摘要：表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是茶葉中重要的滋味和保健功能成分。前人已發(fā)現鉀營養(yǎng)影響茶樹EGCG的生物合成，而其生物合成的調控作用機制目前尚不明確。以黃棪一年生茶苗為試驗對象，設置5個處理組（K1～K5），即澆用K2SO4的濃度依次為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol?L-1。轉錄組學和代謝組學聯合分析結果表明，低鉀處理（K1）的茶樹新梢中黃酮含量顯著積累，EGCG含量達到最高水平，與高鉀處理（K5）相比差異達顯著水平；EGCG合成路徑上的相關代謝物苯丙氨酸、肉桂酸與對香豆酸在K5處理中上調，而類黃酮途徑的下游代謝產物（二氫槲皮素、二氫楊梅素、無色飛燕草色素、表沒食子兒茶素）則在K1、K2處理中上調。在鉀營養(yǎng)的影響下，EGCG的生物合成受到一系列結構基因CsCHI、F3′5′H、CsF3H（CSS0019002）、CsANS、CsANR、Csaro DE、CsSCPL和轉錄因子（MYB306）的正向調控以及CsPAL、CsC4H、Cs4CL、CsCHS、CsF3H（CSS0016177）、CsDFR（CSS0011557）和轉錄因子（NAC83）的負向調控。鉀營養(yǎng)會通過影響茶樹中關鍵基因的表達對EGCG的合成進行調控，從而影響EGCG的含量。研究結果為鉀營養(yǎng)調控茶樹的EGCG生物合成提供了科學依據。

關鍵詞：鉀；表沒食子兒茶素沒食子酸酯；生物合成；茶樹

中圖分類號：S571.1；Q946 " " " " " "文獻標識碼：A " " " " " " " 文章編號：1000-369X（2024）06-887-14

Studies on the Regulation of EGCG Biosynthesis in Tea Plants by Potassium Nutrition

YANG Nan1，3， LI Zhuan1，3， LIU Meichen1，3， MA Junjie1，3， SHI Yuntao1，3， WEI Xiangning1，3，

LIN Yangshun2， MAO Yuyuan1，3*， GAO Shuilian1，2，3*

1. College of Horticulture amp; Anxi College of Tea Science， Fujian Agriculture Forestry University， Fuzhou 350002， China; 2. Quanzhou Special Talent Innovation Laboratory of Fujian Richun Industry Co.， Ltd.， Quanzhou 362000， China; 3. Fujian Collaborative Innovation Center for Green Cultivation and Processing of Tea Tree in Colleges and Universities， Quanzhou 362406， China

Abstract： Epigallocatechin gallate （EGCG） is an important flavor and health functional component in tea. Previous studies have found that EGCG biosynthesis in tea plants is affected by potassium nutrition， but the regulatory mechanism of its biosynthesis is currently unclear. This study used one year old tea seedlings of Huangdan as the experimental object， and set up 5 treatment groups （K1-K5）， with K2SO4 concentrations of 0.4， 0.6， 0.8， 1.0 mmol?L-1 and 1.2 mmol?L-1 for irrigation， respectively. The joint analysis of transcriptomics and metabolomics shows that， under low-potassium treatment （K1）， the flavonoid contents in the new shoots of tea plants accumulated significantly and the EGCG content reached the highest level， and the difference reached a significant level compared with that of the high potassium treatment （K5）. The related metabolites of phenylalanine， cinnamic acid and p-coumaric acid on the EGCG synthesis pathway were up-regulated in the K4 or K5 treatments， whereas the downstream metabolites of the flavonoid pathway （dihydroquercetin， dihydromyricetin， colorless delphinidin pigment and epigallocatechin） were up-regulated in the K1 and K2 treatments. Under the influence of potassium nutrition， EGCG biosynthesis was positively regulated by a series of structural genes CsCHI， F3′5′H， CsF3H （CSS0019002）， CsANS， CsANR， Csaro DE， CsSCPL， and transcription factor （MYB306）， as well as negatively regulated by CsPAL， CsC4H， Cs4CL， CsCHS， CsF3H （CSS0016177）， CsDFR （CSS0011557） and transcription factor （NAC83）. It is thus clear that potassium nutrition regulates EGCG synthesis by affecting the expressions of key genes in tea plants， thereby affecting EGCG content. This study provided a scientific basis for the regulation of EGCG biosynthesis in tea plants by potassium nutrition.

