[摘要] 目的 通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探索大麻二酚（CBD） 聯(lián)合米諾環(huán)素（MINO） 對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的治療作用。方法 絲線結(jié)扎法建立小鼠牙周炎模型，口腔局部分別給予CBD、MINO及二者聯(lián)用， 通過(guò)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR） 檢測(cè)牙周炎小鼠用藥后外周血炎癥因子變化，Micro CT、免疫印跡（WB） 及蘇木精-伊紅（HE） 染色分析局部位點(diǎn)炎癥改善情況；牙齦卟啉單胞菌抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)聯(lián)用藥物體外抗菌性能；體外誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞及牙齦成纖維細(xì)胞炎癥，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)炎癥相關(guān)mRNA表達(dá)，劃痕實(shí)驗(yàn)探索藥物對(duì)細(xì)胞遷移的影響，并通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附（ELISA） 測(cè)定探究藥物對(duì)于膠原生成的作用。結(jié)果 聯(lián)用CBD與MINO后，與單獨(dú)用藥相比，小鼠全身炎癥指標(biāo)下降，局部附著喪失減輕、組織炎癥水平降低、牙周軟硬組織破壞得到改善；體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明聯(lián)用藥物表現(xiàn)出良好的抗菌性能；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明聯(lián)用藥物降低巨噬細(xì)胞多種炎癥因子的表達(dá)水平，促進(jìn)炎癥狀態(tài)下人牙齦成纖維細(xì)胞增殖、遷移，提升膠原形成功能。結(jié)論 相較單一用藥方式法，局部應(yīng)用CBD聯(lián)合MINO對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎有著顯著療效。

[關(guān)鍵詞] 牙周炎； 大麻二酚； 米諾環(huán)素； 抗生素

[中圖分類(lèi)號(hào)] R781.4+2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/gjkq.2024078

牙周炎以牙菌斑為始動(dòng)因子，以逐漸加重、感染性牙周軟硬組織破壞為特點(diǎn)[1]，是造成成年人失牙的重要因素[2-4]，與全身健康聯(lián)系緊密[5-9]。因而，尋找牙周炎治療更高效的方案并探究其內(nèi)在機(jī)制迫在眉睫。大麻二酚（cannabidiol，CBD）是植物大麻葉提取物中唯一安全、非精神作用類(lèi)成分，可與體內(nèi)多種受體發(fā)生結(jié)合，在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、止痛、神經(jīng)保護(hù)、抗抑郁焦慮等多方面具有良好的藥用價(jià)值[10]。CBD強(qiáng)效的抗炎特性已在不同組織器官中得到驗(yàn)證，可影響多種疾病的發(fā)展進(jìn)程，包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、銀屑病、糖尿病等[11-15]。本課題組前期研究[16]發(fā)現(xiàn)：局部外用CBD可明顯減輕口腔潰瘍的炎癥程度，緩解潰瘍疼痛，促進(jìn)潰瘍愈合。

米諾環(huán)素（minocycline，MINO） 是第2代四環(huán)素類(lèi)抗生素，對(duì)需氧和厭氧革蘭陰性細(xì)菌均有抑菌效果[17]。前期研究[18]表明：MINO對(duì)牙菌斑生物膜中細(xì)菌的抑制效果明顯優(yōu)于多種其他抗生素。此外，MINO還具有抑制細(xì)胞凋亡和自噬、神經(jīng)保護(hù)、抗抑郁、抗血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移等非抗生素性質(zhì)[19-22]。然而，MINO作為目前牙周炎治療的常規(guī)藥物，缺陷也日漸凸顯——其治療周期較長(zhǎng)，在長(zhǎng)期的較高濃度用藥過(guò)程中很容易出現(xiàn)耐藥菌株所導(dǎo)致的療效下降問(wèn)題，如若繼續(xù)應(yīng)用則可能導(dǎo)致口腔菌群及腸道菌群紊亂，產(chǎn)生多種不良反應(yīng)[23]。

本研究擬探索MINO與CBD聯(lián)用是否能在降低傳統(tǒng)MINO用量的同時(shí)，對(duì)于牙周炎相關(guān)細(xì)胞同時(shí)保有抗菌、抗炎、保護(hù)膠原組織和促進(jìn)愈合等綜合性作用，為牙周炎治療提供新的思路。

