zhuǎn)化BL21（DE3），37 ℃培養(yǎng)至OD600=0.6，加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代- β -D- 半乳糖苷（Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside，IPTG）至終含量0.3 mmol·L-1，37 ℃誘導(dǎo)4～6 h，離心收集樣品，用含50 mmol·L-1Tris-HCl、150 mmol·L-1 NaCl、pH 7.0 的裂解緩沖液洗滌2次后于-80 ℃保存，以備蛋白表達(dá)檢測(cè)或前體蛋白純化。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）檢測(cè)蛋白表達(dá)，具體操作參照李丹等[11]的方法。以上獲得的前體蛋白為包涵體（即未折疊狀態(tài)、非活性狀態(tài)），將用于體外折疊與成熟研究。

1.2.3 前體蛋白純化

取出-80 ℃保存的樣品冰浴融化，裂解緩沖液重懸，超聲波（功率35%、超聲3 s、間隔3 s、時(shí)間30 min，冰?。┝呀猓? ℃ 、16 000 r·min-1離心40 min；棄上清、留沉淀；低水平尿素緩沖液（含50 mmol·L-1 NaH2PO4·2H2O， 3～4 mol·L-1 尿素，pH 7.0）洗滌；4 ℃ 、16 000 r·min-1離心40 min，棄上清，留沉淀；反復(fù)洗滌至上清液中無(wú)雜蛋白；最后將沉淀溶解于高水平尿素緩沖液（8 mol·L-1 尿素）中，采用BCA 檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白含量，完成蛋白純化。

1.2.4 前體蛋白體外折疊

質(zhì)量濃度約為3.8 mg·mL-1的前體蛋白加入復(fù)性體系折疊（稀釋體積比為1∶30），采用磁力攪拌器在4 ℃條件下攪拌，在不同時(shí)間取樣，利用酶活性與SDS-PAGE檢測(cè)蛋白折疊與成熟情況，成熟時(shí)間為每樣品2次SDS-PAGE檢測(cè)到的時(shí)間區(qū)間值。

SDS-PAGE檢測(cè)用樣品處理：向500 μL樣品中加入55 μL 100%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）終止蛋白折疊，冰上放置30 min；4 ℃、12 000 r·min-1 離心15 min，留沉淀；加入500 μL丙酮洗滌；4 ℃下12 000 r·min-1離心15 min，留沉淀；反復(fù)洗滌2～3次，晾干，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.5 成熟酶催化性能測(cè)定

成熟酶催化性能參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行測(cè)定，以化學(xué)合成肽succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide （AAPF）為底物。釋放p-nitroaniline的量通過(guò)OD410 nm 值變化確定。酶活單位定義是單位時(shí)間（1 min） 內(nèi)釋放1 μmolp-nitroaniline所需要酶量。酶與底物（50 mmol·L-1Tris-HCl， 1 mmol·L-1 CaCl2， 50 μg AAPF， pH 8.0）反應(yīng)一定時(shí)間，檸檬酸溶液（2 mol·L-1，pH 5.0）終止反應(yīng)后，測(cè)定吸光值。在體系中添加不同含量的底物與酶反應(yīng)，連續(xù)監(jiān)測(cè)光吸收值，以計(jì)算酶活參數(shù)米氏常數(shù)（Km）和催化常數(shù)（kcat）。催化性能測(cè)定時(shí)每樣品3個(gè)重復(fù)，數(shù)值為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.6 前體蛋白抑制酶活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[14]，將成熟酶迅速加入含有前體蛋白與底物AAPF的復(fù)性體系中（摩爾比為1∶5），以秒為單位實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)410 nm光吸收情況，評(píng)估前體蛋白對(duì)酶的作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 前導(dǎo)肽序列比較分析

