摘要：鮮食葡萄需要適當(dāng)?shù)牟珊蟊ｕr措施，保鮮劑處理引發(fā)的果實組織基因重編程在采后保鮮中發(fā)揮了重要作用。在二氧化硫（SO2）保鮮劑誘導(dǎo)表達的葡萄基因中，我們篩選出與擬南芥AtWRKY70 同源性最高的基因VvWRKY70，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)VvWRKY70 基因啟動子區(qū)含有響應(yīng)脫落酸、水楊酸、茉莉酸甲酯和低溫的順式作用元件；通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得了高表達VvWRKY70 的擬南芥植株，該轉(zhuǎn)基因植株在低溫和灰霉菌脅迫時VvWRKY70 上調(diào)表達，在SO2暴露時VvWRKY70 下調(diào)表達，說明VvWRKY70 參與了植物對生物和非生物脅迫的應(yīng)答。這些結(jié)果為進一步研究葡萄基因VvWRKY70 的功能及其作用機制提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：WRKY；葡萄；異源表達；轉(zhuǎn)錄調(diào)控

中圖分類號：Q786；S663.1； 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：0253-2395（2024）05-1079-07

0 引言

葡萄（Vitis vinifera L.）是全球范圍內(nèi)主要的栽培果樹之一，也是山西省重要的經(jīng)濟作物。由于葡萄果實生產(chǎn)的季節(jié)性，采后生理衰老和病原菌侵染腐爛等問題，需要進行采后保鮮。二氧化硫（SO2）類保鮮劑是葡萄產(chǎn)業(yè)傳統(tǒng)的保鮮劑，也是目前為止最有效、應(yīng)用最廣泛的葡萄保鮮劑［1-2］。傳統(tǒng)觀點認為SO2 的防腐保鮮作用源于其對病原菌的直接毒性［1］。近期研究發(fā)現(xiàn)，SO2保鮮處理能誘導(dǎo)葡萄果實細胞發(fā)生廣泛的代謝重編程，出現(xiàn)典型的植物防御特征［1-3］。采用RNAseq檢測對照組和SO2 保鮮組葡萄果實的基因表達譜發(fā)現(xiàn)，SO2 保鮮組中與氧化還原、激素信號、次生代謝和細胞壁合成等防御相關(guān)的多個基因表達上調(diào)，抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子WRKY、bHLH，AP2/ERF 和MYB 家族中有多個成員差異性表達［4］，因此，SO2 誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄應(yīng)答精細調(diào)控著果實的采后生理，進而達到防腐保鮮效果。

WRKY 作為植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，是植物天然免疫系統(tǒng)的核心成員，在復(fù)雜的防御應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中起著正向或負向的調(diào)控作用，參與植物對生物和非生物脅迫應(yīng)答［5］。研究表明，草莓FaWRKY25 負向調(diào)節(jié)草莓果實對灰霉菌的抗性［6］；番茄SlWRKY70 基因沉默減弱了植株對番茄蚜蟲和線蟲的抗性［7］；在水稻中，Os?WRKY89 的過表達能增強對稻瘟病和白背飛虱的抗性、對紫外線的耐受性［8］；野生毛葡萄基因VqWRKY31 能激活歐洲葡萄水楊酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和特定代謝物合成，提高其對白粉病的抗性［9］。研究較多的擬南芥AtWRKY70 被證實參與植物的免疫激活，通過水楊酸和茉莉酸依賴的防御途徑對抗病基因（R）介導(dǎo)的抗性和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR）進行調(diào)控［10-12］；AtWRKY70還與AtWRKY54 互作，共同調(diào)節(jié)植物對滲透脅迫的耐受性［13］，表明AtWRKY70 在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。

依據(jù)WRKY 家族基因的序列特征在葡萄基因組中鑒定到了59 個潛在的VvWRKY 基因，其中70%～90% 對生物或非生物脅迫應(yīng)答，說明它們廣泛參與植物對逆境的響應(yīng)［14-16］。目前，與擬南芥AtWRKY70 序列相似、參與葡萄采后保鮮的VvWRKY70 功能尚屬未知。因此，本研究從“玫瑰香”葡萄葉片cDNA 克隆獲得基因VvWRKY70，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥，并以高表達VvWRKY70擬南芥純合株系為實驗材料，檢測在SO2、低溫及灰霉菌暴露時VvWRKY70 的表達特性，為進一步研究VvWRKY70 的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 葡萄葉片總RNA的提取和cDNA合成