鑒于CBD的安全性及多領(lǐng)域的生物學(xué)作用，聯(lián)合MINO廣譜抗菌作用及其非抗生素性質(zhì)，本研究擬用牙周局部給藥方式[24-25]，探究聯(lián)用CBD與MINO對(duì)牙周炎的療效。針對(duì)這一目標(biāo)，本研究采用機(jī)械結(jié)扎法[26-27]構(gòu)建小鼠牙周炎模型，聯(lián)用藥物開(kāi)展了一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)將結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材料和方法

1.1 材料

CBD （云南漢盟制藥有限公司，中國(guó)）、MINO（Sigma公司，美國(guó)）、SPF級(jí)C57BL雄性小鼠（12周齡）、ATCC 33277牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonasgingivalis， P. gingivalis） 菌株、RAW264.7 小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞系（mousemononuclear macrophages cell，百特生物公司，中國(guó)）、蘇木精- 伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE） 染液試劑盒（碧云天公司，中國(guó)）、5×蛋白上樣緩沖液（碧云天公司，中國(guó)）、蛋白濃度測(cè)定試劑盒（凱基生物公司，中國(guó)）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基粉末（默克生物公司，中國(guó)）、Dulbecco’s改良高糖培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eaglemedium，DMEM）（HyClone公司，美國(guó)）、分散酶（Sigma公司，美國(guó)）、Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國(guó)）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA） 試劑盒（云克隆公司，中國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 栓絲法構(gòu)建小鼠牙周炎模型、給藥及取材

對(duì)50只6～8周齡C57BL雄性小鼠（20～30 g） 進(jìn)行為期1周的檢疫，將動(dòng)物置于塑料籠中正常喂養(yǎng)5 d適應(yīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心環(huán)境。隨機(jī)將小鼠分為5組，每組各10只。將6-0手術(shù)用無(wú)菌絲線穿過(guò)小鼠上頜第一磨牙及第二磨牙之間，并于第一磨牙遠(yuǎn)中頰側(cè)打結(jié)， 建立小鼠牙周炎模型。對(duì)照處理組（Sham） 在造模后隨即剪斷并移除絲線。實(shí)驗(yàn)組分別給予10 mg/mL的CBD、1 mg/mL的MINO及10 mg/mL的CBD+1 mg/mL的MINO口腔噴劑，對(duì)照組則給予等量（每次噴劑用量均為1 mL） 輔料口腔噴劑（Vehicle），從造模后7 d開(kāi)始，連續(xù)7 d每天給予口腔噴劑1次，給藥7 d后（即造模后14 d） 取材檢測(cè)。

分組如下：1） 對(duì)照處理組（Sham） +溶劑（Vehicle），記為Control組；2） 牙周炎+溶劑（Vehicle），記為L(zhǎng)igatured 組； 3） 牙周炎+ CBD（10 mg/mL溶于溶劑），記為CBD組；4） 牙周炎+MINO（1 mg/mL溶于溶劑），記為MINO組；5） 牙周炎+CBD（10 mg/mL）+MINO（1 mg/mL），記為DUAL組。

1.2.2 Micro CT 掃描和分析

將小鼠上頜骨組織放入19 mm樣本管， 置于μCT 80 系統(tǒng)（ScancoMedical公司，瑞士），設(shè)置5 μm精度，按500 proj/180°分辨率逐層掃描（55 kV、114 mA、500 ms）。三維重建后測(cè)量絲線穿入位置即第一、第二磨牙最大近遠(yuǎn)中徑界面的鄰接點(diǎn)至牙槽嵴頂（alveolarbone crest，ABC） 的距離，以模擬牙周炎的牙槽嵴吸收。圈定上頜第一磨牙及第二磨牙之間評(píng)分ABC的位置，骨小梁分析的參數(shù)為骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume fraction，BV/TV）（%）。

1.2.3 外周血RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription-polymerasechain reaction，qRT-PCR） 實(shí)驗(yàn)

提取小鼠外周血RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（Takara公司，日本），反應(yīng)完成后獲得20 μL cDNA樣本，稀釋5倍后用于下一步實(shí)驗(yàn)或凍存于-20 ℃冰箱備用。配制qRTPCR體系，以cDNA作為擴(kuò)增模板，每樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行反應(yīng)，采用2-ΔΔCt 法定量計(jì)算。

