關(guān)鍵詞：褐土；磷耗竭；有效磷；磷形態(tài)；土壤性質(zhì)；細菌群落

磷是作物生長的必需元素之一，施用磷肥是提高作物產(chǎn)量、保障糧食安全的重要措施。磷肥在土壤中的利用效率低，有75%-90%的磷素不能被植物利用，殘留在土壤中。第二次土壤普查至今，我國土壤有效磷含量已經(jīng)從5-10mg·kg-1增加到20mg·kg-1以上，累積量還在以每年11%左右的速率增長，壽光等地土壤有效磷含量甚至高達225.2mg·kg·kg。土壤中的累積磷還會帶來水體富營養(yǎng)化的風(fēng)險，加劇磷肥資源浪費和農(nóng)田磷淋失風(fēng)險，嚴重威脅農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)安全。土壤中磷的利用趨勢及可持續(xù)性正面臨巨大的挑戰(zhàn)，探索磷耗竭過程中磷的形態(tài)轉(zhuǎn)化及影響因素，對提高磷素利用和指導(dǎo)生產(chǎn)具有很重要的意義。

磷耗竭的研究主要包括化學(xué)耗竭和生物耗竭?；瘜W(xué)耗竭表明土壤累積磷的最大表觀利用率約為45%，其表觀提取量與土壤初始有效磷含量有關(guān)，初始有效磷含量每增加1mg·kg-1，磷解析量增加4.2mg·kg-1，但化學(xué)耗竭過程與農(nóng)田生產(chǎn)實際差距大。生物耗竭是指在不施磷肥前提下，通過連續(xù)種植作物，達到消耗土壤累積磷的目的，與化學(xué)耗竭相比，生物耗竭的研究模擬實際生產(chǎn)過程，更有利于指導(dǎo)生產(chǎn)。生物耗竭過程中土壤有效磷含量多呈現(xiàn)下降趨勢，每公頃土壤磷肥施用減少100kg，土壤有效磷降低1.40-4.67mg·kg-1。也有研究發(fā)現(xiàn)，生物耗竭過程中土壤有效磷含量基本不變，甚至?xí)摺Ｒ虼?，還需要進一步確定磷耗竭過程中磷素形態(tài)轉(zhuǎn)化的機制。

土壤中磷的存在形態(tài)是影響磷有效性的關(guān)鍵，其變化受微生物和土壤理化性質(zhì)的調(diào)控。細菌作為土壤磷素循環(huán)的主要參與者，影響磷酸鹽的溶解性和酸性、堿性磷酸酶的活性，促進土壤中磷素向可溶性磷轉(zhuǎn)化，調(diào)控磷形態(tài)的變化。Bergkemper等研究表明在低磷系統(tǒng)中，細菌對磷的利用具有更高的潛力，根瘤菌門、放線菌門、酸桿菌門參與了土壤磷酸鹽的溶解。磷耗竭過程還會改變土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和功能，無機磷含量的增加提高了細菌的豐富度。NaOH-Po、NaHC03-Po等的消耗還會降低土壤中變形菌門和藍細菌門相對豐度。同時土壤有效磷與Resin-P、NaHC03-Pi呈極顯著正相關(guān)（plt;0.001）。磷耗竭下，研究土壤磷形態(tài)、細菌群落結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系，挖掘解磷細菌，為土壤中累積磷的活化和再利用提供理論依據(jù)的同時，為微生物菌劑和微生物菌肥的發(fā)展提供支撐。但目前，在土壤磷素耗竭研究中，土壤磷形態(tài)、細菌群落以及土壤性質(zhì)相互關(guān)系的研究較為缺乏。

