本篇報道圍繞2022年度上海市自然科學獎一等獎項目“非人靈長類模式動物構建”展開。

該研究由中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心研究員孫強領銜完成。

“拔一根毫毛，吹出猴萬個！”《西游記》小說中的這一情節(jié)生動地展示了什么是“克隆”。

克隆，可以通俗地被理解成“拷貝”，“像是復印出來”一個或一個個完全相同的個體、單元。

而這與“龍生九子”截然不同：克隆，跳過了兩性生殖過程，也跳過了前者可能發(fā)生的遺傳物質(zhì)的組合或

變異。

生命的繁衍，還掌握在上帝，或是神靈手中嗎？

2017年，一個世界級成果——全球首例體細胞克隆猴在中國誕生。相關論文于2018年1月25日在國際學術期刊《細胞》（Cell）上在線發(fā)表。這一消息當時就激起了整個學術圈和科研界。

此前，全球科學家經(jīng)過數(shù)十年的努力，一直未能攻克非人靈長類動物體細胞克隆的難題。直到兩只體細胞克隆猴“中中”“華華”誕生。

對這一技術的攻克，意味著人類可以借助克隆猴技術，揭開更多生命科學的奧秘，比如靈長類的發(fā)育、大腦以及多種疾病相關難題。但即便到了今天，體細胞克隆猴技術依然存在瓶頸，成功率依然不高。

“我們做克隆的目標是為了更好地構建非人靈長類模式動物?！睂O強說。

為什么需要克隆猴？

在克隆猴誕生前，猴子也被用于轉(zhuǎn)基因或藥物測試等研究。這些猴子都是由受精卵發(fā)育來的。

“但它有一個問題，就是做出來基因型是不同的，每只猴子之間的遺傳背景也不同?！睂O強表示，“再舉個例子，比如說用考試去篩選一群學生，我們要給這些學生同樣的考卷，對不對？我們篩藥也是一樣的，你這個待‘考試’的藥物好不好，你得用同樣的試卷，這樣才能減少樣本間的誤差。否則100個人參加考試，有100張不同的考卷，你怎么評價誰的水平高，誰的水平低？考卷就是這些‘猴子’，做考卷的就是這些藥。這些猴模型，比如說基因編輯和轉(zhuǎn)基因的，它們的基因型不同，致病基因可能表達水平就有差異，遺傳背景也會產(chǎn)生影響，那么就把要研究的問題復雜化了?？寺〖夹g正好可以解決這一難題，讓它們遺傳背景一致，基因型一致。這樣就能夠讓它真正變成模式動物。所謂模式？就是用一個模子刻出來的?！?/p>

克隆猴提供了幾乎完美的模型。猴是靈長類，是生命演化中最接近人的動物。

“比如，如果我有一批A基因突變的猴子，其他所有背景都一樣，只是A基因有差異，如果跟對照相比，一個藥物能夠緩解A基因突變導致的癥狀，那么就可以確認這個藥是對的?！睂O強說。

除了測試藥物，威力更強大的是，基于這一幾乎完美的動物模型，人們可以進行新藥物的研發(fā)，以及探索生命科學的未知疆域。

其實，“克隆”無處不在。植物的無性繁殖，比如插條、嫁接、落葉生根等，都是“克隆”。人類也在很早就開始嘗試克隆各種動物。但非人靈長類動物，比如猴子的克隆，始終是個難題。

早在20世紀初，德國動物學家、實驗胚胎學先驅(qū)漢斯 · 斯佩曼（Hans Spemann）已經(jīng)使用胚胎分裂技術克隆出了蠑螈。

胚胎分裂技術作為早期探索階段的技術，當然是不完美的，它的效率很低，因而沒有成為動物克隆領域研究的主要方向。孫強表示：“你可能在二細胞期或四細胞期分離，你最多也就分離出4個細胞。假如全部都變成個體，最多也就變成4個個體。但實際上，四細胞期有時候也就出生存活一個或者兩個，所以說目前胚胎級克隆的克隆數(shù)有限。而體細胞克隆，理論上是無限的?！?/p>