Keywords： potassium， EGCG， biosynthesis， tea plant

茶葉中含有豐富的多酚類化合物，其中兒茶素類為主體成分，對茶葉品質的形成起重要作用[1]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）作為兒茶素中含量最高的單體[2]，賦予茶葉滋味醇厚、湯色鮮艷的品質特征[3]。另外，EGCG具有保健功能，其化學結構上的8個游離羥基提供抗氧化能力，是重要的抗氧化劑[4-5]。

EGCG生物合成過程包括3條主要途徑：苯丙氨酸途徑、類黃酮途徑和莽草酸途徑[6-7]。在苯丙氨酸途徑中，在苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羥化酶（C4H）和4-香豆酰輔酶（4CL）的催化作用下苯丙氨酸轉化為香豆酰輔酶A[8-9]。在類黃酮途徑中，查爾酮經過查爾酮異構酶（CHI）、黃烷酮3-羥化酶（F3H）、類黃酮3′-羥化酶（F3′H）、類黃酮3′5′-羥化酶（F3′5′H）、二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）、花青素合酶（ANS）和花青素還原酶（ANR）的作用下生成表沒食子兒茶素[10-11]。在莽草酸途徑中3-脫氧莽草酸生成沒食子酸（GA），最終在絲氨酸羧肽酶樣（SCPL）催化下，EGC和GA轉化為EGCG[12]。

鉀營養(yǎng)能夠影響茶葉中EGCG的含量。研究發(fā)現，在茶園中施用鉀會提高類黃酮代謝物的含量[13]。在成齡茶樹中，缺鉀會降低茶葉中EGCG的含量[14]，而在幼齡茶樹中，施鉀有助于提高兒茶素的含量[15]。然而，過量施鉀會加快兒茶素單體（C）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、EGCG等的代謝，不利于兒茶素積累[16]。目前，鉀營養(yǎng)對EGCG生物合成的調控機制尚不明確。

本研究以茶樹品種黃棪為材料，通過施用不同濃度的鉀肥進行鉀營養(yǎng)盆栽試驗?；谵D錄組與代謝組技術，探究鉀營養(yǎng)對新梢EGCG生物合成的調控機制，旨在為通過鉀營養(yǎng)調控茶樹EGCG生物合成提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗地位于福建省泉州市安溪縣安溪茶學院實驗室1號樓，采用室外盆栽培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為2023年5—7月，培育期間，晝溫平均27.5 ℃，降雨量共659.7 mm，并設置50%遮陽率的遮陽網。試驗材料選擇生長勢相對一致的茶樹品種黃棪一年生茶苗，每個處理設置12盆，每盆10株茶苗。供試盆為塑料盆（長×寬×高=48 cm×27 cm×15 cm），底盆有出水孔30 mm。采用沙培方式，基質為20 kg干凈河沙。參考小西茂毅營養(yǎng)液[17]配方，營養(yǎng)液成分及濃度如下：（NH4）2SO4、Ca（NO3）2、K2SO4、MgSO4、NH4H2PO4、Al2（SO4）3分別為1、0.5、1.0、0.6、1.0、0.4 mmol?L-1，H3BO3、MnSO4、CuSO4、ZnSO4、Na2MoO4、Fe-EDTA（C10H12FeN2NaO8）分別為46、9、2、9、2.6、30 μmol?L-1。分別用0.4、0.6、0.8、1.0 mmol?L-1和1.2 mmol?L-1濃度的K2SO4營養(yǎng)液處理盆栽茶苗，各處理分別用K1、K2、K3、K4、K5表示。其中以K4處理組為對照。用0.01 mol?L-1 HCl溶液和0.1 mol?L-1 NaOH溶液調節(jié)營養(yǎng)液pH值，試驗周期為3個月，3 d澆1次營養(yǎng)液，將營養(yǎng)液與水按比例配制，每盆每次澆灌500 mL，營養(yǎng)液澆灌時河沙濕潤且不滲漏營養(yǎng)液。

1.2 生理生化成分測定

利用高效液相色譜儀對兒茶素標準品進行定量[18]，并通過外標法計算EGCG濃度。

1.3 代謝物的UPLC-MS/MS測定

本研究采用超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）技術，在武漢邁特維爾生物科技有限公司平臺進行廣泛靶向代謝組學檢測。使用Agilent SB-C18色譜柱，流動相A為含0.1%甲酸的超純水，流動相B為含0.1%甲酸的乙腈。洗脫梯度設置如下：起初B相比例設置5%，然后在9 min內線性上升到95%，并在95%的情況下保持1 min，隨后在10～14 min內B相降到5%并保持平衡。流速0.35 mL·min-1，柱溫40 ℃，進樣體積2 μL。質譜分析采用ESI電噴霧源，離子源氣體Ⅰ（GSⅠ）、離子源氣體Ⅱ（GSⅡ）分別設置為50、60 psi，與MRM模式掃描，通過優(yōu)化去簇電壓（DP）和碰撞能（CE），確定每個MRM離子對的最佳DP和CE值。