1.2.4 石蠟切片制取及染色

配制20% 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） 脫鈣液，將掃描完畢的上頜骨樣本浸泡于脫鈣液中4周。脫水、透明、浸蠟和包埋，獲得組織蠟塊。理想切片位置為：上頜第一磨牙與第二磨牙間ABC最大近遠(yuǎn)中徑截面。將切片在45 ℃水浴鍋中充分鋪展，再用黏附性載玻片撈片，充分干燥4 ℃保存?zhèn)溆?。石蠟切片脫蠟至水，蘇木精染細(xì)胞核、伊紅染細(xì)胞質(zhì)，脫水封片后使用顯微鏡觀察切片，鏡下進(jìn)行圖像處理和比較。

1.2.5 蛋白免疫印跡（western blot，WB） 實(shí)驗(yàn)

提取小鼠牙齦組織蛋白，分裝后保存于-80 ℃冰箱，需避免反復(fù)凍融；配制1×電泳緩沖液、配制轉(zhuǎn)膜緩沖液； 制備聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel，PAGE） 凝膠和電泳；轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育；遵照化學(xué)發(fā)光試劑盒的說(shuō)明，按1∶1比例配制化學(xué)發(fā)光底物（electrochemiluminescence，ECL） 顯影液。同顯影液于室溫避光孵育2 min。調(diào)整曝光時(shí)間，觀察各條帶結(jié)果并拍照。

1.2.6 抗菌藥敏實(shí)驗(yàn)

1） 不同濃度CBD及MINO溶液的配制及最佳組合濃度探索。將CBD及MINO分別溶解于二甲基亞礬（dimethyl sulfoxide，DMSO） 溶液中，配制成20 g/L儲(chǔ)存溶液，再將其稀釋為對(duì)應(yīng)組合濃度梯度溶液備用。2） 最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC） 測(cè)定。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液[每毫升1.5×108菌落形成單位（colony forming units，CFU） ]加入96孔板中（每孔100 μL），分別加入不同濃度的CBD及MINO溶液100 μL和溶劑100 μL。培養(yǎng)48 h后，黑色背景下肉眼觀察菌液無(wú)渾濁出現(xiàn)的最低藥物濃度組合為兩藥聯(lián)用的MIC。3） 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定。取相應(yīng)濃度的CBD+MINO溶液和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液（1.5×103 CFU/mL） 各2.5 mL混合均勻，將CBD+MINO終濃度分別為1/4 MIC、1/2 MIC、MIC作為實(shí)驗(yàn)組；將DMSO溶液與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液（1.5×108 CFU/mL） 各2.5 mL混合均勻后作為對(duì)照組。于培養(yǎng)0、4、8、12、16、20、24 h后，加入細(xì)菌懸液，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)于600 nm波長(zhǎng)下各小孔吸光度（光密度值），并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 細(xì)胞炎癥誘導(dǎo)及劃痕實(shí)驗(yàn)

將6孔板中各孔原液吸凈丟棄，更換為含1 μg/mL P. gingivalis來(lái)源脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 的無(wú)雙抗培養(yǎng)基，本實(shí)驗(yàn)LPS處理時(shí)間節(jié)點(diǎn)設(shè)置為6 h，而后加入各組藥物處理12 h，在收樣前30 min加入腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP），使其在溶液中濃度為2 mg/mL。將牙齦成纖維細(xì)胞以每孔6×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，誘導(dǎo)炎癥，更換為無(wú)血清且含1%雙抗的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，使用20 μL槍尖垂直于孔板劃痕，采圖后計(jì)算劃痕面積。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均已重復(fù)3次。采用單因素方差分析確定各變量的顯著性影響，然后進(jìn)行Tukey’s多重比較檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CBD與MINO聯(lián)用有效減輕小鼠牙槽骨破壞

