近年來，隨著測序技術(shù)和群體研究的進(jìn)展，加上大型生物樣本庫的建立，疾病相關(guān)變異的檢測與解釋得到了完善。

然而，許多遺傳病患者仍難以確定其致病變異，影響了治療選擇、臨床試驗(yàn)參與和家庭規(guī)劃。

基因治療的興起使得尋找準(zhǔn)確診斷更加關(guān)鍵，但由于生物數(shù)據(jù)庫中非歐洲裔個(gè)體數(shù)據(jù)的不足，疑義變異的鑒定仍然存在困難。

深度突變篩選，能夠通過高通量功能測定生成對突變的功能評分。然而，深度突變篩選的高成本和復(fù)雜性限制了其廣泛應(yīng)用。

已建立的飽和誘變方法如程序性等位基因系列（PALS）雖成本低，但是操作煩瑣。

此外，功能測定方法如生長富集方法和流式細(xì)胞方法也面臨成本和準(zhǔn)確性挑戰(zhàn)。因此，優(yōu)化深度突變篩選技術(shù)對于更好地理解與疾病相關(guān)的基因變異至關(guān)重要。

為了實(shí)現(xiàn)了無需專用試劑、設(shè)備或煩瑣步驟的飽和誘變，來自美國耶魯醫(yī)學(xué)院的團(tuán)隊(duì)基于程序性等位基因系列的核心概念進(jìn)行了改進(jìn)，開發(fā)出一種名為程序性等位基因系列一通用流程的方法。

實(shí)現(xiàn)深度突變篩選在罕見遺傳病中的新突破

耶魯醫(yī)學(xué)院的馬凱玥博士是本次成果的主要研究人員。2019年初，他剛結(jié)束博士一年級的三輪輪轉(zhuǎn)，面臨選擇實(shí)驗(yàn)室的抉擇。

其中，一個(gè)是他熟悉的基因組學(xué)方向，課題也與他的興趣契合；另一個(gè)是本次論文共同通訊作者耶魯醫(yī)學(xué)院蒙科爾·萊克教授的實(shí)驗(yàn)室，研究方向是他不太熟悉的罕見遺傳疾病的診斷與治療。

在做出決定前，后者對他說：“我家有3只令人喜受的寵物狗，而吉姆（另一個(gè)課題組的負(fù)責(zé)教授）家只有一只。”正是這句輕松的話語讓他做出了最終的選擇。

盡管當(dāng)時(shí)他對罕見病研究的挑戰(zhàn)和機(jī)遇還不夠了解，但綜合多方因素后，最終正式加入了該團(tuán)隊(duì)。

事實(shí)上，蒙科爾本人是一名肢帶型肌營養(yǎng)不良癥患者（由肌聯(lián)蛋白帽基因TCAP變異引起）。正因?yàn)樽陨淼慕?jīng)歷，蒙科爾非常關(guān)注診斷的速度和準(zhǔn)確性，同時(shí)致力于開發(fā)新的治療方法。

確定致病基因和致病突變是患者接受基因特異性療法或參與臨床試驗(yàn)的前提條件。然而，對于罕見病患者，獲得準(zhǔn)確診斷通常需要漫長的時(shí)間。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，罕見病患者在發(fā)達(dá)國家平均需三到四年才能確診?？梢韵胂笤诎l(fā)展中國家，這一過程更為艱難。

臨床上常見的一類致病突變是單基因的單核苷酸變異。

盡管當(dāng)前測序技術(shù)的進(jìn)步使檢測這些突變變得更加容易，但其中超過一半的變異仍被分類為“致病性不確定的基因突變”

這是因?yàn)槊總€(gè)人無論健康與否，都存在大量基因突變。這使得突變的臨床后果難以得到簡單直接的解析。因此，關(guān)鍵在于理解這些突變與疾病的相關(guān)性。

就a-抗肌萎縮相關(guān)糖蛋白病而言，它是一類由多種基因突變引起的罕見疾病，包括FKRP和LARGE1基因的突變。

目前，針對這些基因變異導(dǎo)致的疾病，已有多種療法正在開發(fā)中，包括小分子藥物和基因治療。

因此，幫助更多患者獲得確診，從而使其有機(jī)會接受新療法或參與臨床試驗(yàn)，成了課題組的主要工作方向之一。

當(dāng)前在研究突變致病性的領(lǐng)域中，深度突變篩選是一種廣泛使用的方法。

它通過在細(xì)胞模型中飽和式地創(chuàng)造出目標(biāo)基因的所有可能突變，并通過功能篩選對這些突變進(jìn)行定性分析，以高通量獲取突變的功能性信息。

該課題組研發(fā)的飽和誘變強(qiáng)化功能分析（SMuRF）就是一種適用于深度突變篩選的工作框架。

在開發(fā)過程中，該團(tuán)隊(duì)采用了多種新方法來降低成本和操作復(fù)雜性。

由于罕見病研究的實(shí)驗(yàn)室通常資金有限，但也往往擁有基因特異性的功能檢測手段，因此研究人員希望通過簡化工作流程，鼓勵更多實(shí)驗(yàn)室參與深度突變篩選研究。