1.4 轉錄組測序與分析

使用RNA純化試劑從組織中提取總RNA，每組3個生物學重復，利用Nanodrop 2000、瓊脂糖凝膠電泳分別檢測RNA的濃度、純度和完整性，隨后測定RQN值。將總RNA中的mRNA純化后片段化，構建cDNA文庫并進行質量檢測。RNA純化、逆轉錄和測序在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司平臺進行。參考基因組為Camellia sinensis var. sinensis cv. Shuchazao。差異基因的篩選條件為P-adjustlt;0.05 amp; |log2FC|≥1，對篩選出的差異基因進行GO與KEGG富集分析。

1.5 實時熒光定量qRT-PCR驗證

qRT-PCR檢測在DLAB Accurate 96平臺上進行。PCR反應體系：2×PerfectStar Green qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應程序如下：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)，每個反應重復3次。使用Primer Primer 5軟件在目標基因序列的特異性區(qū)域設計qRT-PCR引物對（表1），CsGAPDH作為內參基因。基因表達水平采用 法計算。

1.6 數據處理與分析

采用SPSS 21.0進行相關性分析，使用Visio、TBtools、Cytoscape繪制路徑圖、熱圖和網絡圖。

2 結果與分析

2.1 鉀肥濃度對茶樹新梢中EGCG含量的影響

對不同鉀肥濃度下茶樹新梢中EGCG含量分析結果表明，新梢EGCG含量隨著鉀濃度的增加而降低，且除了K4和K5之間無顯著性差異外，其他處理之間均存在顯著性差異（圖1）。

2.2 茶樹新梢EGCG生物合成代謝對鉀肥濃度的響應

2.2.1 鉀肥濃度的變化顯著調節(jié)類黃酮的代謝

UPLC-MS/MS的靶向代謝組學分析發(fā)現，

在5個不同鉀肥濃度處理組中共檢測到2 453種非揮發(fā)性代謝物（表2），分為12類，包括618種黃酮、414種酚酸、217種氨基酸及其衍生物、83種核苷酸及其衍生物、117種有機酸、205種脂類、105種萜類、193種生物堿、121種木脂素和香豆素、31種醌類、61種鞣質、288種其他類。在檢測到的茶樹代謝物中以黃酮類與酚酸類代謝物數量最多，分別占全部物質的25.19%和16.88%。主成分（PCA）分析結果顯示，5個處理組之間的代謝物有明顯的分離趨勢，反映出隨著鉀肥濃度的變化，各組樣品之間存在代謝差異（圖2A），其中，K1處理組與其余4個處理組的分布較遠，而K4和K5處理組分布距離接近。由此可見，不同鉀肥濃度顯著影響茶樹的代謝水平。為進一步探討各組之間非揮發(fā)性代謝物的變化規(guī)律，對5個處理組代謝物平均相對含量進行聚類分析，生成了12個類別的熱圖（圖2B）。結果顯示，在K1處理組中黃酮類、生物堿、醌類和鞣質類成分顯著積累，而核苷酸及其衍生物以及脂質類代謝物含量相對較低。相反，在其他處理組中，核苷酸及其衍生物與脂質類成分的含量較高，而黃酮類、生物堿和鞣質類物質含量相對較低。尤其是K5處理組與K1處理組對比，代謝物變化最為顯著。這一結果表明，鉀肥濃度的變化對茶樹代謝物水平具有顯著影響，特別是在低鉀狀態(tài)下，黃酮類物質的含量顯著積累。

基于KEGG通路富集分析結果顯示，K5與K1處理組的差異代謝物主要富集在色氨酸代謝、各種植物次級代謝物的生物合成、苯丙氨酸代謝、苯丙烷的生物合成以及黃酮類化合物的生物合成等通路上（圖2C）。其中，與EGCG合成密切相關的主要通路包括苯丙烷類化合物的生物合成、黃酮類化合物的生物合成和植物次生代謝產物的合成。這表明K1與K5處理組的差異代謝物會在與EGCG合成相關的代謝通路中顯著富集，進一步驗證K1與K5之間的EGCG含量水平的差異。

