摘 要： 抗生素作為一種常用的疾病治療藥物，在生物醫(yī)療、公共衛(wèi)生等領域中發(fā)揮著巨大作用.然而，當其通過食物鏈在人體內大量累積時，會對機體造成較大的危害.因此，針對食品、藥品及環(huán)境中殘留抗生素的高效檢測至關重要.基于核酸適配體傳感器的分析技術是一類簡單、高效、靈敏的檢測方法，在食品分析、環(huán)境監(jiān)測和醫(yī)藥檢測等領域有著廣泛應用.該類方法借助多種酶促或非酶促核酸擴增策略，構建不同類型（熒光、比色、電化學等）的核酸適配體傳感器來檢測不同種類的抗生素，實現(xiàn)分析方法的高靈敏度和低檢測限.文中綜述了當前核酸適配體傳感器在抗生素分析檢測領域的應用及研究進展，并歸納總結了幾類常見的抗生素分析方法的優(yōu)缺點，最后對核酸適配體在抗生素分析領域的應用和發(fā)展進行了前景展望，并總結其未來發(fā)展趨勢、研究焦點與挑戰(zhàn).

關鍵詞： 抗生素；核酸適配體；信號放大；傳感器；生物分析

中圖分類號：O65"" 文獻標志碼：A"""" 文章編號：1673-4807（2024）02-093-08

Research progress of nucleic acid aptamers in antibiotic detection

Abstract：Antibiotics， as commonly used drugs for the treatment of diseases， play a crucial role in the fields of biomedicine and public health. However， when antibiotics accumulate in a large amount in the human body through the food chain， it will cause great harm to the body. Therefore， the efficient detection of antibiotic residues in food， medicine and the environment is crucial. The analysis technology based on nucleic acid aptamer sensor is a kind of simple， efficient and sensitive detection method， which has been widely used in the fields of food analysis， environmental monitoring and medical detection. This kind of method relies on a variety of enzymatic or non-enzymatic nucleic acid amplification strategies to construct different types （fluorescence， colorimetric， electrochemical， etc.） nucleic acid aptamer sensors to detect different kinds of antibiotics， and realize the high sensitivity and low detection limits. This paper reviews the recent advances of nucleic acid aptamer-based sensors for the antibiotic detection， summarizes the advantages and disadvantages of these methods， and finally looks forward to the application and development of nucleic acid aptamers， and summarizes its future development trend， research focus， and challenges in future work.

Key words：antibiotics， aptamers， signal amplification， sensors， biological analysis

抗生素的發(fā)現(xiàn)和應用是人類社會發(fā)展過程中的一項偉大革命.自第一種抗生素—青霉素發(fā)現(xiàn)以來，因其在抑制和殺滅病菌中的關鍵作用，抗生素已經越來越廣泛地應用于日常生活中[1].常見的抗生素有很多，大環(huán)內酯類抗生素有紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素等，氨基糖苷類有卡那霉素、慶大霉素等，喹諾酮類有氧氟沙星、左旋氧氟沙星等.我國是當前世界上抗生素使用量最大的國家之一，其中有48%左右的抗生素用于人類醫(yī)療[2].據報道，約占五成住院患者在治療期間使用了抗生素，并且在使用抗生素的患者中，多數會同時使用兩種及以上的抗生素.但抗生素的濫用會導致一系列的健康風險和隱患，從環(huán)境殘留到食品安全等諸多方面，影響到人體健康及生態(tài)平衡.抗生素在動植物源性食品中（如肉，蛋，奶等）的殘留，最終通過食物鏈在人體中累積.過度累積的抗生素難以被機體通過正常代謝的形式排出體外，長期超出正常標準含量的抗生素將會對機體造成嚴重的傷害，包括代謝紊亂以及腎臟功能衰竭等疾病，從而引發(fā)過敏性休克、腎毒癥、耳毒癥和菌群失調等癥狀[3].同時，濫用抗生素會使得細菌的抗藥性增強，生物體二次感染時被治愈的難度進一步增大[4].因此，針對環(huán)境、食品、藥品中的殘留抗生素建立高靈敏度、高選擇性的高效實時分析檢測方法一直是抗生素研究領域的熱門話題.