褐土是華北平原面積最大、分布最廣的土壤，也是我國小麥和玉米產(chǎn)區(qū)之一，占華北平原土壤的64.65%。陳延華等分析了全國103個褐土31a間耕地質(zhì)量演變指出，受長期施肥影響，褐土有效磷含量呈升高趨勢，糧田Olsen-P含量在2018年均值已達29.2mg·kg-1，但其利用率低。因此提高褐土中累積磷的利用率，對于保障我國糧食安全具有重要意義。本文以北京市不同初始有效磷含量的褐土為研究對象，開展種植多茬玉米的生物耗竭試驗，通過研究土壤磷素、土壤養(yǎng)分和細菌的變化，探究褐土磷素耗竭特征，為土壤累積磷的利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試驗設(shè)計

試驗于2021年5月至2022年1月在北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所連棟溫室進行。根據(jù)不同的初始有效磷含量設(shè)置4個處理，分別為T1（17.23mg·kg-1）、T2 （40.20mg·kg-1）、T3 （108.62mg·kg-1）和T4（181.33mg·kg-1）。供試土壤取自房山區(qū)韓村河基地0-20cm土層，土壤基本信息如表1所示。供試作物為玉米，品種為京科糯336。試驗所用的PVC花盆尺寸上口為7cmx7cm，深8cm，每盆裝過2mm篩的風(fēng)干土180g，每盆播種6株。連續(xù)種植5茬，每茬施肥相同，均為不施磷肥，氮肥和鉀肥作為底肥，一次性施入，施用量一致（N：0.05g·kg-1、K20：0.04g·kg-1），氮肥為尿素（N：46%）、鉀肥為K2S04（ K20：54%），分析純。待幼苗長出第三葉時，挑選長勢一致幼苗，每盆定苗2株，每個處理21個重復(fù)，共84盆。定苗30d后，每個處理取三盆采集第一茬樣品，未采樣的盆拔除玉米植株繼續(xù)播種玉米，進行第二茬、第三茬、第四茬和第五茬磷耗竭試驗，均在定苗后30d進行采樣，每盆仔細去掉土壤中植物殘體后，采集土壤樣品裝入自封袋密封保存，分為3份，一份自然風(fēng)干后，研磨過1、2mm和0.149mm篩，用于土壤有效磷、磷形態(tài)和土壤理化性質(zhì)測定；一份作為新鮮土壤樣品，研磨過10目篩后，貯藏于-60℃冰箱，用于土壤微生物的測定；一份作為新鮮土壤樣品研磨過10目篩后，貯藏于-4℃冰箱，用于土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的測定。測定基礎(chǔ)土、每茬樣品的土壤有效磷和基礎(chǔ)土、第一茬、第三茬和第五茬土壤磷形態(tài)、有機質(zhì)、pH、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮和耗竭第一茬與第五茬土壤細菌多樣性。

1.2測定指標(biāo)和方法

土壤性質(zhì)的測定：用碳酸氫鈉浸提，鉬銻抗比色法測定土壤有效磷；用K2Cr207容量一外加熱法測定土壤有機質(zhì)；用電位法（1：2.5=土：水）測定土壤pH值；硝態(tài)氮和銨態(tài)氮采用流動注射分析儀測定。

土壤磷形態(tài)分級測定：土壤磷形態(tài)的測定選用改良的Hedley連續(xù)浸提法進行測定，分別用陰離子交換樹脂浸提測定樹脂態(tài)磷（Resin-P），陰離子交換樹脂提取后的土壤用NaHC03浸提測定碳酸氫鈉提取態(tài)無機磷（NaHC03-Pi）和碳酸氫鈉提取態(tài)有機磷（NaHC03-Po），NaHC03提取后的土壤用NaOH浸提測定氫氧化鈉提取態(tài)無機磷（ NaOH-Pi）和氫氧化鈉提取態(tài)有機磷（NaOH-Po），NaOH提取后的土壤用稀HCl浸提測定稀鹽酸提取態(tài)磷（Dil．HCI-Pi），稀HCI提取后的土壤用濃HCl浸提測定濃鹽酸提取態(tài)無機磷（Conc．HCI-Pi）和濃鹽酸提取態(tài)有機磷（Conc．HCI-Po），濃HCI浸提后的土壤用H2S04-H202消解測定殘渣態(tài)磷（Residual-P）。其中Resin-P、NaHC03-Pi和NaHC03-Po為活性磷，NaOH-Pi、NaOH-Po和Dil.HCI-Pi為中等活性磷，Conc．HCI-Pi、Conc．HCI-Po和Residual-P為穩(wěn)定性磷。

