摘要：為創(chuàng)新罌粟種質(zhì)資源，加快單一生物堿種質(zhì)資源的創(chuàng)制。本文通過對罌粟生物堿合成途徑的STORR基因表達模式進行分析，并利用CRISPR/Cas9技術構建基因編輯載體，為創(chuàng)制單一生物堿種質(zhì)資源奠定基礎。

關鍵詞：罌粟；STORR基因；表達分析；載體構建

罌粟是一年生或多年生草本植物，其所含生物堿約100種，目前分離鑒定的有20余種，其中嗎啡、可待因、蒂巴因、那可丁、罌粟堿五種生物堿為罌粟主要的生物堿，而不同罌粟資源的生物堿含量存在顯著差異。2018年葉凱團隊通過全基因組測序，明確了罌粟中嗎啡、可待因等生物堿合成途徑，為深入研究罌粟生物堿合成機制奠定了基礎。

嗎啡是異喹啉類生物堿，是罌粟中含量最多的生物堿。研究發(fā)現(xiàn)，罌粟中各類生物堿合成代謝較為復雜，特別是BIAs生物堿合成過程[1]。嗎啡的生物合成需經(jīng)多步反應，蒂巴因、可待因是嗎啡合成途徑中的中間產(chǎn)物，且罌粟生物堿合成分支路徑（圖1）表明，細胞色素P450單加氧酶和醛-酮還原酶的融合蛋白（STORR）是罌粟中嗎啡、可待因等生物堿代謝途徑的關鍵蛋白，調(diào)控STORR基因在代謝途徑上的表達，可引起嗎啡、可待因和蒂巴因含量發(fā)生改變。Guo等[2]、Yang等[3]通過研究罌粟全基因組重復，BIAs代謝途徑及嗎啡合成通路中的可待因酮還原酶（COR）、可待因3-O-去甲基化酶（CODM）和6-O-去甲基化酶（T6ODM）三個關鍵酶在罌粟基因組中的重復、位置和序列一致性，以及BIA基因簇的全基因組重復事件，進一步證實了STORR基因融合在罌粟生物堿合成中的關鍵作用。

CRISP/Cas9基因編輯技術是目前基因功能研究和遺傳疾病治療等生命科學領域最前沿的基因編輯技術，廣泛應用于植物現(xiàn)代生物技術中，相比于傳統(tǒng)育種，其耗時短，工作量小的特點，極大地縮短了新品種選育的時間與進程，為植物基因功能研究及定向育種提供了方法，是植物遺傳改良中的有效技術手段。2016年，Alagoz Y等[4]利用CRISPR-SpCas9技術敲除了罌粟中的4’OMT2基因，使嗎啡、蒂巴因等芐基異喹啉生物堿含量顯著降低，表明CRISPR-SpCas9基因組編輯方法可有效地影響罌粟中代謝物積累水平，為罌粟生物堿代謝調(diào)控研究奠定了技術基礎。

目前，罌粟中含有嗎啡、可待因等多種生物堿，提取成本較高，單一生物堿種質(zhì)資源缺乏，為加快單一生物堿種質(zhì)資源創(chuàng)制，本研究擬通過CRISP/Cas9基因編輯技術，定向編輯罌粟STORR基因，為研究單一生物堿種質(zhì)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選用兩種罌粟資源種子，代號分別為Z1和G1。挑選顆粒飽滿的Z1和G1種子若干，進行田間試驗，生長至膨大期進行取樣。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取

選取生長良好的Z1和G1罌粟，按照TRIZOL法提取葉片組織的總RNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA。以提取的總RNA為模板，按照Hiscript?ⅡQ RT

Super Mix for qPCR（+gDNA Wiper）（Vazyme # R223-01）反轉錄試劑盒進行反轉錄，得到cDNA，測定其濃度后稀釋，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 罌粟STORR基因表達分析

利用AceQ? qPCR SYBR? Green Master Mix（Vazyme # Q111-02/AA）對罌粟不同品種、不同組織部位進行定量分析。分別提取罌粟Z1和G1的根、莖、葉和蒴果的總RNA，以反轉錄后得到的cDNA為模板，進行實時熒光定量，STORR基因相對表達量采用2-ΔΔCt方法計算，不同罌粟資源中各組織部位的STORR基因的相對表達量差異利用獨立樣本t檢驗分析。

1.2.3 罌粟STORR基因引物設計與實時熒光定量

依據(jù)實時熒光定量PCR引物設計原則，設計罌粟STORR基因qPCR引物，STORR-F：5’-ATCAAGTGGAGATGAGCCCG-3’；STORR-R，5’-CCTCAGAACCCAAAACTGCA-3’，進行q-PCR。以Actin為作為內(nèi)參：Actin-F，5’-TCTCAACCCAAAGGCTAATCG-3’；Actin-R，5’-CCCCAGAATCCAAGACAATACC-3’。實時熒光定量PCR的擴增體系為：AceQ? qPCR SYBR? Green

Master Mix 5μL，上游引物0.2μL，下游引物0.2μL，cDNA 1μL，ddH2O 3.6μL，共10μL。擴增程序為：95℃5 min；95℃10s，58℃30s，共 40個循環(huán)；95℃15s，60℃1 min，95℃15s；40℃5 min。