由于實際樣品中抗生素基質復雜，濃度低，通常用高選擇性和高靈敏度的高效液相色譜（HPLC）[5]、液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS）[6]或氣相色譜-質譜聯(lián)用（GC-MS）[7]進行分析檢測.為了去除基質干擾以及富集目標物，在儀器檢測之前往往會進行樣品前處理過程，此過程會直接影響分析檢測的準確度和精密度.[JP3]樣品前處理方法應該盡可能簡單快速，盡量減少對環(huán)境的污染，不能污染樣品，不能引入待測組分和干擾測定的物質.目前已開發(fā)出一系列簡單高效、綠色新型的樣品前處理方法，如固相萃取、固液萃取、親和色譜分離及微流控分離[8]等.

核酸適配體（Aptamer）是通過指數富集的配體系統(tǒng)進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment， SELEX）從隨機寡核苷酸文庫中篩選獲得的對靶標物質具有很高特異性與親和力的單鏈DNA或RNA寡核苷酸序列.SELEX篩選過程主要包括結合、分離、洗脫、擴增和調節(jié)5個步驟[9]（圖1）.

核酸適配體的設計和選擇的主要依據是其特異性、選擇性、以及核苷酸序列長短等特性.抗生素核酸適配體篩選方面的技術已有較大進展，如文獻[10]采用了Precision-SELEX法對表達KPC-2的細菌進行了精確的適配體篩選，通過將蛋白質和細菌的SELEX結合，篩選的適配體可以特異性識別細菌表面的靶酶.

核酸適配體能夠高親和力、高特異性地結合目標物，與抗體相比，適配體具有合成簡單、純度較高、成本相對較低、易于化學修飾等優(yōu)勢，并且其與目標物結合后具有高度的穩(wěn)定性[11].適配體的發(fā)現(xiàn)為多種目標物質的檢測帶來了便利，在過去的幾十年里，適配體已被廣泛應用于藥物釋放、體內治療、分子傳感器、選擇性層析和生物成像等領域.近年來，適配體在分析化學領域受到了特別的關注，通過將適配體與目標物的識別和結合作用轉換為靈敏的儀器檢測信號，從而構建核酸適配體傳感器（Aptasensor），實現(xiàn)了對小分子、多肽、蛋白質、核糖體甚至病毒等多種分析物的識別和檢測[12-13].文中綜述了目前核酸適配體傳感器在抗生素分析檢測領域的研究進展，并總結了這些傳感器中所涉及的信號放大策略.此外，還介紹了目前基于核酸適配體的抗生素檢測在食品分析、環(huán)境分析和醫(yī)藥檢測等領域的實際應用.最后，對于未來核酸適配體用于檢測抗生素所面臨的挑戰(zhàn)和前景進行了展望.

1 核酸適配體的傳感機理

核酸適配體傳感器是基于核酸適配體的傳感分析策略，其傳感機制依賴于適配體特殊的二級或三級結構變化的靈活性.核酸適配體與靶標分子之間的相互作用力來源于分子間的范德華力、氫鍵、靜電相互作用、平面堆疊和形狀互補等相互作用力[14].當核酸適配體與靶標結合時，可通過自身電荷分布變化、酶切作用等方式導致其空間結構發(fā)生變化[15-16]，形成G-四連體（G-quartet）、莖環(huán)（Stem-loop）、發(fā)夾（Hairpin）、凸環(huán)（Bulge loop）、假結（Pseudoknot）等穩(wěn)定的結構，從而實現(xiàn)對特定靶標的識別和響應，釋放用于信號輸出的靶標替代物，最終達到基于核酸適配體傳感技術的定量檢測目的.

同時，這種靶標觸發(fā)性核酸適配體的構象變化可以通過與多種核酸放大元件相連接，實現(xiàn)靶標檢測的信號放大，提高檢測靈敏度.這些放大策略主要包括酶促信號放大策略和非酶促信號放大策略，目前使用最廣泛的有滾環(huán)擴增（RCA）、雜交鏈式反應（HCR），催化發(fā)夾自組裝（CHA），以及聚合酶鏈式反應（PCR）等[17]，進一步提高核酸傳感分析技術的檢測靈敏度.最后通過直接（如熒光、紫外、電化學信號等）或者間接（貴金屬納米材料的催化氧化以及熒光猝滅等）形式產生的信號，借用相關儀器獲取和擬合分析信號輸出以實現(xiàn)信號檢測[18-20].