經(jīng)DNAMAN 軟件比較，發(fā)現(xiàn)SprD 前導(dǎo)肽與其他序列具有較高相似性（圖1），2段比較保守的序列N1和N2基序構(gòu)成了前導(dǎo)肽疏水核心序列，在前導(dǎo)肽成核反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[15]；N1～N2基序間非保守氨基酸殘基可能通過(guò)形成α螺旋和β折疊在蛋白成熟途徑中承擔(dān)功能[16]。將前導(dǎo)肽與成熟肽連接處氨基酸標(biāo)識(shí)為“-1”，“-1”位氨基酸在不同基因序列中具有較大變化。SprD蛋白中，-1位氨基酸為Y，其他序列為M或L，推測(cè)“-1”位氨基酸組成對(duì)蛋白成熟切割作用影響可能不大；-2位氨基酸為A，其他序列為E；-44位氨基酸G與-48位氨基酸I分別處于N2保守基序與N1～N2間非保守序列中。圖1中還標(biāo)識(shí)了氨基酸突變與缺失（▲）情況，-48 位氨基酸I突變?yōu)閂（I-48V）；-44位氨基酸G突變?yōu)镈（G-44D）；-1位氨基酸Y缺失（Y-1D’）。

2.2 野生型前體蛋白的加工與成熟

緩沖液組分通過(guò)表面電荷、水與離子作用等方式影響蛋白折疊[17‐18]。本研究分別探索了Na2HPO4-NaH2PO4、Tris-HCl、MES 為背景的體外復(fù)性體系，結(jié)果顯示，當(dāng)體系為YABUTA 等[19]報(bào)道的50 mmol·L-1 MES-NaOH、500 mmol·L-1（NH4）2SO4、2 mmol·L-1 β -mercaptoethanol、1 mmol·L-1 CaCl2、pH 6.5～6.6時(shí)，野生型前體蛋白較快折疊為成熟酶（圖2A）。此外，從圖2 還可知，前導(dǎo)肽與成熟肽折疊、自加工發(fā)生在短暫的起始階段；前導(dǎo)肽釋放與降解，即成熟酶SprD出現(xiàn)發(fā)生在230 min左右；前導(dǎo)肽釋放前與成熟肽通過(guò)非共價(jià)鍵連接。

成熟肽及其催化三聯(lián)體中氨基酸突變會(huì)進(jìn)一步延長(zhǎng)蛋白成熟時(shí)間（圖2B～D）。當(dāng)發(fā)生E112A突變時(shí)，蛋白在300 min時(shí)仍以前體形式存在，蛋白成熟及前導(dǎo)肽釋放發(fā)生在500 min后（圖中未顯示至此刻）；S221A突變直接導(dǎo)致前導(dǎo)肽與成熟肽切割失??；S221C突變則使前導(dǎo)肽水解與釋放失敗，一直未檢測(cè)到有催化活性的成熟酶出現(xiàn)。以上結(jié)果表明，成熟肽及其催化中心氨基酸不僅參與前導(dǎo)肽切割與釋放，還延長(zhǎng)蛋白成熟時(shí)間甚至造成蛋白成熟成敗?；谶@些數(shù)據(jù)與結(jié)果，推測(cè)蛋白成熟效率的提高應(yīng)該圍繞蛋白前導(dǎo)肽進(jìn)行設(shè)計(jì)與探索。

2.3 前導(dǎo)肽串聯(lián)表達(dá)對(duì)蛋白成熟的影響

為進(jìn)一步強(qiáng)化前導(dǎo)肽作用，本研究將前導(dǎo)肽串聯(lián)表達(dá)以提升蛋白成熟效率（圖3A），結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖3B），pro-pro-SprD蛋白折疊成熟所需時(shí)間僅為150～160 min，與野生型前體蛋白相比縮短了近1/3時(shí)間，說(shuō)明前導(dǎo)肽串聯(lián)表達(dá)可以大幅提高蛋白成熟效率。釋放的前導(dǎo)肽以單個(gè)與串聯(lián)2種形式出現(xiàn)，預(yù)示著成熟酶可以準(zhǔn)確識(shí)別切割位點(diǎn)A（-2）-X（-1）-A（+1） （+1為成熟肽首位氨基酸），與切割位點(diǎn)距離無(wú)直接關(guān)聯(lián)。串聯(lián)形式的前導(dǎo)肽在豐度上更具優(yōu)勢(shì)，推測(cè)前導(dǎo)肽分子間存在相互作用，通過(guò)促進(jìn)自身二級(jí)結(jié)構(gòu)形成提高蛋白成熟效率。這一結(jié)果再次肯定了前導(dǎo)肽在蛋白折疊成熟中的作用，同時(shí)也為加速蛋白成熟提供了一種全新的方法。但是較多中間體的出現(xiàn)降低了成熟酶的最終得率，前導(dǎo)肽表達(dá)方式的改變可能不是加速蛋白成熟的最優(yōu)措施。