通過(guò)對(duì)上頜第一、二磨牙舌側(cè)面的Micro CT掃描重建，觀察到牙周炎造模后，牙槽骨的破壞尤為顯著（圖1A）。其中，Control組從上頜第一磨牙釉牙骨質(zhì)界（enamel cementum junction，CEJ） 起、到小鼠上頜第一、二磨牙間ABC止的距離（CEJ-ABC） 遠(yuǎn)大于所有給藥組小鼠，提示第一磨牙栓絲建模造成嚴(yán)重的牙槽骨吸收；而CBD+MINO處理組小鼠的牙槽骨吸收略低于CBD/MINO單獨(dú)處理組（Plt;0.05），為所有實(shí)驗(yàn)組中最低的，提示CBD+MINO的口腔局部應(yīng)用有效減輕小鼠患牙周?chē)啦酃堑难仔云茐模▓D1B）。

此外，本實(shí)驗(yàn)還通過(guò)ImageJ定量比較了各組小鼠上頜第一、二磨牙牙根近遠(yuǎn)中軸面所圍成的橫截面積差異，溶劑組小鼠牙槽骨破壞面積最大，而這一指標(biāo)在CBD+MINO組顯著降低，且低于傳統(tǒng)單獨(dú)應(yīng)用MINO組（圖1C）。同時(shí)對(duì)各骨小梁參數(shù)進(jìn)行了定量分析（圖1D），結(jié)果趨勢(shì)符合上述觀察。各組間BV/TV的分析結(jié)果與CEJ-ABC距離變化趨勢(shì)意義一致，結(jié)果表明牙周炎栓絲模型的建立對(duì)于患牙牙周骨小梁分?jǐn)?shù)具有負(fù)面影響，而應(yīng)用CBD+MINO對(duì)這一現(xiàn)象有所逆轉(zhuǎn)。造模后7 d給予CBD+MINO聯(lián)合噴劑后，相較于對(duì)照組及單獨(dú)應(yīng)用其中一種藥物而言，小鼠牙周硬組織破壞的進(jìn)展減慢、破壞程度減輕。

2.2 CBD 與MINO 聯(lián)用降低牙周炎小鼠局部和全身炎癥水平

造模后14 d收取小鼠牙周組織樣本進(jìn)行HE組織染色。機(jī)械栓絲法造模后給藥7 d，僅栓絲組可見(jiàn)患牙近遠(yuǎn)中牙槽嵴處骨質(zhì)破壞嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為圖2A中標(biāo)注所示ABC向根方退縮、以及G所示的齦乳頭處炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)。而CBD組與聯(lián)用組ABC高度保留較好，齦乳頭處炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，僅可見(jiàn)少許淋巴細(xì)胞，且CBD+MINO組淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度進(jìn)一步降低。進(jìn)一步收集局部牙齦組織行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果可證實(shí)，CBD+MINO的組合在減輕局部炎癥狀態(tài)上的效果優(yōu)于單獨(dú)使用CBD或MINO （圖2B）?？紤]到牙周炎的持續(xù)狀態(tài)在人體能夠引發(fā)全身性的低度炎癥改變，本實(shí)驗(yàn)取小鼠外周血檢測(cè)了各組小鼠血清中基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。結(jié)果顯示：與單獨(dú)用藥相比，聯(lián)用CBD+MINO可抑制全身白細(xì)胞介素（interleukin，IL） -1β及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF） -α炎癥因子的表達(dá)（圖2C）。

2.3 CBD與MINO聯(lián)用抑制P. gingivalis 增殖

回顧文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)：目前暫無(wú)CBD與MINO聯(lián)合抗菌用藥的濃度探究，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)2種藥物連續(xù)濃度梯度并進(jìn)行組合，以探究最適宜的用藥濃度。選擇P. gingivalis作為牙周炎致病菌代表菌種，分別施以不同濃度梯度的組合藥物，將微生物懸液吸光度作成熱圖形式，藍(lán)色越深代表組合藥物對(duì)于該種微生物抑制作用越強(qiáng)。如圖3A所示，可以初步將1 μg/mL CBD+0.06 μg/mL MINO作為聯(lián)合用藥MIC。

組合藥物對(duì)和P. gingivalis生長(zhǎng)曲線的影響見(jiàn)圖3B。與對(duì)照組相比，各濃度組合藥物實(shí)驗(yàn)組對(duì)其生長(zhǎng)均有不同程度的抑制，且該抑制作用呈濃度依賴性。1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC組細(xì)菌生長(zhǎng)呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，而MIC組細(xì)菌的增長(zhǎng)幾乎完全受到抑制，證明實(shí)驗(yàn)所得出組合藥物MIC濃度可靠。值得一提的是，常用于抑菌的MINO濃度一般為0.1～1 μg/mL。本實(shí)驗(yàn)顯示：CBD+MINO組合中MINO有效濃度可進(jìn)一步降低至0.06 μg/mL，降低抗生素用量對(duì)減小細(xì)菌耐藥風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