細菌測定：準確稱取0.5g土壤樣品，按照試劑盒（Fast DNA SPIN Kit For Soil，美國）說明提取土壤DNA，-20℃冰箱貯藏備用。以338F：5’-ACTCCTAC-GGGAGGCAGCAG-3’和806R：5’- GGACTACH-VGGGTWTCTAAT-3’為引物擴增細菌16S rRNA序列。用Illumina公司的Miseq PE300平臺測序（上海美吉生物）。用Fastp （https：//github．com／Open Gene／fastp，version 0.20.0）軟件對原始序列過濾。用UPARSE軟件（http： //drive5.com/uparse/， version 7.1），根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類；用RDPclas-sifier（http： //rdp. cme. msu. edu/，

version 2.11）比對Silva16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫（v138），統(tǒng)計樣本的群落組成。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019、SPSS 23、Origin 2021軟件對數(shù)據(jù)進行處理。用Mothur軟件（http：//www．mothur．org/wiki/Calculators）計算群落的Alpha多樣性；用R語言中的Vegan程序包進行PCoA、PERMANOVA分析；用在線平臺（http：//huttenhower.sph.harvard．edu/LEfSe）進行LEfSe分析（Linear discriminant analvsis EffectSize）（LDAgt;2，Plt;0.05）。基于Spearman相關(guān)性，以Rgt;0.6，Plt;0.05為閾值，進行相關(guān)性分析。

2結(jié)果與分析

2.1磷耗竭過程中有效磷的變化特征

經(jīng)過5次耗竭后，有效磷含量除T1處理外，總體呈下降趨勢。T4處理有效磷降幅最大，有效磷含量降低了43.9%（圖1）；T2和T3處理有效磷含量分別降低38.32%和38.16%；T1處理在耗竭過程中，有效磷含量呈波動趨勢。

2.2磷耗竭過程中磷素形態(tài)變化特征

土壤活性磷的含量在耗竭過程中的變化與有效磷一致，總體呈下降趨勢（圖2A）。T2處理降幅最大，達到34.59%（圖2A），活性磷組分中NaHC03-Pi（圖2C）和NaHC03-Po（圖2D）顯著降低，分別降低了73.93%和79.83%．Resin-Pi的含量增加（圖2B）。T3和T4處理的活性磷含量降幅相似，分別降低了20.33%和19.90%（圖2A），T3處理Resin-Pi和NaHC03-Pi含量降低，T4處理主要表現(xiàn)為Resin-Pi的降低。

對于中等活性磷含量，耗竭過程中，T1和T2處理呈下降趨勢，降幅分別為21.95%和15.83%；T3和T4處理先降低后升高但與種植前無顯著性差異（圖3A）。由圖3B和圖3D可知，T1和T2處理NaOH-Pi顯著升高，Dil．HCl-Pi顯著下降，T3和T4處理NaOH-Pi和Dil．HCl-Pi的變化都較小。但值得注意的是，T1、T2、T3和T4處理的NaOH-Po均顯著下降，分別降低了37.19%、82.89%、60.51%和88.22%（圖3C）。

對于土壤穩(wěn)定性磷含量，經(jīng)過5次耗竭后，T1、T2和T3處理分別增加22.71%、26.48%和43.00%，T4處理變化不顯著（圖4A）。所有處理的Conc．HCl-Pi和Residual-P含量在耗竭過程中均呈增加趨勢，與穩(wěn)定性磷的變化一致（圖4B、圖4D）；Conc．HCI-Po含量在處理間表現(xiàn)出不同的變化特征，T1處理升高，T2、T3和T4處理降低（圖4C）。