2.4 前導(dǎo)肽氨基酸點(diǎn)突變對(duì)成熟酶活性的影響

為進(jìn)一步探索前導(dǎo)肽氨基酸位點(diǎn)對(duì)蛋白成熟的影響，將保守基序N2及其臨近非保守基序且同屬前導(dǎo)肽二級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸位點(diǎn)的-44位氨基酸G與-48位氨基酸I分別突變?yōu)镈與V，并重組表達(dá)了相應(yīng)前體蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處于保守與非保守基序的氨基酸殘基對(duì)蛋白成熟促進(jìn)效果不明顯，前導(dǎo)肽釋放與酶活性顯示時(shí)間基本維持在200～220 min（ 圖4，G-44D 前體未顯示，需210～220min）。雖然這些突變對(duì)蛋白成熟影響有限，但卻改變了成熟酶的催化能力（表2），I-48V突變提高了酶與底物AAPF的結(jié)合能力（Km），此時(shí)酶的催化效率（kcat/Km）是野生型的1.3倍，而G-44D突變卻大幅降低了酶的催化效率。以上結(jié)果不僅再次證實(shí)了前導(dǎo)肽信息可以印記至成熟肽的結(jié)論[10]，還預(yù)示著酶活性的發(fā)揮與酶折疊成熟不存在明顯的相關(guān)性。與I-48V相比，-44位處于保守基序，且G-44D 突變將原來(lái)疏水性甘氨酸變?yōu)榱怂嵝园被?，這或許是催化效率降低的主要原因。

2.5 Y（-1）缺失顯著促進(jìn)蛋白成熟

以上研究表明，前導(dǎo)肽保守與非保守基序中氨基酸殘基對(duì)蛋白成熟貢獻(xiàn)有限。研究發(fā)現(xiàn)，連接處氨基酸殘基折疊后處于成熟肽構(gòu)象結(jié)合口袋內(nèi)，其側(cè)鏈基團(tuán)從空間位阻上可能影響前導(dǎo)肽釋放[5，20]。分析SprD前導(dǎo)肽發(fā)現(xiàn)，臨近連接處氨基酸序列是Q （-3）-A （-2）-Y （-1），即前導(dǎo)肽與成熟肽連接氨基酸為Y，上游氨基酸是A。因此，推測(cè)較大的Y側(cè)鏈基團(tuán)或不利于蛋白成熟。觀察將Y缺失（用Y-1D’表示）的前體蛋白成熟過(guò)程發(fā)現(xiàn)，Y缺失使蛋白成熟時(shí)間縮短至80 min左右（圖5），比野生型前體蛋白縮短了近160 min，蛋白成熟效率提高了近2倍，表明前導(dǎo)肽與成熟肽連接處氨基酸對(duì)蛋白成熟效率的提升具有不可替代的作用。

雖然前導(dǎo)肽表達(dá)方式改變可以提高蛋白成熟效率，但是連接處氨基酸的轉(zhuǎn)變卻更能體現(xiàn)強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)。這對(duì)于SprD蛋白可能存在一定偶然性，Y缺失使上游具有較小側(cè)鏈基團(tuán)的A（-2） 成為連接氨基酸，恰為前導(dǎo)肽釋放提供了便利。此外，Y-1D’突變基本不影響成熟酶與底物的結(jié)合與催化效率（表2）。結(jié)合保守與非保守基序中氨基酸位點(diǎn)突變數(shù)據(jù)可知，酶成熟與酶活性發(fā)生是2個(gè)相對(duì)獨(dú)立的過(guò)程。