1.3 CRISP-CAS9載體構建

1.3.1 gRNA靶點序列設計

參照STORR基因片段，根據(jù)靶基因ORF序列及對應DNA序列，以植物組織為模板，分別擴增測序靶基因的mRNA和對應DNA部分序列，確定第一外顯子所在區(qū)間，利用CRISPR/Cas9靶點設計工具設計靶點序列。按照tRNA策略合成雙gRNA靶點表達框。

1.3.2 基因擴增

以合成基因的亞克隆載體為模板，以引物STORR-BsaI-F：5’-GTCGAAGTAGTGATTGAACAAAGCACCAGTGGTCTAG-3’，STORR-BsaI-R：5’-TTCTAGCTCTAAAACACTGCTCACAACGAGAGTTC-3’進行PCR擴增。擴增體系為：ddH2O 17μL，2×Phanta Ma ×Buffer 25μL，dNTP Mix（10 mM each）1μL，模板DNA 2μL，上游引物（10μmol/L）2μL，下游引物（10μmol/L）2μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymease（1U/μL）1μL，共50μL。PCR反應程序為：95℃30s；（95℃15s，退火溫度45～55℃15s，延伸72℃1 min）×39循環(huán)；最后延伸72℃，5 min。

1.3.3 載體構建

用BsaI單酶切pKSE401載體質(zhì)粒構建載體。酶切反應體系為：3.1 Buffer 5μL，載體質(zhì)粒3μL，BsaI 1μL，加ddH2O至50μL。將酶切產(chǎn)物純化后與PCR擴增產(chǎn)物按照Vazyme公司ClonExpress-Ⅱ

One Step Cloning Kit試劑盒進行重組連接反應，重組產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α進行培養(yǎng)，挑取PCR陽性的轉化子搖菌培養(yǎng)提取質(zhì)粒，同時隨機挑選1個陽性菌落的擴增產(chǎn)物送測序。擴增和測序引物為插入目的基因兩側的載體序列，分別為：U626p-F：5’-AAGCTTCGACTTGCCTTCCG-3’，U626P-R：5’-AAGCTTATTGGTTTATCTCA-3’。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用WPS Excel 2016和SPSS20統(tǒng)計分析軟件進行。

2 結果與分析

2.1 STORR基因組織特異性表達

以膨大期的罌粟根、莖、葉、果為實驗材料，利用q-PCR對根、莖、葉、果生物堿合成關鍵基因牛心果堿差向異構酶（STORR）進行組織特異性分析，結果如圖2所示：STORR基因在罌粟不同資源的根、莖、葉、果中均有表達，且莖中STORR基因的表達量最高，葉片中表達量最低。

2.2 不同資源STORR基因的表達分析

由圖3可知，不同罌粟資源各組織部位的STORR基因的相對表達量存在顯著差異，相對表達量依次為莖〉根〉蒴果〉葉，其中G1莖中的STORR基因較Z1相對表達量平均上調(diào)53.07%，根平均上調(diào)77.04%。

2.3 罌粟CRISP/Cas9載體構建結果

由圖4可知，STORR基因雙gRNA合成序列與CRISPR/Cas9載體序列比對結果正確，表明STORR基因CRISPR/Cas9載體構建成功，可用于進行后續(xù)基因編輯試驗。

3 結論

STORR基因罌粟嗎啡、可待因、蒂巴因等生物堿合成的關鍵基因，調(diào)控嗎啡等生物堿的生物合成。本試驗通過對STORR基因在罌粟不同資源中的表達模式進行研究，結果表明，膨大期時，罌粟STORR基因在莖中的含量顯著高于根、葉和蒴果，其次是根，說明罌粟生物堿合成的主要部位是根和莖，通過運輸轉移至蒴果果殼積累。并且STORR基因作為嗎啡、可待因等生物堿合成的上游基因，可調(diào)控代謝通路下游COR、CODM和T6ODM等生物堿合成關鍵基因的表達，進而影響嗎啡、可待因、蒂巴因等生物堿的合成及含量。同時，通過構建罌粟STORR基因CRISPR/Cas9基因編輯載體，可以預測能更好地定向敲除罌粟中STORR基因獲得轉基因植株，進而創(chuàng)制出罌粟單一生物堿新品種，為研究罌粟專一生物堿種質(zhì)奠定基礎。

參考文獻

[1] Beaudoin G A W，F(xiàn)acchini P J.Benzylisoquinoline alkaloid biosynthesis in opium poppy[J].Planta，2014，240（1）：19-32.

[2] Guo L，Winzer T，Yang X，et al.The opium poppy genome

and morphinan production[J].Science（New York，N.Y.），2018，362：343-347.

[3] Xiaofei Yang，Shenghan Gao，Li Guo，et al.Three

chromosome-scale Papaver genomes reveal punctuated

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pathway[J].NATURE COMMUNICATIONS，2021，12（1）：6030.

[4] Alagoz Y，Gurkok T，Zhang B，et al.Manipulating the

biosynthesis of bioactive compound alkaloids for next-generation

metabolic engineering in opium poppy using CRISPR-Cas9

genome editing technology[J].Scientific reports，2016，6（1）：1-9.