2 基于核酸適配體的傳感器類型及其應用研究

隨著核酸適配體的廣泛應用，研究者們開發(fā)了多種源于核酸適配體的傳感器，在電化學、光學等分析策略中得到廣泛應用.目前，用于抗生素檢測的核酸適配體傳感器主要包括熒光適配體傳感器、比色適配體傳感器以及電化學適配體傳感器等[21].文中歸納總結了多種基于核酸適配體傳感器的抗生素檢測策略，收集其核酸適配體序列信息和檢測輸出方法，并對比其檢測限、線性范圍以及在實際樣品檢測中的應用.

2.1 熒光適配體傳感器

熒光檢測法由于其靈敏度高、操作簡單等特點，已被廣泛用于適配體傳感器的設計.從熒光信號產生的形式來說，熒光適配體傳感器主要包括：熒光-淬滅基團標記的經典分子信標熒光適配體傳感器；熒光標記適配體-碳納米材料淬滅型熒光適配體傳感器；熒光標記適配體-特定淬滅結構（如富G序列）熒光適配體傳感器；熒光標記適配體（或互補鏈）直接檢測型熒光適配體傳感器等[22].基于上述熒光適配體傳感器的設計，通過測定熒光信號強度的變化來實現(xiàn)對目標抗生素的定量檢測，是目前抗生素檢測中運用最廣泛的適配體傳感器之一.

文獻[23]基于熒光共振能量轉移（FRET）和核酸外切酶輔助靶循環(huán)開發(fā)了一種熒光適配體傳感器，實現(xiàn)了一步法檢測痕量氯霉素（CAP）.實驗結果表明，該方法的線性范圍為0.001～10 ng·mL-1，檢測限為0.000 2 ng·mL-1.該檢測方法具有簡便、低成本、環(huán)境友好等特點，為食品安全領域中其他有機污染分子的檢測提供了一種新的有效手段.文獻[24]基于作為受體的氧化石墨烯和作為供體的熒光標記的氟苯尼考（FF）特異性適配體之間的能量轉移，制備了熒光適配體傳感器用于快速檢測生乳樣品中的FF殘留（圖2）.在最佳條件下，該適配體傳感器具有5～1 200 nmol·L-1的寬線性范圍，檢測限為5.75 nmol·L-1，具有優(yōu)異的選擇性和高準確度.

文獻[25]建立了一種基于由熒光碳點和層狀MoS2組成的FRET供體-受體對的新型熒光適配體傳感器，用于檢測牛奶和其他動物源性食品中卡那霉素（KANA），該方法顯示出高達93%的熒光恢復效率.利用適配體誘導熒光猝滅和回收的優(yōu)點，可在4～25 μmol·L-1濃度范圍內定量檢測KANA，檢測限為1.1 μmol·L-1，回收率在85％～102％.文獻[26]建立了一種基于銀納米團簇和金納米顆粒（AuNPs）之間的表面等離子體增強能量轉移（SPEET）的熒光適配體傳感器用于檢測KANA.與已報道的KANA檢測技術相比，該方法消除了耗時的偶聯(lián)過程，縮短了檢測時間，可以在30 min內完成測定.該方法的分析范圍為5～50 nmol·L-1，檢測限為1.0 nmol·L-1.此外，通過設計含有不同序列的適配體，該方法可拓展到其他抗生素的分析檢測中.