2.6 前體蛋白對(duì)成熟酶活性的影響

前導(dǎo)肽釋放是成熟肽激活的重要標(biāo)志[8‐9]。在前體蛋白折疊前期階段，前導(dǎo)肽以非共價(jià)鍵形式與成熟肽結(jié)合并抑制成熟肽酶活發(fā)生是對(duì)宿主的一種保護(hù)。激活后的成熟酶被釋放到胞外呈現(xiàn)功能，而在此之前，前導(dǎo)肽通過(guò)抑制酶活發(fā)生可以防止細(xì)胞膜或周質(zhì)空間蛋白降解[11，19]。因此，不同來(lái)源前導(dǎo)肽對(duì)成熟酶抑制作用有一定差異[21]。檢測(cè)前體蛋白對(duì)成熟酶的作用可以從側(cè)面說(shuō)明前導(dǎo)肽對(duì)成熟酶的作用。由加入前體蛋白的成熟酶反應(yīng)曲線，計(jì)算初始反應(yīng)速率，與加入野生型前體蛋白pro-sprD反應(yīng)速率比較，可以比較各前體蛋白對(duì)成熟酶的相對(duì)抑制能力。由圖6知，不同前體蛋白對(duì)成熟酶活性發(fā)揮均有不同程度抑制作用；G-44D抑制作用最強(qiáng)，約為pro-SprD、I-48V 等前體蛋白的12.5倍；pro-pro-SprD因前導(dǎo)肽串聯(lián)而比pro-SprD抑制作用更強(qiáng)；Y-1D’在前280 s呈現(xiàn)抑制，而后則顯著促進(jìn)酶活發(fā)生。這些數(shù)據(jù)支持了前導(dǎo)肽對(duì)成熟酶具有抑制作用的結(jié)果[8‐9]，更證明了-1位氨基酸Y缺失顯著促進(jìn)蛋白成熟的這一結(jié)論。

3 討論

以前體蛋白形式合成的蛋白質(zhì)在細(xì)菌中廣泛存在，尤其是枯草桿菌蛋白酶類，因其具有極高應(yīng)用與轉(zhuǎn)化價(jià)值而備受重視。但是，這類蛋白即使在前導(dǎo)肽介導(dǎo)下折疊為成熟酶仍需較長(zhǎng)時(shí)間。本研究中，SprD蛋白釋放前導(dǎo)肽、完全成熟需230～240 min，與已報(bào)道枯草桿菌蛋白酶[22-24]基本一致。提高蛋白成熟效率是酶產(chǎn)量提升的必要條件。本研究發(fā)現(xiàn)，成熟肽中氨基酸殘基改變導(dǎo)致蛋白成熟時(shí)間延長(zhǎng)或成熟失敗，前導(dǎo)肽中保守和非保守區(qū)域單個(gè)氨基酸殘基突變對(duì)蛋白成熟貢獻(xiàn)有限，僅有前導(dǎo)肽串聯(lián)表達(dá)、前導(dǎo)肽與成熟肽連接處氨基酸位點(diǎn)改變才能大幅提升蛋白成熟效率。本研究還發(fā)現(xiàn)，蛋白成熟效率提高與酶催化能力提升呈非正相關(guān)，是2個(gè)相對(duì)獨(dú)立的過(guò)程。因此，前導(dǎo)肽表達(dá)方式改變及氨基酸位點(diǎn)優(yōu)化是從不同機(jī)制對(duì)酶成熟與催化效率提升發(fā)揮作用。

研究顯示，優(yōu)化前導(dǎo)肽氨基酸位點(diǎn)是提高成熟酶在原宿主體內(nèi)活性的通用途徑[25‐26]。結(jié)合本研究結(jié)果可知，體內(nèi)研究只能通過(guò)評(píng)估酶活性表明研究效果，無(wú)法從蛋白折疊機(jī)制上解釋酶活性提升的主要原因。此外，體內(nèi)研究還存在成熟酶表達(dá)量低、純化難度大、宿主生長(zhǎng)受影響等問(wèn)題[27‐28]。本研究利用大腸桿菌系統(tǒng)使前體蛋白以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)量受限較少，結(jié)合體外復(fù)性可以為酶適時(shí)應(yīng)用提供一種方法，也為酶產(chǎn)量提升提供一些體外篩選方案。

參 考 文 獻(xiàn)

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基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFE0127400）；四川省教育廳科研項(xiàng)目（18ZB0366）。