而通過應(yīng)用SMuRF，研究團(tuán)隊(duì)對FKRP和LARGE1基因的單核苷酸突變進(jìn)行了飽和式的功能評分，為這些基因的臨床診斷提供了額外的參考依據(jù)。

SMuRF工作框架的開發(fā)與精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的未來探索

深度突變篩選，包含飽和誘變和功能測定兩部分。該團(tuán)隊(duì)在開發(fā)SMuRF時(shí)，目標(biāo)是創(chuàng)建一套通用工作流程，適用于多種飽和誘變和功能測定方法。

如前所述，在本次研究中他們開發(fā)了程序性等位基因系列一通用流程飽和誘變方法，并將其與流式細(xì)胞儀的高通量功能測定方法相結(jié)合。

另外，他們還探索了一種基于生長富集的功能測定方法。

SMuRF的開發(fā)經(jīng)歷了以下歷程，首先，2015年發(fā)表在雜志上的程序性等位基因系列方法的相關(guān)論文引起了課題組的興趣。

但該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)盡管其潛力巨大，實(shí)際應(yīng)用卻很少。

他們認(rèn)為原因在于技術(shù)難度較高，因此他們基于程序性等位基因系列開發(fā)了更簡便的程序性等位基因系列一通用流程，保留了其優(yōu)勢但只需使用更常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室試劑。

繼而，對于功能測定，a-抗肌萎縮相關(guān)糖蛋白病的分子表型是糖基化不足。

盡管已有流式細(xì)胞儀方法可檢測患者成纖維細(xì)胞的糖基化，但課題組發(fā)現(xiàn)其靈敏度達(dá)不到深度突變篩選的要求，于是對染色條件和載體進(jìn)行了優(yōu)化。

此外，他們還發(fā)現(xiàn)，酶突變研究中基因表達(dá)量的控制至關(guān)重要，過高的表達(dá)可能掩蓋突變影響，因此使用了較弱的泛素C啟動子（UbC）。

此外，該團(tuán)隊(duì)結(jié)合深度突變篩選方法，開發(fā)了一整套從測序數(shù)據(jù)到功能打分的分析管線，并將其公開于GitHub，簡化了數(shù)據(jù)處理流程。

團(tuán)隊(duì)協(xié)作是本研究獲得成功的關(guān)鍵。研究中，一款關(guān)鍵的商用抗體停產(chǎn)，其他品牌的替代商用抗體無法實(shí)現(xiàn)預(yù)期效果。

此時(shí)，美國霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所研究員凱文·坎貝爾教授提供了大量實(shí)驗(yàn)室制備的抗體，使項(xiàng)目得以繼續(xù)推進(jìn)。

坎貝爾實(shí)驗(yàn)室的抗體借助愛美國荷華大學(xué)的平臺向各處研究者廉價(jià)分享，保證了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。

而為了開發(fā)基于假型水皰性口炎病毒（ppVSV）的生長富集功能方法，美國喬治亞大學(xué)的梅琳達(dá)·布林達(dá)利教授為課題組提供了必要的實(shí)驗(yàn)材料及技術(shù)指導(dǎo)。

對于該成果的應(yīng)用前景，該團(tuán)隊(duì)稱提供的功能打分為臨床診斷提供了額外的證據(jù)，已成功幫助來自德國和英國的醫(yī)生與患者提升診斷準(zhǔn)確性。

同時(shí)，課題組正在積極開發(fā)FKRP相關(guān)的基因治療方法，功能打分也將作為額外的支持證據(jù)，助力患者參與臨床治療。

此外，研究人員正在與生物醫(yī)藥公司合作，計(jì)劃采用SMuRF工作流程及改進(jìn)后的功能方法，以檢測小分子藥物對不同突變的治療效果，旨在推動精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，確?；颊攉@得更有效的治療選擇。

日前，相關(guān)論文以《疾病相關(guān)基因的飽和誘變強(qiáng)化功能進(jìn)行分析》為題發(fā)表在期刊上。

馬凱玥是第一作者，馬凱玥和蒙科爾·萊克擔(dān)任共同通訊作者。

總的來說，SMuRF提供了一個(gè)靈活的工作框架。

未來，課題組將通過多種方式增強(qiáng)其功能和易用性，具體計(jì)劃包括：

1．開發(fā)基于精確編輯的飽和誘變方法，以實(shí)現(xiàn)高通量的內(nèi)源飽和誘變。

2．研發(fā)適用于其他多重疾病基因的功能方法，擴(kuò)展框架的應(yīng)用范圍。

3．改良現(xiàn)有腳本，使程序性等位基因系列一通用流程的設(shè)計(jì)與功能打分生成過程更為簡便。

同時(shí)，該團(tuán)隊(duì)期待與遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)、比較基因組學(xué)和罕見病臨床研究等領(lǐng)域的同行進(jìn)行廣泛合作，以推動研究的深入與創(chuàng)新。（綜合整理報(bào)道）（策劃／克珂）