2.4 CBD 與MINO 聯(lián)用降低巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌

炎癥誘導(dǎo)的RAW264.7給予不同藥物處理后進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：給予CBD+MINO處理后，RAW264.7 中pro-IL-1β、IL-1β、TNF- α 和Irf-1基因轉(zhuǎn)錄水平均發(fā)生顯著下調(diào)，且聯(lián)用藥物組pro-IL-1β、IL-1β、TNF-α下調(diào)程度均大于單獨(dú)使用MINO （Plt;0.05），進(jìn)一步驗(yàn)證了CBD與MINO聯(lián)用對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞中炎癥相關(guān)通路基因的抑制作用（圖4A）。

同時(shí)提取不同組藥物處理的炎癥巨噬細(xì)胞裂解液蛋白， 進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)， 結(jié)果如圖4B所示，CBD+MINO處理后巨噬細(xì)胞分泌IL-1β蛋白水平較其他組有所下降，提示在體外抗炎作用方面，聯(lián)用CBD及MINO達(dá)到了比單用CBD更強(qiáng)的抗炎作用。

2.5 CBD 與MINO 聯(lián)用促進(jìn)炎癥狀態(tài)下人牙齦成纖維細(xì)胞遷移

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CBD與MINO單獨(dú)使用和聯(lián)用均能改善炎癥狀態(tài)下人牙齦成纖維細(xì)胞遷移（圖5A）。 24 h時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組毫無(wú)遷移跡象相比，CBD+MINO組已能觀察到細(xì)胞遷移，即兩藥聯(lián)用在早期就能促進(jìn)炎癥狀態(tài)下人牙齦成纖維細(xì)胞（human gingival fibroblast， HGF） 的遷移。48 h時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組相比，定量、定性結(jié)果均顯示：CBD聯(lián)用MINO能顯著改善炎癥下HGF的遷移能力（圖5B，Plt;0.001）。

2.6 CBD 與MINO 聯(lián)用提高人牙齦成纖維細(xì)胞膠原生成

qRT-PCR結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，炎癥狀態(tài)下各組HGF細(xì)胞產(chǎn)生膠原能力減弱，而CBD與MINO聯(lián)用處理組可顯著提升炎癥狀態(tài)下人牙齦成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原能力，從而基本恢復(fù)HGF正常生理功能，ELISA定量進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)果，且與單獨(dú)應(yīng)用MINO組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001）（圖6A、B）。

3 討論

作為最常見(jiàn)的口腔慢性感染性疾病，牙周炎嚴(yán)重影響患者口腔及全身健康。位于牙周袋內(nèi)的牙菌斑生物膜是牙周炎致病因素中最重要的一環(huán)，研究[2-4]顯示：定植于牙周袋內(nèi)的微生物群落所包含細(xì)菌種屬數(shù)已逾百種，由革蘭陽(yáng)性和革蘭陰性細(xì)菌共同構(gòu)成[28-29]，而臨床通常采用的齦上/齦下潔刮治的治療方式常常未能深入到根分叉病變部位和牙周袋內(nèi)底部[30]，無(wú)法有效地控制細(xì)菌感染及繼發(fā)的宿主免疫反應(yīng)，治療效果難以保證[31-33]。

CBD強(qiáng)大的生物學(xué)效應(yīng)已在眾多體內(nèi)外研究中得到證實(shí)，包括：抗癌、抗炎、止痛、神經(jīng)保護(hù)、抗抑郁焦慮五大主要方面[10]；其中，CBD良好的抗炎、免疫調(diào)節(jié)特性已在體內(nèi)多種組織器官及相關(guān)炎癥性疾病模型中得到驗(yàn)證。鑒于CBD對(duì)在口腔炎癥性疾病中發(fā)揮的良好抗炎及抑菌等功效，相關(guān)組織已研制出含CBD的口腔護(hù)理產(chǎn)品[34]，對(duì)牙周炎、牙齦炎、口腔潰瘍等口腔問(wèn)題有良好效果，并申請(qǐng)了相關(guān)發(fā)明專利。但目前針對(duì)CBD治療口腔疾病的組織驗(yàn)證研究甚少，尤其是CBD抗菌的作用機(jī)制目前尚無(wú)研究報(bào)道，因此在推廣其臨床應(yīng)用之前仍需進(jìn)一步體外抗菌實(shí)驗(yàn)探索。