所以現(xiàn)代的動物克隆技術的主流是“核移植”——給卵母細胞（卵細胞）換一個細胞核。同樣因為胚胎細胞在數(shù)量上的局限性，其中翹楚還是體細胞的核移植。一個細胞核，對應著克隆后代的一個小生命。

1928年，斯佩曼嘗試將蠑螈胚胎細胞核轉(zhuǎn)移到卵細胞中，雖然最終沒有克隆成功，卻是“移核”的首次實踐。

1962年，英國牛津大學的科學家約翰 · 戈登（John Gurdon）將非洲爪蟾腸上皮細胞的細胞核移植到蛙卵細胞里，并培養(yǎng)出蝌蚪。其實驗成功率只有2%。

1996年，克隆羊多利誕生。277次核移植，只產(chǎn)生29個胚胎，最后有且只有多利幸運地出生了，這個成功率比非洲爪蟾的2%還低。但多利的誕生，打破了“體細胞無法分化”的成見。

隨后，豬、牛、狗等動物的體細胞核移植克隆都被實現(xiàn)。但克隆猴一直“胎死腹中”。

克隆猴不僅僅是為了克隆猴?？寺『镎Q生之初，研究團隊負責人蒲慕明院士和孫強研究員說，制備克隆猴不是為了獵奇，更不是為了克隆人，而是為了建立非人靈長類疾病動物模型，為研究人類疾病機制和藥物研發(fā)帶來希望。

愚公“移核”與克隆猴的瓶頸

在體外人工構建一個生命體，何其難？生命的繁衍過程太復雜了。

“挑戰(zhàn)太多了！”孫強說，“不用說培養(yǎng)一只猴子，就是從胚胎，不依賴任何母體，直接培養(yǎng)出一只老鼠，那都是非常震撼的事情，意味著（哺乳動物）生命可以在體外培育了，那是真正的試管了?！?/p>

他表示，目前，早期胚胎的所有發(fā)育還沒完全搞清楚，子宮是怎么保證胎兒營養(yǎng)的，器官在子宮內(nèi)是怎么分化的，什么誘導了器官的對稱發(fā)育……沒有回答的問題太多了?！半x開子宮還做不到，你怎么模擬一個子宮的環(huán)境？早產(chǎn)兒，畢竟在母體里待到250天或者更長時間，接近出生，各個器官都發(fā)育完成了，但是要真正變成從一個受精卵一個細胞開始完全培養(yǎng)、發(fā)育長出來很難。如果那個能做出來，遠比克隆要震撼得多！”

所以，現(xiàn)在要克隆猴，還是要“借腹”：依靠卵母細胞，以及其他沒有提供卵母細胞的雌猴“代孕”。

構建一個重組細胞，激活，移植到代孕雌猴子宮內(nèi)，然后待產(chǎn)。

孫強介紹，2003年，美國匹茲堡大學的杰瑞 · 沙騰（Gerald Schatten）教授依靠美國俄勒岡靈長類中心，曾經(jīng)一次性做了700多枚卵，然后移植到30多只猴子體內(nèi)，最后都沒成功，他當時很失望。俄勒岡靈長類中心的另一位教授——舒克拉特 · 米塔利波夫（Shoukhrat Mitalipov）覺得這可能是技術問題。2007年，他接受一個雜志的采訪，說他已經(jīng)用了1.5萬枚卵來做這只猴子。到2010年的時候，他發(fā)了一篇論文，就是把克隆胚胎移到10只猴子體內(nèi)，但是只有1只懷孕，而且懷孕到81天，這只猴子就流產(chǎn)了。