2.2 比色適配體傳感器

比色適配體傳感器相較于其他傳感器而言，因具有可實現(xiàn)肉眼檢測、無需昂貴復雜的設備以及便于及時檢測的顯著優(yōu)勢而受到廣泛關注.該類傳感器通常與金、銀納米顆粒，以及酶和抗體相關聯(lián).AuNPs由于其優(yōu)良的光學、化學性能可實現(xiàn)信號放大作用，在低分子量化學物質的生化分析中起著關鍵作用[27].在這類分析中，適配體可以被穩(wěn)定吸附在AuNPs的表面，從而控制鹽誘導的聚集，這歸因于相鄰顆粒之間的表面等離振子共振耦合.AuNPs表面吸附的適配體與目標分析物發(fā)生特異性結合，同時從AuNPs上脫落，隨之引發(fā)AuNPs的自由聚集，基于AuNPs顆粒間距的光學性質導致其顏色從紅色變?yōu)樽纤{色，并且可以通過肉眼輕松觀察或通過UV-Vis分光光度計對原始分析物進行定量.大量關于抗生素檢測的文獻報道使用了適配體和金納米顆粒.文獻[28]建立了一種使用互補DNA鏈修飾的AuNPs和分析物特異的結合適配體檢測氟喹諾酮類藥物（FQS）的比色分析方法.該方法對FQS具有很高的選擇性，并且實現(xiàn)了在1 h內快速檢測環(huán)丙沙星（CIP），檢測限低至1.2 nmol·L-1.該方法可用于加標水、血清和牛奶樣品中CIP的測定，檢測限分別為1.3、2.6和3.2 nmol·L-1.文獻[29]則基于未修飾的AuNPs和單鏈DNA設計了一種檢測妥布霉素的比色適配體傳感器，線性范圍為40～200 nmol·L-1，檢測限為23.3 nmol·L-1.

納米酶的發(fā)展緩解了天然酶穩(wěn)定性低、成本高、難以批量生產等固有局限性.特別是，基于一些納米酶的類過氧化物酶活性，許多比色平臺已被開發(fā)出來，將顯色底物在H2O2存在下轉化為顯色產物.文獻[30]基于金納米團簇（AuNCs）固有的類過氧化物酶活性，利用四環(huán)素（TC）特異性適配體提高了AuNCs對H2O2氧化過氧化物酶底物3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺（TMB）的催化活性，建立了TC的比色傳感平臺.該檢測平臺可定量檢測濃度范圍為1～16 μmol·L-1的TC，檢測限低至46 nmol·L-1.文獻[31]以NMOF-Pt納米示蹤劑作為酶模擬物設計了一種新型的模擬酶比色傳感器，用于牛奶中KANA的檢測.利用環(huán)DNA功能化磁珠制備復合探針，靶置換反應后，磁捕獲DNA探針可觸發(fā)發(fā)夾組件釋放靶，進行信號放大.具有高類過氧化物酶活性的NMOF-Pt雜合體在H2O2存在的情況下有效催化TMB產生明顯可見的藍色，具有較高的選擇性和靈敏度，檢出限為0.2 pg mL-1.

2.3 電化學適配體傳感器

電化學適配體傳感器是將核酸適配體作為識別原件與電極相結合而構建的檢測裝置，近年來受到越來越多的關注.適配體借助固定化技術可以結合到電極表面，通過特異性識別作用生成適配體-目標分析物復合物，產生與之相關聯(lián)的濃度信號，利用能量轉換器轉化為可測定的電化學信號，從而以電化學信號作為輸出，實現(xiàn)對目標分析物的定量檢測[32].與其他適配體傳感器相比，它對含量在fmol·L-1至mmol·L-1范圍內的抗生素具有很高的靈敏度.例如，文獻[33]使用具有相同過氧化物酶樣活性的AuNPs和目標誘導的適配體用于KANA檢測，該電化學適配體傳感器（檢測限為0.06 nmol·L-1）的靈敏度遠遠高于比色法適配體傳感器（檢測限為2.28 nmol·L-1）.文獻[34]建立了一種基于適配體-抗生素偶聯(lián)物對核酸內切酶Dpn II活性保護作用的電化學方法用于氨芐西林檢測，該方法的檢測限為32 pmol·L-1.文獻[35]基于金屬離子摻雜的金屬有機骨架材料作為信號示蹤劑和RecJf核酸外切酶催化的目標回收擴增，開發(fā)了一種同時檢測土霉素（OTC）和KANA的超靈敏電化學適配體傳感器.該適配體傳感器在0.5 pmol·L-1至50 nmol·L-1的范圍內表現(xiàn)出良好的線性，對OTC和KANA的檢測限分別為0.18 pmol·L-1和0.15 pmol·L-1，該方法可以很容易地從含有其他抗生素干擾物的溶液中實現(xiàn)基質分離，且可作為多種抗生素檢測的實際應用.