MINO為一種新型廣譜抗生素，因滲透性好、脂溶性高的特點(diǎn)被用于牙周炎的治療，該藥局部用藥可變硬形成薄膜，其中一部分薄膜可與硬組織螯合之后緩慢釋放以維持局部的高濃度[35]。MINO雖作為廣譜抗生素，抑制多種細(xì)菌增殖能力早已被證實(shí)，但近期研究發(fā)現(xiàn)，其改善炎癥反應(yīng)的效果非常局限[36]，牙周炎患者局部軟硬組織受細(xì)菌毒力因子刺激產(chǎn)生較強(qiáng)的破壞性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致牙齦色形質(zhì)改變、探診出血、牙周纖維結(jié)締組織破壞、骨組織破壞乃至牙松動(dòng)甚至脫落，MINO未能從抑制炎癥方面改善牙周炎[37]，因而在抗菌治療的同時(shí)改善局部炎癥反應(yīng)也是治療牙周炎的目標(biāo)之一。因此，為在抗菌治療的同時(shí)加強(qiáng)對(duì)局部炎癥的控制，本研究在上述傳統(tǒng)MINO抗菌治療牙周炎的基礎(chǔ)上加以CBD進(jìn)行抗炎治療。

P. gingivalis是牙周炎主要致病菌之一，直接參與牙菌斑生物膜的形成[38]。本研究篩選出了CBD及MINO的組合藥物MIC組合，并繪制不同濃度藥物組合下P. gingivalis的生長(zhǎng)曲線，觀察到組合藥物的抑制作用有一定的濃度依賴性，該抑制作用在較通常單一使用MINO時(shí)所用濃度更低的MINO用量下，效果強(qiáng)于單獨(dú)應(yīng)用CBD或MINO的傳統(tǒng)抗生素療法。聯(lián)合應(yīng)用CBD及MINO對(duì)多種細(xì)菌具有較強(qiáng)的體外抑菌活性，有望成為新型的牙周炎輔助治療藥物。

本實(shí)驗(yàn)選取小鼠巨噬細(xì)胞，并使用LPS對(duì)其進(jìn)行炎癥誘導(dǎo)，這也是體外炎癥實(shí)驗(yàn)常用的細(xì)胞模型。聯(lián)用藥物在體內(nèi)對(duì)于炎癥狀態(tài)下巨噬細(xì)胞促炎作用具有強(qiáng)于單獨(dú)用藥的效果。牙齦成纖維細(xì)胞參與膠原與細(xì)胞外基質(zhì)合成，因此對(duì)牙周組織愈合至關(guān)重要[39]。牙齦成纖維細(xì)胞向缺隙間處遷移并關(guān)閉創(chuàng)口是軟組織再生的第一步，其遷移速度影響牙周組織的再生和重塑過(guò)程[40]。而在本實(shí)驗(yàn)中選取的MINO濃度分別為0.06 μg/mL，低于推薦的血清水平濃度，依然達(dá)到治療目的，且在MINO的有效抑菌濃度內(nèi)，聯(lián)用藥物可促進(jìn)炎癥狀態(tài)下人牙齦成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成。

綜上所述，本課題揭示了局部聯(lián)合應(yīng)用CBD及MINO對(duì)牙周炎的顯著療效，明確了二者聯(lián)用在牙周炎發(fā)生過(guò)程中、通過(guò)抗菌及抗炎雙重機(jī)制保護(hù)牙周組織，為牙周炎高效治療藥物研發(fā)提供新思路。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。

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（ 本文編輯 王姝 ）

[基金項(xiàng)目] 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院交叉學(xué)科創(chuàng)新項(xiàng)目（RD-03-202010）；四川省國(guó)際科技合作項(xiàng)目（2021YFH0015）