2.3磷耗竭過程中土壤性質(zhì)的變化及其與磷形態(tài)的關(guān)系

由表2可知，耗竭過程中，土壤有機質(zhì)發(fā)生顯著變化，但無明顯規(guī)律。所有處理土壤pH在磷耗竭第一茬時顯著升高，然后穩(wěn)定不變。各處理硝態(tài)氮含量變化呈上升趨勢，其含量顯著升高（Plt;0.05），5次生物耗竭后，T1、T2、T3、T4處理硝態(tài)氮含量分別增加0.83、2.67、4.80倍和1.77倍。除T1處理銨態(tài)氮顯著增加外，其余處理銨態(tài)氮變化不顯著（Pgt;0.05）。

由皮爾遜相關(guān)性分析（圖5）可知，磷耗竭過程中，有效磷與有機質(zhì)（SOM）、Resin-Pi、NaHC03-Pi、NaH-C03-Po、NaOH-Pi和NaOH-Po之間都呈極顯著相關(guān)（Plt;0.001）；有效磷與N03-N和NH4-N相關(guān)性不顯著。2.4磷耗竭對細菌群落的影響

由“多樣性分析（表3）可知，磷耗竭第五茬和磷耗竭第一茬相比，T1、T2和T3處理間的細菌群落的a多樣性指數(shù)間無顯著差異，T4處理的Shannon、Ace和Chaol指數(shù)均顯著增加。由此可見，在磷耗竭過程中，T1、T2和T3處理細菌群落多樣性變化較小，但T4處理顯著增加了細菌數(shù)量和群落多樣性。

PCoA分析表明，T4處理與T1、T2和T3處理在PCI軸方向上分離開來（圖6A），說明T4處理與其余處理間細菌群落B多樣性存在差異；磷耗竭初（S1）與磷耗竭結(jié)束（S5）兩批樣本在PC2軸方向上均分離開來（圖6A），說明磷耗竭第一茬和第五茬細菌群落B多樣性存在差異（PERMANOVA，R=0.823 1，P=0.001）。

由表3可知，T4處理在耗竭中a多樣性存在差異。在門分類水平上，T4處理磷耗竭過程中群落豐度較高的8類細菌分別為放線菌門（Actinobacterio-ta）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloro-flexi）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、厚壁菌門（Fir-micutes）、藍細菌門（Cyanobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）和擬桿菌門（Bacteroidota）（圖7A）。由圖7B可知，在屬分類水平上，磷耗竭過程中，T4處理相對豐度較高的屬為-67-14等。

2.5磷耗竭過程中土壤性質(zhì)、細菌和磷形態(tài)的關(guān)系

由相關(guān)性Heatmap分析（圖9A）可知，褐土磷耗竭過程中，門分類水平上，Proteobacteria、Bacteroido-to、Cyanobacteria和Verrucomicrobia主要與SOM、N03--N和磷形態(tài)（NaHC03-Po和Conc．HCI-Po）間表現(xiàn)為顯著的負相關(guān)；放線菌門（ Actinobacteriota）和Firmicutes與SOM、有效磷和活性較強的磷形態(tài)（NaHC03-Pi、NaHC03-Po、NaOH-Pi）間表現(xiàn)為顯著正相關(guān)。Chloroflexi和Gemmatimonadota則與Conc.HCI-Pi間存在顯著正相關(guān)；Bacteroidota和Verrucomi-crobia主要與Conc．HCI-Pi、Conc．HCI-Po和Residual-P顯著負相關(guān)。在屬分類水平上（圖9B），微枝形桿菌（Microvirga）、norank_f_Ro.seiflexaceae和斯克爾曼氏菌（Skermanella）與Olsen -P、NaHC03-Pi和NaHC03-Po顯著負相關(guān)，與Conc．HCl-Po和Residual-P顯著正相關(guān)；Nocardioide.s則相反，與Olsen -P、NaHC03-Pi和NaHC03-Po顯著正相關(guān)，與Conc．HCI-Pi顯著負相關(guān)。Arthrobacter和noranfAKYG1 722與DiIHCI-Pi顯著負相關(guān)。