此外，在電化學分析策略中，電化學儀器簡單、小型、便攜且使用成本低廉，具有現(xiàn)場實時檢測的可操作性.現(xiàn)已開發(fā)出多種針對抗生素電化學適配體的檢測儀器.其中，電化學阻抗譜通過監(jiān)測電子轉移電阻的變化以顯示阻抗信號，方波伏安法（SWV）、差示脈沖伏安法（DPV）和循環(huán)伏安法（CV）都可以觀察到法拉第電流[36]，上述方法皆顯示出較高靈敏度和低檢測限.文獻[37]結合CV和SWV等電化學分析手段，利用核酸適配體固定的互相交叉陣列電極芯片實現(xiàn)了對OTC的電化學檢測，通過繪制對數OTC濃度與電流變化（SymbolDA@I）之間的線性關系（R2=0.961），確定其檢測OTC濃度線性范圍為1～100 nmol·L-1.文獻[38]通過伏安法檢測KANA，其線性范圍為0.05 mmol·L-1至9.0 mmol·L-1，檢測限為9.4±0.4 nmol·L-1，顯示出較高的靈敏度、良好的選擇性和長達兩個月的長期穩(wěn)定性，可用于食品分析和臨床診斷中KANA的檢測.

3 核酸信號放大策略在抗生素檢測中的研究進展

基于核酸適配體傳感檢測的研究基礎，為了進一步地使適配體傳感器在檢測抗生素時具有更高的靈敏度，近年來，學者們已經開發(fā)了一些核酸信號放大策略用于抗生素檢測過程中的檢測信號放大，主要包括酶促信號放大和非酶促信號放大兩大類.

3.1 酶促信號放大策略

在分析方法中巧妙地引入了一些酶輔助循環(huán)擴增技術來放大信號，可以顯著增加檢測靈敏度，所用的酶主要包括核酸內切酶（Endonuclease）[39]與核酸外切酶（Exonuclease）[40].DNA酶（DNAzyme）是具有酶活性的DNA分子，能夠催化特定反應.文獻[41]介紹了一種基于級聯(lián)酶循環(huán)結合DNAzyme擴增的無標記電化學適配體傳感器，用于KANA的特異性檢測.該方法的檢測限低至0.5 pmol·L-1，線性范圍為1 pmol·L-1～10 nmol·L-1.文獻[42]通過均相生物識別反應誘導DNA納米結構在電極上的組裝形成，開發(fā)了一種新的生物傳感方法，在外切酶I（Exo I）的作用下，KANA適配體和端基暴露的DNA發(fā)夾探針組成的絡合物與KANA發(fā)生均相反應，繼而觸發(fā)DNA納米結構層在金電極上的組裝形成.高含量亞甲基藍和辣根過氧化物酶功能化金納米標簽被捕獲到電極上，實現(xiàn)電催化信號轉導，從而對KANA進行超靈敏的電化學檢測.KANA的檢測限為9.1 fg·mL-1，線性范圍超過5個數量級.文獻[43]報道了一種Fe3O4@polydopamine（PDA）納米復合材料和核酸外切酶III（Exo III）輔助的均相熒光生物傳感方法，設計了一種包含KANA適配體序列的DNA發(fā)夾探針，利用Exo III的高效催化反應以及PDA選擇性吸附分離雙重信號擴增手段，用于超靈敏檢測牛奶和蜂蜜為實際樣品中的KANA含量，其檢測限達到0.023 pg·mL-1，線性范圍為0.1 pg·mL-1～100 ng·mL-1.文獻[39]開發(fā)了一種3D DNA Walker和核酸內切酶IV組成的傳感系統(tǒng)，由anti-KANA適配體與KANA特異性結合觸發(fā)HCR擴增，同時結合FRET技術對KANA進行超靈敏熒光傳感檢測，檢測限低至1.01 pmol·L-1，線性范圍為5 pmol·L-1～100 nmol·L-1.