“我們總共用了接近5年時間去解決這些問題，前邊都是失敗，最大的失敗出現(xiàn)在2017年的8月?！薄?月的時候，我們就得到了兩只克隆猴，一只在140多天的時候生出來，活了3個小時，沒有肺呼吸，死掉了；另一只活了30個小時也死掉了。那個時候我們的失望達到了極點，就像買彩票，彩票中獎號碼是10個，第1個號碼到第9個號碼都是對的，然后到第10個號碼突然錯了?！?/p>

從失敗中走出來，2017年年底，他們終于成功做出了克隆猴。

孫強介紹：“實際上，體細胞很小。猴子的卵母細胞直徑110微米，很大，體細胞直徑大概就十幾個微米。我們沒有取核，它帶的細胞器和線粒體也很少。我們是直接把整個體細胞融合進去了。我們檢測過，華華細胞中來自供體體細胞的線粒體接近20%，中中的大約不到3%?！?/p>

“現(xiàn)在的問題是，克隆的效率還是很低的。猴子體細胞的表觀重建的機制，以及早期胚胎的表觀遺傳學變化還不清楚。我覺得，最主要的，也是首先要做的，是把猴子的表觀遺傳學機制解析清楚，在此基礎上，真正提升體細胞克隆的效率——希望能把現(xiàn)在大概3%左右的水平，提升到10%或以上?！?/p>

孫強說：“在2024年年初，我們發(fā)了一篇文章，在克隆恒河猴時，我們解決了胎盤的發(fā)育問題，通過滋養(yǎng)層細胞置換，把重構效率從2%提升到9%左右，提升了4倍多?！?/p>

孫強表示，克隆不是一個自然發(fā)育的過程，要打破很多障礙。通過這個克隆過程，人們可以了解胚胎早期發(fā)育，尤其表觀遺傳學層面的生物學機制，這也是對生命的認識。

目前，孫強團隊正在用多組學和測序的方法來分析細胞基礎表觀的變化是什么樣的、克隆時什么樣，來觀察各種調(diào)控過程的振蕩。

科研三階段：試管猴、轉(zhuǎn)基因猴、克隆猴……

“有人跟我聯(lián)系，說他養(yǎng)的寵物狗不行了，能不能把它克隆出來。這太簡單了，國內(nèi)有公司在做。我做的是克隆猴?！睂O強說。

在一次演講中，孫強提到他研究歷程中的三個階段：試管猴、轉(zhuǎn)基因猴、克隆猴……

他說，在云南省的西雙版納州瀾滄江畔的一座山上，他工作了4年，一直待到2008年。

那是一個973國家重點研發(fā)項目，他接手的時候，項目已經(jīng)執(zhí)行了一半。因為2001年轉(zhuǎn)基因猴技術體系已經(jīng)建立了，所以項目的目標是希望做出轉(zhuǎn)基因猴。他是半途去的，目標是至少要做出試管猴，如果能做出轉(zhuǎn)基因猴更好。

他記得非常清楚，2007年立春的2月4日當天，他們就做出了中國第一只試管猴，之后又做了十幾只猴子，但是很遺憾，沒有一只是轉(zhuǎn)基因陽性的。項目結束以后，由于沒有資金的支持，他從山上撤回來了。

回來以后，在上海待了半年多。很幸運，一個機會出現(xiàn)了。中國科學院神經(jīng)科學研究所（簡稱神經(jīng)所）的蒲慕明先生找到他，讓他繼續(xù)研究猴子。

這次是蘇州太湖的西山島，上面有一個很大的猴場，1萬多只猴子，他就到島上去陪猴子了。

在孫強的講述里，工作人員要做的一件事情是要看猴子的月經(jīng)。島上實驗室大概有1000多只猴子，每年看猴子的月經(jīng)累計要看5萬多次。每次猴子“超排卵”都要打針，從月經(jīng)來的第一天開始，一般要打12天，一天打2針。

