摘要：目的：構(gòu)建搭載慶大霉素的45S5生物玻璃支架，對(duì)比其生物活性及抗菌能力。方法：采用聚氨酯泡沫模板法制備搭載慶大霉素的45S5生物玻璃支架，制備不同慶大霉素含量的分組；研究支架在生理環(huán)境下的生物活性、降解性能及其體外抗菌能力規(guī)律；并了解研究支架在生物體內(nèi)骨髓炎模型下的抗菌能力。結(jié)果：45S5+8%慶大霉素復(fù)合材料對(duì)BMSC的增殖沒有明顯的影響；體外細(xì)菌抵抗實(shí)驗(yàn)顯示接觸的細(xì)菌減少了50%；體內(nèi)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示僅有細(xì)菌少量聚集；通過吉姆薩染色顯示僅有輕微的炎癥反應(yīng)，并且有明顯的成骨反應(yīng)。結(jié)論：45S5搭載8%慶大霉素復(fù)合支架作為抗生素載體，具有較好的藥物緩釋性及生物相容性，其成骨作用較強(qiáng)；并能根據(jù)缺損形態(tài)進(jìn)行有效修復(fù)，有望成為一種理想的藥物載體和骨缺損修復(fù)材料治療骨髓炎。

關(guān)鍵詞：生物玻璃；慶大霉素；金黃色葡萄球菌；骨髓炎

臨床上治療骨關(guān)節(jié)和軟組織感染主要依賴抗生素，包括全身和局部給藥［1］。但由于受感染區(qū)域血供不足，全身靜脈給藥難以達(dá)到有效濃度，可能需增加劑量和給藥頻次，增加患者并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)［2］。局部直接給藥就成為更佳選擇［3］。研究者一直在探索理想的抗生素載體，通過材料降解在感染部位局部釋放抗生素［4］。本研究旨在構(gòu)建基于45S5生物玻璃的慶大霉素載藥支架，評(píng)估其在模擬生理?xiàng)l件下的活性、降解性和抗菌效果，以及在體內(nèi)骨髓炎模型中的治療潛力。

1材料和方法

1.1載藥復(fù)合支架材料的制備

采用熔融法制備硼酸鹽生物玻璃，主要原料包括分析純的硅酸鹽、碳酸鹽和磷酸鹽，均勻混合后在鉑金坩堝中1 100～1 300 ℃熔化120 min后快速冷卻并研磨成小于50 μm的粉末。接著以1∶10∶20質(zhì)量比混合殼聚糖、檸檬酸和葡萄糖制成溶液。硅酸鹽生物活性玻璃、硫酸慶大霉素和殼聚糖溶液以2∶1體積比混合成BG/CS/T復(fù)合材料，固化20 min后得圓柱形實(shí)心片劑（φ4.7 mm×3.5 mm，（98±6.4） mg）。制備兩種不同抗生素質(zhì)量分?jǐn)?shù)（4%及8%）的試樣，并以無抗生素樣品為對(duì)照。所有試樣在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)γ射線消毒。

1.2體外抗生素釋放實(shí)驗(yàn)

將兩種不同抗生素含量的BG/CS/T復(fù)合材料試樣各4片，分別浸泡在10 ml磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2～7.4）中，并在37 ℃恒溫條件下孵育。每48 h更新一次PBS，并在無菌條件下用高效液相色譜法測(cè)定洗脫液中的替考拉寧濃度。通過計(jì)算BG/CS/T復(fù)合物釋放的替考拉寧含量，并應(yīng)用Peppas方程擬合藥物釋放曲線，從而研究其釋放機(jī)制：Mt/M∞=k

瘙 簚 tn。方程中，Mt/M∞代表時(shí)間t的藥物累積釋放率，k是與藥物和載體物理性質(zhì)相關(guān)的釋放速率常數(shù)，n是表征藥物釋放機(jī)理和載體形狀的特征指數(shù)，詳細(xì)解釋見Peppas模型。

1.3生物相容性檢測(cè)

利用CCK8試劑盒評(píng)估BMSCs在慶大霉素復(fù)合材料上的增殖狀況。簡述實(shí)驗(yàn)步驟如下：BMSCs接種于3組硼酸鹽生物玻璃支架，培養(yǎng)周期分別為1天、3天和7天，接種密度為每樣品104細(xì)胞。各時(shí)間點(diǎn)，向每孔加入360 μL培養(yǎng)基和40 μL CCK8溶液，繼續(xù)在37 ℃孵育4 h。隨后，從24孔板每孔抽取100 μL反應(yīng)液至96孔板中，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測(cè)定吸光度。

1.4體外抗菌實(shí)驗(yàn)

在體外抗菌實(shí)驗(yàn)中，以骨科常見致病菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， ATCC25923）為對(duì)象，測(cè)試樣品45S5生物玻璃及其含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)慶大霉素的復(fù)合材料（45S5+4%慶大霉素和45S5+8%慶大霉素）的抗菌效果。通過比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組（原始45S5生物玻璃）的菌落數(shù)，計(jì)算抑菌率。

抑菌率=［（對(duì)照組菌落數(shù)）-實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)］/對(duì)照組菌落數(shù)×100%

實(shí)驗(yàn)步驟如下：紫外燈消毒無菌臺(tái)30～60 min。向含5 mLB肉湯的EP管中加入100 μL菌原液和樣品，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。取出EP管，搖勻，取100 μL稀釋105倍。取50 μL稀釋液滴入冷肉湯瓊脂培養(yǎng)皿，用涂棒涂抹。封口膜封培養(yǎng)皿，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。菌落計(jì)數(shù)，記錄數(shù)據(jù)和拍照。