用TransZol Plant 試劑盒提取“玫瑰香”葡萄葉片總RNA，酶標(biāo)儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 的濃度和完整性。以質(zhì)量合格的總RNA為模板，用PrimeScript RT reagent Kit（Takara，Japan）試劑盒合成cDNA。

1.2 VvWRKY70 基因的克隆及啟動子區(qū)生物信息學(xué)分析

從NCBI（National Center of Biotechnology In?formation） 數(shù)據(jù)庫中找出VvWRKY70（LOC100255013）的可編碼序列（Coding Sequence，CDS），使用Vector NTI 設(shè)計兩端帶attB 位點的特異性引物 VvWRKY70 CDSNS F/R（表1）。以cDNA 為模板，用高保真克隆酶進行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction， PCR）擴增，PCR 產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% 瓊脂糖凝膠電泳分析后切膠回收，獲得目的片段。用Plantcare 軟件對VvWRKY70 基因啟動子區(qū)的順式元件進行分析。

1.3 VvWRKY70異源高表達擬南芥植株的獲得

利用Gateway 技術(shù)構(gòu)建VvWRKY70 基因的植物表達載體Pro35S∶∶VvWRKY70?GFP。首先通過BP 反應(yīng)將目的片段與載體pDONR221 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。利用兩對引物M13F/VvWRKY70 427R 和 VvWRKY70 562F/M13R（表1）進行菌落PCR 驗證，挑選陽性克隆提取質(zhì)粒測序，得到中間載體。中間載體通過LR 反應(yīng)與載體pB7FWG2 連接，用VvWRKY70 562F/eGFPR 引物（表1）進行菌落PCR，篩選陽性菌落。選酶切和測序合格的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建好的植物表達載體導(dǎo)入Columbia 野生型（Col-0）擬南芥（Arabi?dopsis thaliana L.）中，經(jīng)除草劑（PPT，45 mg/L）篩選、DNA 鑒定獲得T3 代擬南芥純合株系（L1、L2 和L3）。

1.4 VvWRKY70 異源高表達擬南芥植株的培養(yǎng)與處理

取擬南芥野生型（WT）和VvWRKY70 轉(zhuǎn)基因株系的種子，經(jīng)4 ℃春化1 d 后播種于混合營養(yǎng)土中，置于植物培養(yǎng)間培養(yǎng)，采用光/暗周期16 h/8 h，光照度≥3 000 lx，培養(yǎng)溫度為（23±1） ℃ ，相對濕度60%～70%［17］。植株4 周齡時用于不同逆境的脅迫實驗。

（1）SO2 暴露實驗參照課題組前期方法［17］，將植株分為SO2 熏氣組和對照組，SO2 暴露濃度采用30 mg/m3，對照組置于潔凈空氣中。熏氣24 h 后取植株地上部分用于實驗。

（2）冷脅迫實驗中，低溫處理組植株于4 ℃培養(yǎng)，對照組于22 ℃ 培養(yǎng)，脅迫24 h 后取植株地上部分用于測定。

（3）灰霉菌實驗中，接菌組在擬南芥葉片背面中央接種10 μL 灰霉菌孢子懸液（5 × 106mL-1），對照植株接種10 μL 無菌水，避光24 h后光照培養(yǎng)24 h，取植株地上組織用于檢測。

1.5 基因表達水平分析

用TransZol 試劑提取擬南芥植株地上組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過反轉(zhuǎn)錄- 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ Reverse Transcription-Polymerase ChainReaction， RT-PCR）和瓊脂糖凝膠電泳驗證轉(zhuǎn)基因株系中VvWRKY70 的表達水平；qRT-PCR（Bio-Rad， USA）檢測不同條件下擬南芥植株中VvWRKY70 的相對表達量，以AtActin2 為內(nèi)參，計算方法參考Livak 和Schmittgen（2001）［18］，所用擴增引物見表1。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計算各組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，用Duncan 方法進行多重比較，分析差異顯著性。在圖中，* 表示Plt;0.05，**表示Plt;0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因VvWRKY70啟動子區(qū)順式作用元件分析