2.2.2 EGCG生物合成中的相關代謝物對鉀肥濃度的響應

EGCG的合成路徑主要涉及黃酮類與酚酸類物質，這些物質通過苯丙氨酸途徑、類黃酮途徑與莽草酸途徑合成。為探究鉀營養(yǎng)對EGCG合成的調控機制，本研究篩選出參與EGCG合成的相關代謝物，并通過熱圖進行可視化分析（圖3）。結果顯示，在苯丙氨酸途徑中，苯丙氨酸、肉桂酸和對香豆酸的含量在K5處理組中增加，而類黃酮途徑的下游代謝產物（二氫槲皮素、二氫楊梅素、無色飛燕草色素、表沒食子兒茶素）則在K1、K2處理組中增加較多。這些結果表明，高鉀條件（K5）下促進苯丙氨酸途徑形成，而低鉀條件（K1）則會相對增加黃酮類化合物的含量，顯著促進EGCG的生物合成。

2.3 鉀營養(yǎng)對茶樹新梢EGCG生物合成的轉錄調控機制

2.3.1 鉀肥濃度變化顯著調節(jié)基因的表達

在轉錄組分析中，Q30堿基比例超過94.43%，測序堿基平均錯誤率小于0.1%，表明測序質量已達到后續(xù)分析的要求。各樣品序列與茶樹基因組的比對率為83.57%～85.20%，其中70%以上的讀數能夠比對到參考基因組唯一位置上，表明所選參考基因組合適，且測序誤差較小。對5個鉀肥濃度處理組的基因集進行聚類分析（圖4），結果顯示，茶樹的轉錄水平受鉀肥濃度的響應模式與代謝物一致。差異基因分析結果表明，隨著鉀肥濃度的增加，差異基因（Differentially expressed genes，DEGs）數量逐漸增多。與低鉀處理組K1相比，K2處理組有659個DEGs上調，943個DEGs下調；K3處理組有1 409個DEGs上調，2 242個DEGs下調；K4處理組有729個DEGs上調，2 318個DEGs下調，K5處理組有1 739個DEGs上調，2 345個DEGs下調（圖5）。

KEGG通路富集分析結果表明，DEGs在激素信號轉導和植物-病原體互作通路中顯著富集。這說明了EGCG的生物合成對鉀肥濃度的響應可能受到激素信號和病原體互作的調控。在與EGCG合成相關的富集通路中，包括苯丙烷類生物合成、類黃酮生物合成以及植物次生代謝產物的合成。與K1處理組相比，K3、K4和K5處理組均有DEGs富集在這些通路中，具體而言，K3、K4、K5處理組分別有45、28與44個DEGs富集到苯丙烷類生物合成通路中，有23、27、18個DEGs富集到類黃酮生物合成通路中，K3與K5處理組分別還有18與22個DEGs富集到植物次生代謝產物的合成中（圖6）。這些結果表明，鉀肥濃度顯著影響EGCG的生物合成及其相關基因的表達。

2.3.2 EGCG生物合成中的相關基因對鉀肥濃度的響應

在與EGCG合成相關的富集通路中，進一步研究了苯丙氨酸、類黃酮和莽草酸途徑相關基因的表達情況。為驗證轉錄組數據的可靠性，對表現顯著性變化的基因進行qPCR測定，結果表明這些基因的qPCR表達趨勢與轉錄組數據一致，可進行下一步分析（圖7）。

2.4 EGCG生物合成在鉀營養(yǎng)作用下的代謝與轉錄組聯合分析

代謝組數據表明，K1與K5處理組的EGCG含量存在顯著差異，且上述基因的表達趨勢與代謝組數據一致。進一步從K1與K5的差異基因中篩選出65個差異表達的轉錄因子（TFs），它們屬于10個不同的轉錄家族。轉錄因子對于鉀肥濃度的響應模式如下：相比K5處理，K1處理中WRKY成員（WRKY53）、HB-other成員（HAT4）、bHLH成員（bHLH89、bHLH94）、MYB成員（MYB306）、bZIP成員（bZIP29）和NAC成員（NAC031）顯著上調；而NAC成員（NAC83）、ERF成員（APRR5）、MYB成員（DIVARICATA）和bHLH成員（bHLH126）則顯著下調（圖8）。表明鉀對EGCG的生物合成受轉錄因子轉導的調控。

通過分析轉錄因子、基因與代謝物之間的相關性，并利用Cytoscape構建了網絡圖譜（圖9）。結果顯示，在K1處理組中，Csaro DE

（CSS0042855）、MYB306（CSS0049966）表達上調，促進了EGCG的含量增加。然而關鍵基因CsDFR（CSS0011557）、CsPAL（CSS0034802）、NAC83（CSS0026326）的表達則對EGCG的含量產生負向調控。Csaro DE（CSS0042855）與MYB306（CSS0049966）顯示出顯著正相關，而與NAC83（CSS0026326）呈顯著負相關；CsDFR（CSS0011557）和CsPAL（CSS0034802）分別與BHLH126（CSS0040348）呈顯著正相關，而與bZIP29（CSS0001216）和HAT4（CSS0015320）呈顯著負相關。