孫強介紹，小白鼠連續(xù)20代近交，得到近交系，即遺傳背景是一致的。小鼠的繁殖周期大概是半年，連續(xù)20代也就頂多10年時間，這件事在20世紀初就做完了。但猴子的繁殖周期、性成熟時間、傳代時間要5年，做20代就要100年，“沒人能做得成”。這就是人們?yōu)槭裁葱枰寺『铩炔黄疬@

100年。

在世界首個體細胞克隆猴成果新聞發(fā)布會的報告中，孫強表示，體細胞克隆總結下來有4個節(jié)點：構建胚胎、激活胚胎、啟動核基因組、著床后發(fā)育。除了最后一個節(jié)點無法控制，前3個節(jié)點都可以干預。只不過，每一個節(jié)點都是一座“大山”。

起初，團隊里其他成員都是獸醫(yī)，包括取卵在內(nèi)的大部分精密實驗操作都由孫強一人承擔，即使在2010年國慶假期，孫強在雨夜騎車出車禍、鎖骨骨折，他也忍著劇痛花十天做完原定的取卵實驗才住院手術。絕大多數(shù)時候，大多數(shù)目標都不值得以健康為代價的投入，但在該項卓絕的研究面前，孫強認為他必須這么做。幸運的是，研究生劉真在同一年加入孫強帶領的靈長類研究平臺，次年（2011年）開始島上的生活，很快成為團隊的骨干，分擔了壓力。

劉真花了兩年練習并優(yōu)化構建胚胎的流程，“剛開始是在小鼠卵母細胞上練習，差不多連續(xù)三四個月每天練習8到10個小時”。后來轉(zhuǎn)到了更難的猴細胞上精進磨練，眼睛看著顯微鏡，兩只手操作，腳也要同時操縱任務?！吧锊煌谖锢砗蛿?shù)學，既要動腦，也要動手。”說起當時選擇生物技術作為大學專業(yè)的原因，劉真這么回答。但他當時應該沒想過，在未來還要動腳。手腳并用地練到了2014年底，劉真的實驗操作爐火純青，去一個核平均只要10秒，而注入核同樣用時甚短。

孫強主任說：“我們的團隊成員可以做到15秒內(nèi)實現(xiàn)體細胞注入操作，只有精湛的技術才可以保證對卵母細胞損傷最?。涣硗怏w外時間越短，損傷也越小?！眲⒄娌┦坎皇菆F隊唯一一個如此付出、如此熟練的人，后來神經(jīng)所有一支能熟練操作細胞核移植的隊伍。

體細胞克隆的研究就是這樣，大部分時間都在漫長的等待和重復的實驗中度過。重復的實驗不僅是一種體力活。劉真說：“其實并不是大家理解的，你每天坐在那兒苦練就行，更重要的是，要在這過程中不斷調(diào)試和尋找更好的技術方法和流程。”而突破的實現(xiàn)，靠的就是在每一個環(huán)節(jié)試錯，在每個動作細節(jié)中摳出百分之幾的改進空間，累積而成。

為了提高激活胚胎的成功率，團隊嘗試了多種激活條件，一開始使用只有13%囊胚率的離子霉素+6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）。后來使用組蛋白乙?；敢种苿┨幚恚遗呗侍岣叩?6%。效仿2014年一篇文章的條件，用組蛋白3賴氨酸9三甲基化（H3K9me3）去甲基化酶（Kdm4）處理后，囊胚率升到45%。

團隊還嘗試了不同的體細胞，因為不同來源的細胞成功率不同。最后他們發(fā)現(xiàn)成纖維細胞是最好的選擇，也正是用成纖維細胞核，克隆出了中中和華華。

孫強表示，他覺得克隆猴“中中”“華華”只是個新起點，他希望在這個基礎上能做更好的模式動物。“追求真理，保持好奇心。我還要感謝一下我的家人，因為這些年跟猴子在一起的時間，比跟他們在一起的時間都多?！?/p>