分析顯示，基因VvWRKY70 啟動子區(qū)除了常規(guī)啟動子元件外，還含有大量與脅迫響應(yīng)、激素調(diào)節(jié)相關(guān)的作用元件（表2），包括脫落酸響應(yīng)元件（Abscisic Acid Responsive Element， ABRE）、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件TGACG-motif 和CGTCA-motif、干旱響應(yīng)的MYB 結(jié)合位點MBS（MYB binding site）以及低溫響應(yīng)元件（Low Temperature Responsive Element，LTR）等。這些作用元件的存在說明VvWRKY70可能在植物抵御多種逆境中發(fā)揮作用。

2.2 VvWRKY70基因的克隆

從鮮食葡萄品種“玫瑰香”的cDNA 模板中擴增VvWRKY 基因CDS 序列，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)長度約969 bp 的一條清晰條帶，片段大小與預(yù)期片段一致（圖 1）。

2.3 Pro35S∶∶VvWRKY70?GFP表達載體的構(gòu)建

膠回收試劑盒純化VvWRKY70 目的片段，與載體pDONR221 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)菌落PCR 驗證挑選出陽性克隆，提取質(zhì)粒進行測序驗證，得到了中間載體pENTRWRKY70（圖2（a））。中間載體通過LR 反應(yīng)與載體pB7FWG2 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用VvWRKY70 562F/eGFP R引物進行PCR 鑒定，篩選陽性菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切得到一個1 500 bp 左右的片段（圖2（b）），且測序結(jié)果符合預(yù)期，說明Pro35S∶∶VvWRKY70-GFP表達載體（圖2（c））構(gòu)建成功。

2.4 Pro35S∶∶VvWRKY70?GFP 異源過表達擬南芥植株的獲得

將構(gòu)建好的VvWRKY70 表達載體通過農(nóng)桿菌GV3101 介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，通過抗生素篩選和DNA 鑒定獲得了穩(wěn)定遺傳的T3 代轉(zhuǎn)基因純合株系L1， L2 和L3，RT-PCR 檢測證實在三個轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中VvWRKY70 高表達。

2.5 不同脅迫處理對VvWRKY70 轉(zhuǎn)錄水平的影響

轉(zhuǎn)基因擬南芥植株地上組織中基因VvWRKY70 受SO2、低溫和灰霉菌處理的影響差異表達，其中低溫和灰霉菌處理誘導(dǎo)VvWRKY70表達上調(diào)，而SO2 處理組VvWRKY70 表達下調(diào)。由此推測，葡萄VvWRKY70 可能參與植株對生物和非生物脅迫的響應(yīng)。

3 討論

生理衰老和病原菌侵染可導(dǎo)致葡萄果實采后腐敗，基因的差異表達參與調(diào)節(jié)果實的采后生理［1-3］。WRKY 家族在植物應(yīng)對多種逆境脅迫中發(fā)揮調(diào)控作用［5］，擬南芥AtWRKY70 是植物免疫和防御相關(guān)的調(diào)節(jié)基因，我們從SO2 保鮮組葡萄果實中篩選出與AtWRKY70 序列高度相似的差異表達基因VvWRKY70 進行功能研究。由于葡萄遺傳轉(zhuǎn)化困難［19］，大部分葡萄基因功能未知，有關(guān)基因功能的研究多限于在擬南芥、煙草等模式植物中進行［20-22］，因此本文利用擬南芥轉(zhuǎn)基因植株來分析VvWRKY70的功能，首先從“ 玫瑰香”葡萄中克隆到VvWRKY70 目的片段并構(gòu)建了VvWRKY70 異源表達的擬南芥純合株系，利用VvWRKY70 高表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系來研究葡萄基因VvWRKY70 對環(huán)境因子（SO2、低溫和灰霉菌）的響應(yīng)特征，為揭示VvWRKY70 在逆境脅迫中的調(diào)節(jié)作用提供了依據(jù)。