3討論

在磷耗竭過程中，有效磷的降低受土壤初始磷含量影響，土壤初始有效磷含量越高，有效磷降幅越大（圖1），這與Lucas等的研究結(jié)果一致。磷耗竭過程中磷解吸的程度取決于磷酸鹽與土壤組分之間的化學(xué)鍵能，在有效磷高的土壤中，磷素吸附位點接近飽和，因此更容易解吸，被作物吸收利用。土壤初始有效磷含量最低的T1處理，在磷耗竭過程中，有效磷呈現(xiàn)上升趨勢，這可能是因為低磷脅迫會促使作物和土壤細菌分泌小分子有機酸和堿性磷酸酶，溶解難溶性磷，分解有機磷，最終使得土壤有效磷含量升高。

本研究發(fā)現(xiàn)褐土磷耗竭過程中，NaHC03-Pi在活性磷中含量最高，且NaHC03-Pi含量顯著降低（圖2），這與吳璐璐等的研究結(jié)果相似，即NaHC03-Pi是褐土和白漿土中有效磷的最大貢獻者和速效磷的主要磷源，對土壤磷素有效性具有決定性作用，由此可見磷耗竭過程會顯著消耗褐土中最主要的有效磷源。中等活性磷含量在磷耗竭過程中先降低后升高，其中降低最明顯的是NaOH浸提的有機磷NaOH-Po（圖3）。梁運江等發(fā)現(xiàn)在不施磷肥連續(xù)種植下，中等穩(wěn)定性有機磷含量呈先降低后增加再小幅度降低的趨勢，中等活性有機磷含量呈輕度下降趨勢，與本研究結(jié)果相似?？赡苁窃诹缀慕咔捌?，土壤中最有效磷降低，消耗了活性磷NaHC03-Pi，土壤中的生物利用磷素能力增強，促進土壤中的NaOH-Po轉(zhuǎn)化為活性磷。秦勝金等研究也發(fā)現(xiàn)，NaHC03-Pi與Residu-al-P之間、NaOH-Pi和Conc．HCI-Po之間還有NaOH-Po、Conc．HCl-Po與Dil．HCI-Pi存在相互轉(zhuǎn)化關(guān)系。穩(wěn)定性磷含量在磷耗竭中增加（圖4），這可能是因為玉米持續(xù)吸收磷的過程中，為了保持其電中性，不斷向土壤中分泌氫氧根為主的陰離子，導(dǎo)致土壤pH升高（表2），一方面促使磷酸根離子與鈣、鐵、鋁的反應(yīng)向生成沉淀的方向進行，從而增加土壤中難溶性磷的含量（圖4B），另一方面增加了有機一無機復(fù)合膠體的形成，也固持了一定量的土壤有機磷（圖4C）。由此可見，褐土磷耗竭過程會消耗褐土中的活性磷和中等活性磷，尤其是NaHC03-Pi和NaOH-Po，同時增加穩(wěn)定性磷含量。

本研究發(fā)現(xiàn)磷耗竭過程影響了細菌群落的結(jié)構(gòu)（圖6），其中土壤有機質(zhì)（SOM）、有效磷（Olsen-P）、NaHC03-Pi、NaHC03-Po、NaOH-Pi、Dil.HCl-Pi、Conc.HCl-Pi、Conc．HCI-Po、pH、NH4-N、和N03-N對土壤細菌群落具有顯著影響（表4）。T4處理改變了細菌群落的a多樣性（表3），門分類水平上，T4處理的Cv-anobacteria、Verrucomicrobia、Gemmatimonadota、Bdel-lovibrionota和屬分類水平上的Nocardioides、等相對豐度在耗竭過程中也發(fā)生顯著變化（圖7）。這與Adair等、Gaiero等和Ali等的研究結(jié)果相似，可能是因為磷耗竭過程中細菌群落結(jié)構(gòu)的變化受到有效磷和NaHC03-Pi的影響，引起了對土壤磷素敏感的細菌的相對豐度發(fā)生顯著變化。由圖9A可知，Bacte-roidota和Verrucomicrobia在磷耗竭中與Conc．HCl-Pi、Conc．HCl-Po、Residual-P和NH4-N呈顯著負相關(guān)；Actinobacteria和Firmicutes與NaHC03-Pi、NaH-C03-Po、NaOH-Pi、NaOH-Po和Olsen-P和SOM呈顯著正相關(guān)。前人研究發(fā)現(xiàn)Proteobacteria和Bacteroid-ota是典型的富營養(yǎng)細菌，其相對豐度明顯受到土壤中有效磷含量的制約，與Proteobacteria和Bacteroidota相比，Actinobacteria和Firmicutes更適應(yīng)貧瘠的環(huán)境。這說明，細菌群落結(jié)構(gòu)與NaHC03-Pi、NaH-C03-Po、NaOH-Pi和NaOH-Po等磷形態(tài)間是相互影響的，同時與土壤性質(zhì)緊密相關(guān)。

