關(guān)鍵詞：橡膠樹；白粉菌；效應(yīng)蛋白

中圖分類號：S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

病原菌與植物的互作過程中，要突破植物的免疫系統(tǒng)，才能夠?qū)崿F(xiàn)成功侵染。在這個過程中，病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecularpattern）往往被植物細(xì)胞表面的模式識別受體（pattern recognition receptor）識別，激發(fā)保守分子模式觸發(fā)的免疫（PAMP-triggered immunity）[1]。然而， 很多病原菌可分泌效應(yīng)蛋白（ effectorproteins）抑制植物的免疫，效應(yīng)蛋白是病原菌致病的關(guān)鍵毒性因子，大部分植物真菌或卵菌的效應(yīng)蛋白在分泌后可作用于侵入點(diǎn)的植物細(xì)胞，影響植物細(xì)胞對病原的識別，抑制胞內(nèi)免疫信號途徑，效應(yīng)蛋白的核心功能是抑制植物免疫，促進(jìn)自身侵染[2]。

白粉菌是一種活體營養(yǎng)型專性寄生真菌，在與宿主互作的過程中，會穿透宿主細(xì)胞壁形成吸器在宿主細(xì)胞內(nèi)獲得水分和營養(yǎng)，同時產(chǎn)生大量的效應(yīng)蛋白分泌至宿主細(xì)胞內(nèi)，從而促進(jìn)真菌的增殖和侵染[3]。目前已針對大小麥白粉菌和侵染豆科作物、葫蘆科作物、葡萄、擬南芥等的白粉菌開展了寄主-病原互作機(jī)理研究。目前已預(yù)測到白粉菌特有的一類候選效應(yīng)蛋白可能是侵染寄主過程中的重要武器。預(yù)測到的效應(yīng)蛋白（candiatesecreted effector proteins， CSEPs）需符合以下3 個特征：（1）編碼蛋白N 端存在預(yù)測信號肽（signalpeptide）序列；（2）信號肽剪切位點(diǎn)后無跨膜域結(jié)構(gòu)；（3）白粉菌外的物種中無同源序列[4]。解析CSEPs 的功能將深入了解病原菌致病機(jī)理，并促進(jìn)病害防控。但很多CSEPs 的功能仍是未知的。

對于一些專性寄生真菌，常利用寄主誘導(dǎo)的基因沉默（host-induced gene silencing， HIGS）來研究效應(yīng)蛋白功能。HIGS 需要構(gòu)建表達(dá)沉默RNA 的轉(zhuǎn)基因植物，而有些寄主植物難以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因，因此限制了HIGS 的應(yīng)用范圍。噴施誘導(dǎo)基因沉默（spraying-induced gene silencing， SIGS）技術(shù)通過噴施外源RNA 傳遞到植物、病原菌等生物體表面，進(jìn)而沉默生物體關(guān)鍵基因[5]，SIGS 具有與HIGS 類似的功能，但不依賴于作物基因轉(zhuǎn)化，應(yīng)用范圍更廣。對于專性寄生真菌，包括橡膠樹白粉菌（Erysiphe quercicola）[6]、葡萄白粉菌（E. necator）[7]、葫蘆科白粉菌（E. cucurbitacearum） [8] 、大豆銹病病原菌（ Phakopsorapachyrhizi）[9]，已應(yīng)用SIGS 進(jìn)行真菌基因沉默，并展示出良好的沉默效果。

橡膠樹（Hevea brasiliensis）為多年生木本植物，是天然橡膠的主要來源[10]，但橡膠樹白粉菌侵染引起白粉病連年爆發(fā)，導(dǎo)致橡膠產(chǎn)量下降[11]。在前期工作中，對橡膠樹白粉菌全基因組完成了測序，從中預(yù)測到133 個CSEPs[12]，但對這些CSEPs 在侵染中發(fā)揮的功能幾乎是未知的。本研究對其中一個保守的效應(yīng)蛋白CSEP02974 開展致病功能研究，該效應(yīng)蛋白在其他7 個白粉菌中均有同源基因，因此這類蛋白可能是多個白粉菌的致病因子。酵母蔗糖轉(zhuǎn)化酶分泌試驗(yàn)證明了CSEP02974 信號肽具有引導(dǎo)蛋白分泌的活性。煙草定位試驗(yàn)表明CSEP02974 可能在植物中被轉(zhuǎn)運(yùn)至植物細(xì)胞內(nèi)。在擬南芥中表達(dá)該效應(yīng)蛋白可以抑制植物免疫。由于橡膠樹難以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因，無法通過HIGS 進(jìn)行基因沉默，因此采用適用范圍更廣的SIGS 進(jìn)行研究。基因沉默和致病性測試顯示，該效應(yīng)蛋白為白粉菌致病所需。本研究鑒定到一個橡膠樹白粉菌致病的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白，為進(jìn)一步研究橡膠樹-白粉菌互作分子機(jī)理提供良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試的本氏煙草（Nicotianabenthamiana） 、橡膠樹熱研7-33-97、擬南芥（Arabidopsis thaliana）由本實(shí)驗(yàn)室提供。在橡膠樹葉片古銅期進(jìn)行致病性試驗(yàn)，在煙草、擬南芥第4～6 周時開展農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)試驗(yàn)。