WRKY 作為植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛參與了植物對多種逆境脅迫的響應(yīng)。研究證實外施水楊酸或茉莉酸可誘導(dǎo)WRKY基因轉(zhuǎn)錄，植物抗逆性增強［23-26］。在本文中，VvWRKY70 啟動子區(qū)含有脫落酸、水楊酸、茉莉酸甲酯等激素應(yīng)答元件，及逆境響應(yīng)的順式元件，在葡萄保鮮組VvWRKY70 上調(diào)表達，可能是SO2 和低溫等環(huán)境因子激活了VvWRKY70啟動子區(qū)存在的逆境響應(yīng)元件，在保鮮組葡萄中水楊酸和茉莉酸激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的差異表達提示有可能該基因受這兩種激素調(diào)節(jié)，從而調(diào)控下游功能基因的表達，提高果實組織細胞的逆境適應(yīng)性。因此，克隆葡萄VvWRKY70 基因，并對其表達特性進行分析，將有助于揭示該基因在葡萄保鮮中的調(diào)控作用，并為改良葡萄抗病性提供新的候選基因。

在SO2 聯(lián)合低溫保鮮葡萄果實的過程中，包括VvWRKY70 在內(nèi)的多個逆境響應(yīng)基因上調(diào)表達。SO2、低溫和灰霉菌是葡萄保鮮過程中主要的環(huán)境因子，而VvWRKY70 基因是葡萄SO2 保鮮過程中誘導(dǎo)表達的基因，可能是葡萄受這三種脅迫共同作用的結(jié)果。VvWRKY70的上調(diào)表達可能參與了葡萄果實保鮮過程中對包括灰霉菌在內(nèi)的多種致病菌的防御應(yīng)答。本文利用異源表達VvWRKY70 擬南芥植株對該基因在不同逆境下的表達情況進行分析，發(fā)現(xiàn)擬南芥葉片中VvWRKY70 受灰霉菌誘導(dǎo)表達增強，說明該基因表達參與調(diào)節(jié)組織的抗病生理過程。低溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因擬南芥中VvWRKY70 表達上調(diào)，與我們先前SO2 聯(lián)合低溫保鮮葡萄果實誘導(dǎo)VvWRKY70 基因表達上調(diào)結(jié)果相同，并與文獻報道的“ 玫瑰香”葡萄VvWRKY42（與VvWRKY70 序列相似性最高）在冷脅迫下表達上調(diào)的結(jié)果一致［15］，說明VvWRKY70 基因可能通過調(diào)控葡萄對低溫脅迫的應(yīng)答，參與調(diào)節(jié)葡萄果實保鮮過程。在轉(zhuǎn)基因擬南芥中SO2 脅迫組VvWRKY70 表達下調(diào)，與SO2 保鮮組葡萄果實中VvWRKY70 基因上調(diào)表達不一致，可能與葡萄暴露的SO2 濃度和時間［2］與擬南芥植株不同有關(guān)。因此，VvWRKY70 廣泛參與了植物對灰霉病、低溫及SO2 等環(huán)境脅迫的響應(yīng)。在低溫聯(lián)合SO2 保鮮葡萄果實的過程中，VvWRKY70 可能通過這幾種環(huán)境因子的誘導(dǎo)作用，調(diào)控下游與逆境脅迫相關(guān)的功能基因表達，提高了葡萄果實抵御病原菌的抗性，進而發(fā)揮保鮮功能，具體的調(diào)控機制還需進一步的深入研究。

綜上所述，葡萄VvWRKY70 基因可能受環(huán)境誘導(dǎo)表達，參與植物細胞逆境生理過程的調(diào)節(jié)，影響植物的抗逆性。SO2 作為目前為止最有效的葡萄保鮮劑，克隆和分析在SO2 保鮮中具有重要作用的葡萄基因，為研究葡萄保鮮機理提供了實驗依據(jù)，對進一步利用功能基因創(chuàng)制新的葡萄種質(zhì)資源具有借鑒意義。

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基金項目：國家自然科學(xué)基金（31972132）；山西省專利推廣實施資助專項（20210512）；小店區(qū)科技計劃項目（202003S01）