3 討論

3.1 鉀營養(yǎng)調控EGCG生物合成中的代謝物

鉀肥濃度的變化會影響黃酮類物質、酚酸類物質的含量，并在EGCG的生物合成中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現，在低鉀處理條件下（K1），黃酮類物質含量相對較高，EGCG的含量也達到最高水平；而在高鉀處理條件下（K5），苯丙氨酸途徑中的酚酸類物質含量較高。這與前人研究結果一致，表明鉀能夠參與茶樹生長發(fā)育中多種生化反應過程[19-20]，且適量的施用鉀肥會增加類黃酮物質的含量[21]。低鉀條件下，類黃酮物質合成途徑的活性增強，可能是低鉀環(huán)境減少了與苯丙氨酸途徑與類黃酮途徑的底物競爭，進而促使類黃酮的積累[22-23]。相反，在高鉀條件下，過量的鉀肥可能通過促進酚酸類物質的合成和積累，間接抑制類黃酮類物質的合成[24-25]。因此推測，在低鉀條件下，類黃酮途徑的代謝流得到了優(yōu)先分配，促進了EGCG的積累。

3.2 鉀營養(yǎng)調控EGCG生物合成中的關鍵基因表達

鉀營養(yǎng)不僅影響代謝物的含量，還通過調控關鍵基因的表達對EGCG的合成產生影響。在高鉀處理條件下（K5），苯丙氨酸途徑中的關鍵基因如CsPAL、CsC4H和CsCHS表現出較高的表達水平，符合以往研究結果[26-27]。然而此時EGCG的含量卻相對較低，表明這些基因的高表達可能并未直接促進EGCG的合成，這可能與其他次生代謝分支的增強有關。特別是CsPAL，作為苯丙氨酸途徑的起始酶，其高表達可能導致酚酸類物質的積累，從而通過底物競爭限制類黃酮途徑下游基因的活性，導致EGCG含量的下降[28-29]。相較之下，低鉀處理（K1）下類黃酮途徑中的CsCHI、CsF3'5'H、CsANS和CsANR基因的高表達則促進了EGCG的合成。作為類黃酮合成途徑中的關鍵酶，這些基因的高表達與EGCG含量的增加一致[30-32]，表明低鉀環(huán)境更有利于EGCG的合成。此外，CsF3H的兩個同工酶（CSS0016177和CSS0019002）在不同鉀處理下的差異性表達，反映了同工酶的功能分化。CSS0016177在高鉀處理中上調，而CSS0019002在低鉀處理中上調。這表明，低鉀環(huán)境不僅促進了類黃酮途徑的整體活性，還可能通過特定同工酶的作用進一步推動EGCG的積累。值得注意的是，這些基因的表達差異可能不僅受底物競爭影響，還可能與植物激素信號的調控密切相關。本研究中，差異基因顯著富集在激素信號轉導通路中，且有研究表明鉀通過調節(jié)植物激素的信號傳遞，間接影響次生代謝的平衡[33-34]。因此，結合本研究結果推測，鉀可能通過調控植物激素信號通路與代謝流之間的關系，在低鉀環(huán)境下促進了類黃酮途徑的活性，從而增強了EGCG的合成。

4 結論

本研究發(fā)現，鉀營養(yǎng)濃度（0.4 mmol?L-1）適當能夠促進茶樹EGCG生物合成，進一步增加鉀營養(yǎng)濃度反而抑制了茶樹EGCG的生物合成。其中，結構基因CsCHI、CsF3′5′H、CsF3H（CSS0019002）、CsANS、CsANR、Csaro DE、CsSCPL和轉錄因子MYB306對茶樹EGCG生物合成具有正向調控作用，而CsPAL、CsC4H、Cs4CL、CsCHS、CsF3H（CSS0016177）、CsDFR（CSS0011557）和轉錄因子NAC83具有負向調控作用。本研究揭示了鉀營養(yǎng)對茶樹EGCG生物合成的轉錄調控作用機制，為深入理解鉀營養(yǎng)對茶葉品質的影響提供了新的理論依據。但研究也顯示出鉀營養(yǎng)對茶葉生化成分合成影響的復雜性和多面性，需要進一步深入研究以全面揭示鉀營養(yǎng)對茶樹次生代謝和茶葉品質的影響機制。

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