1.5抵抗細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用金黃色葡萄球菌進(jìn)行表面黏附實(shí)驗(yàn)（抵抗細(xì)菌接觸實(shí)驗(yàn)）使用0.9% NaCl的生理鹽水調(diào)整細(xì)菌懸液至105 CFU/mL。將樣品（45S5及含4%和8%慶大霉素的45S5復(fù)合材料）放入12孔板底部。向每孔加入1.5 mL細(xì)菌溶液，37 ℃孵育3 h。用無菌PBS輕輕清洗樣品5次。將樣品在3 mL PBS中振蕩2次，每次3 min，以去除表面細(xì)菌。采用標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)脫落的細(xì)菌。

1.6體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)

在體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)中，使用金黃色葡萄球菌，與體外實(shí)驗(yàn)相對(duì)應(yīng)。動(dòng)物在適宜的環(huán)境下飼養(yǎng)，所有程序符合國家動(dòng)物福利法。樣品45S5及其含抗生素復(fù)合材料分別植入大鼠，手術(shù)在無菌環(huán)境下進(jìn)行。術(shù)前禁食24 h，麻醉后固定進(jìn)行手術(shù)，植入樣品并注射細(xì)菌懸液。術(shù)后給予生理鹽水補(bǔ)液，設(shè)立未注射細(xì)菌的空白對(duì)照組。30天后處死大鼠，取出植入體及周圍組織，進(jìn)行組織學(xué)檢查和菌落計(jì)數(shù)。

2結(jié)果與討論

2.1體外抗生素釋放結(jié)果

慶大霉素復(fù)合材料浸泡時(shí)間累積釋放曲線見圖1。

圖1慶大霉素復(fù)合材料浸泡時(shí)間累積釋放曲線

圖1展示了含4%和8%慶大霉素的復(fù)合材料在PBS中的慶大霉素累積釋放曲線。兩種材料顯示出類似釋放動(dòng)力學(xué)，即初始快速釋放后轉(zhuǎn)為緩慢穩(wěn)定。第1天時(shí)，4%和8%復(fù)合材料的累積釋放量分別達(dá)到總量的42.11%和48.65%，7天后分別為68.52%和70.74%，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期。兩組樣本的總釋放時(shí)間分別為23天和39天，累積釋放率為78.91%和85.76%。慶大霉素作為水溶性抗生素，PBS使其在載體內(nèi)溶解形成高濃度，而載體表面的殼聚糖絡(luò)合集團(tuán)及HA層限制藥物釋放，形成內(nèi)外濃度差推動(dòng)藥物擴(kuò)散。藥物釋放由溶解和擴(kuò)散兩階段組成，由于溶解快于擴(kuò)散，整個(gè)過程由后者控制。

2.2細(xì)胞相容性結(jié)果

圖2（A）顯示了BMSCs在不同材料上1天、3天和7天的增殖情況。通過CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，45S5生物玻璃及其含4%和8%慶大霉素的復(fù)合材料都能支持BMSCs增殖。各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖率在不同材料間沒有顯著差異，表明慶大霉素的加入并未影響B(tài)MSCs的增殖能力。

（A）

（B）

圖2（A）BMSCs在45S5、45S5+4%慶大霉素和45S5+8%

慶大霉素復(fù)合材料上的增殖情況；（B）45S5、45S5+4%

慶大霉素和45S5+8%慶大霉素復(fù)合材料對(duì)金黃色葡萄球

菌在24 h以及48 h的抑菌效果（LB肉湯中）2.3體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2（B）展示了含慶大霉素的復(fù)合材料對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌效果。經(jīng)24 h和48 h共培養(yǎng)，平板計(jì)數(shù)結(jié)果指出，添加慶大霉素的復(fù)合材料對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出顯著殺菌作用。含4%慶大霉素的45S5復(fù)合材料在24 h抗菌效率為35.2±6.7%，48 h為42.1±6.4%。含8%慶大霉素的復(fù)合材料抗菌活性更強(qiáng)，顯示出更優(yōu)的抗菌效果，特別是對(duì)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌。

2.4體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3（A）45S5、45S5+4%慶大霉素和45S5+8%慶大

霉素復(fù)合材料植入股骨髁后表面及周圍收集液細(xì)菌

培養(yǎng)結(jié)果；（B）45S5、45S5+4%慶大霉素和45S5+8%

慶大霉素復(fù)合材料植入股骨髁吉姆薩染色結(jié)果

圖3（A）顯示了45S5+8%慶大霉素復(fù)合材料體外表現(xiàn)出良好的抗菌活性，但關(guān)鍵的體內(nèi)抗菌效果也通過實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證。研究針對(duì)醫(yī)院常見病原菌金黃色葡萄球菌，30天體內(nèi)培養(yǎng)后，取樣分析顯示45S5對(duì)照組細(xì)菌密集，而含慶大霉素的組織表面細(xì)菌少。平板計(jì)數(shù)結(jié)果支持慶大霉素復(fù)合材料的抗菌效果。圖3（B）顯示進(jìn)一步的吉姆薩染色揭示，與45S5相比，含藥復(fù)合材料引起輕微炎癥但促進(jìn)骨形成。

3結(jié)語

制備的生物玻璃殼聚糖復(fù)合材料具備類似人骨的強(qiáng)度，適用于承重骨缺損修復(fù)。材料能長期緩釋抗生素，滿足骨髓炎治療需求，釋放期可達(dá)3～4周。復(fù)合材料還具有良好的藥物緩釋性、生物相容性及促進(jìn)骨再生能力，可根據(jù)缺損定制修復(fù)，是治療骨髓炎的理想選擇。

參考文獻(xiàn)：

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作者簡介：胡浙安，男，安徽廬江人，高級(jí)工程師，本科，研究方向：無機(jī)非金屬材料。