通過屬分類水平的Heatmap分析（圖9B）可知，Nocardioide.s與有效磷和NaHC03-Pi呈顯著正相關(guān)，與Conc．HCI_Pi呈顯著負相關(guān)。Liu等的研究也發(fā)現(xiàn)Nocardioide.s與有效磷正相關(guān)，Wang等發(fā)現(xiàn)No-cardioide.s與Fe-P、O-P存在負相關(guān)關(guān)系?？赡苁荖o-cardioide.s能活化土壤中磷酸鐵等穩(wěn)定性的磷，促進有效磷的增加。

由此可見，在磷耗竭中，土壤細菌與磷素有效性間密切相關(guān)，門分類水平上的放線菌門和厚壁菌門等菌門和屬分類水平上的norank f AKYG1 722、Arthro-bacter、uncla.ss ified_f_Micromonosporaceae和Nocardioi-des可能會促進穩(wěn)定性磷和中等活性磷轉(zhuǎn)化為有效磷和活性磷，則更適應(yīng)低磷的生態(tài)位，具有利用穩(wěn)定性磷的潛力。在實際生產(chǎn)中，可借助Nocardioides、Arthro-bacter和norankfAKYG1722等細菌的作用，促進土壤中穩(wěn)定性磷和中等活性磷向活性磷轉(zhuǎn)化，以提高土壤中累積磷的利用。同時細菌群落結(jié)構(gòu)與磷形態(tài)和土壤性質(zhì)間相互影響，但不同細菌與磷形態(tài)和土壤性質(zhì)間的關(guān)系存在差異，因此在促進土壤累積磷的運用上，不僅要考慮功能細菌的作用，還得結(jié)合土壤性質(zhì)進行多方面考慮。

4結(jié)論

（1）褐土磷耗竭過程中，有效磷含量總體呈下降趨勢，活性磷含量降低，中等活性磷含量先降低后升高，穩(wěn)定性磷含量顯著升高。

（2）褐土磷耗竭中土壤有效磷的變化主要受幾種活性較強的磷形態(tài)（Resin-Pi、NaHC03-Pi、NaHC03-Po、NaOH-Pi和NaOH-Po）的影響，其中NaHC03-Pi和NaOH-Po含量在耗竭中持續(xù)降低，對活性磷和中等活性磷的降低可能起到?jīng)Q定性作用。

（3）磷耗竭過程影響了土壤細菌的群落結(jié)構(gòu)，高磷含量（T4）處理最明顯。細菌群落的結(jié)構(gòu)和細菌相對豐度的變化與土壤有機質(zhì)、有效磷、NaHC03-Pi和NaOH-Po間相互影響。土壤細菌群落受到磷耗竭影響的同時，對耗竭過程中磷素變化具有一定調(diào)控作用，門分類水平的放線菌門、厚壁菌門、綠彎菌門等和屬分類水平的Skermanella、Nocardioide.s、Microvirga等細菌影響了磷形態(tài)的轉(zhuǎn)化。