3.2 非酶促信號放大策略

當前常用的非酶促信號放大法主要有CHA，HCR和鏈置換反應（SDR）[44]等.其中，HCR是一種動力學控制的反應，通過觸發(fā)兩種亞穩(wěn)態(tài)DNA發(fā)夾探針之間的一系列雜交反應形成長的dsDNA結構.與傳統(tǒng)的檢測方法相比，HCR相對簡單并且可以在溫和的實驗條件下進行，是一種操作簡單、成本低廉的無酶等溫信號放大技術[45].文獻[27]開發(fā)了一種基于HCR反應的無酶適配體的分析方法，用于測定加標牛奶和魚類樣品中的KANA，檢測限為0.29 pg·mL-1，線性范圍為1 pg·mL-1～10 ng·mL-1.該方法具有高擴增能力、高通量和高選擇性的優(yōu)點.文獻[46]結合三螺旋適配體探針、CHA信號放大和主客體識別等元件，報道了一種電化學靈敏定量檢測TC的新型信號傳感策略.該方法檢測限低至0.13 nmol·L-1，線性范圍為0.2 nmol·L-1～100 nmol·L-1（圖3）.文獻[47]開發(fā)了一種基于FRET的熒光生物傳感器，適配體通過結合目標物釋放單鏈DNA探針，得益于生成的單鏈DNA探針誘發(fā)的CHA信號擴增過程，F(xiàn)RET引起的信號變化進一步被增強，繼而實現(xiàn)KANA的高靈敏和高選擇性檢測.檢測限低至0.29 nmol·L-1，線性范圍為1.0～80.0 nmol·L-1，并以牛奶作為實際樣品評估了該生物傳感系統(tǒng)的潛在應用價值.

綜上所述，通過對基于核酸適配體的抗生素檢測相關文獻進行概括對比（表1）可知，不同的檢測方法各具優(yōu)勢，通過核酸適配體傳感器的策略可以進行多種抗生素的高靈敏檢測，并且具有一定的靶標區(qū)分度.通過將核酸識別作用轉化為不同的檢測信號（熒光、比色、電化學等），可實現(xiàn)多場景的抗生素檢測.進一步地，通過巧妙地引入多種放大策略，可以實現(xiàn)更靈敏的抗生素檢測，為實際場景中痕量抗生素的檢測提供了可能.

4 結論與展望

基于核酸適配體的傳感器作為一種新興的傳感研究策略，在食品分析、環(huán)境監(jiān)測和醫(yī)藥檢測等領域的抗生素檢測研究中極具優(yōu)勢.近年來，基于核酸適配體的分析方法因其低成本、低耗時和超高靈敏度而得到了廣泛的關注和深入的發(fā)展，對實現(xiàn)簡單、快速、高靈敏的抗生素檢測，保障食品及環(huán)境安全具有重要意義.得益于其易合成、高純度、低成本、易于化學修飾，且在不同環(huán)境下和目標物結合后具有高度的穩(wěn)定性等特點，基于核酸適配體的傳感分析方法為抗生素的檢測打開了極為廣闊的發(fā)展和應用空間.但有報道稱，在聯(lián)合AuNPs與適配體用于KANA的檢測方法中，最常用的適配體序列似乎不能與靶標發(fā)生特異性結合，研究表明該方法忽略了AuNPs與靶標的相互作用，KANA可強烈吸附在AuNPs上導致其聚集引起顏色變化，而與DNA序列無關.目前仍存在一些制約核酸適配體傳感器在抗生素檢測領域發(fā)展的因素，如核酸適配體的穩(wěn)定性問題、不同核酸適配體親和力差異、非特異性結合和檢出信號的靈敏度問題以及其在實際樣品檢測中受到復雜基質效應的影響等問題.針對這些問題，研究者們正在嘗試不斷改進和優(yōu)化核酸適配體傳感研究策略，聚焦于核酸適配體穩(wěn)定性的提高以及聯(lián)用多種分離富集方法來改善基質效應對核酸適配體傳感器在實際樣品檢測中的影響.借助于多種選擇性的分離手段、高效的信號富集與放大策略，相信在不久的未來，可以實現(xiàn)對于抗生素的更高靈敏度和更快速的檢測，并實現(xiàn)現(xiàn)場、臨床等檢測場景的廣泛應用.

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