1.1.2 質(zhì)粒及菌株 橡膠樹白粉菌HO-73 菌株接種于橡膠樹葉培養(yǎng)，由本實(shí)驗(yàn)室保存、提供；酵母YTK12 菌株感受態(tài)由本實(shí)驗(yàn)室保存提供；pBin-GFP 載體為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）GV3101 購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 試劑 植物總RNA 提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit 和限制性內(nèi)切酶購自Thermo Fisher Scientific，高保真DNA 聚合酶試劑盒Prime STAR HS DNA Polymerase（Cat.R040A）購自TaKaRa 公司，通用型DNA純化回收試劑盒（Cat.DP204）購自天根生化科技（北京）有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒（Cat.C201-01）、同源重組試劑盒ClonExpress Ⅱ One StepCloning Kit（Cat.C112-01）購自諾維贊（南京）生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆及載體構(gòu)建 利用本實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的橡膠樹基因組數(shù)據(jù)及注釋文件查找CSEP02974基因的完整序列，通過Premier 5.0 軟件設(shè)計基因擴(kuò)增引物CSEP02974-F/R（表1）。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，32 個循環(huán)，72 ℃再延伸10 min，4 ℃待機(jī)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將含有目的基因的條帶用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化。將回收產(chǎn)物與pBin-GFP 載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行Sanger測序。使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ對pBin-GFP 載體進(jìn)行酶切，設(shè)計引物pBin-CSEP02974-F/R、pBin-CSEP-02974ΔSP-F/R、SPPR1-CSEP02974-GFP-F（表1），擴(kuò)增CSEP02974 基因，通過同源重組構(gòu)建pBin-CSEP02974-GFP、pBin-CSEP02974^ΔSP-GFP、SPPR1-CSEP02974-GFP 載體。利用Lti6b-F/R 引物從擬南芥cDNA 中擴(kuò)增Lti6b（At3g05890），并克隆至35S-RFP 表達(dá)載體上，完成Lti6b-mRFP 表達(dá)載體的構(gòu)建。所有載體均通過PCR 檢測和生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本氏煙草和擬南芥轉(zhuǎn)化 將構(gòu)建的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 的感受態(tài)中。在含有50 μg/mL 卡那霉素（kanamycin）和25 μg/mL 利福平（rifampicnic）的LB 培養(yǎng)基中28 ℃振蕩培養(yǎng)2～3 d 后離心（5000 r/min，5 min）菌液3 次，用氯化鎂緩沖液（10 mmol/LMES， 10 mmol/L MgCl2， 100 μmol/L AS）[13]懸浮，并將OD 調(diào)至0.6，室溫靜置2 h 后用注射器將菌液接種至生長4～6周的本氏煙葉背面。參考蘸花法[14]在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有CSEP02974-GFP質(zhì)粒的土壤桿菌，于28 ℃恒溫?fù)u床5000 r/min 培養(yǎng)48 h。然后以相同轉(zhuǎn)速離心10 min，收集菌體。參考蘸花法[14]配置轉(zhuǎn)化懸浮液，確保土壤桿菌懸浮液的OD 大于0.6。從培養(yǎng)4 周齡的野生型Col-0 擬南芥中選擇正常生長和發(fā)育的植株，將修剪的擬南芥植株花苞浸泡在土壤桿菌懸浮液中，5 min 后密封，暗箱處理24 h。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的擬南芥植株至8 周齡，于37 ℃烘箱烘48 h。加熱溶解1/2MS 固體培養(yǎng)基，每100 mL 中加入50 μL 潮霉素溶液，倒入平板中。擬南芥種子處理：75%乙醇浸泡15 s，去離子水漂洗，2%次氯酸鈉溶液中浸泡2 min，再次漂洗，置于1/2MS 培養(yǎng)基中無菌萌發(fā)。篩選經(jīng)萌發(fā)的擬南芥幼苗，按營養(yǎng)土與蛭石比例3∶1 移栽，植株成熟后提取DNA 驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子，選擇T2 代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 魯米諾法（Luminol）測定擬南芥葉片活性氧（ROS）的變化 在96 孔板中加入90 μL ddH2O和10 μL 魯米諾過氧化物酶緩沖液（200 μmol/Lluminol， 10 μg/mL 過氧化物酶）。向96 孔板中加入擬南芥葉盤（約10000 個），并加入10 μmol/L（GlcNAc）7。用酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度的變化情況（發(fā)射波長為530nm，激發(fā)波長為400 nm），以熒光強(qiáng)度表示ROS 迸發(fā)水平1.2.4 擬南芥葉片胼胝質(zhì)積累測定 本氏煙草葉片成功注射農(nóng)桿菌2 d 后，摘取葉片放于脫色液（乙醇∶乙酸=3∶1）中脫色至透明，透明葉片用0.01% 苯胺藍(lán)溶液（ 苯胺藍(lán)溶于0.067 mol/LKHPO 溶液）進(jìn)行避光染色4 h，熒光顯微鏡（發(fā)射波長為665 nm，激發(fā)波長為600 nm）下觀察胼胝質(zhì)積累情況，使用ImageJ 軟件計算每100 mm²胼胝質(zhì)的積累數(shù)量。

1.2.5 酵母表達(dá)載體構(gòu)建 酵母表達(dá)載體pSUC2、pSUC2-Avr1b 由本實(shí)驗(yàn)室保存。將pSUC2 載體用EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶酶切，用Cycle PureKit 純化試劑盒純化回收。用CSEP02974SP-F/R 引物KeyPo Master Mix 聚合酶擴(kuò)增CSEP02974 的信號肽全長，用Gel Extraction Kit 純化試劑盒純化回收。用ClonExpress One Step Cloning Kit 將純化后的SP 片段克隆到pSUC2 載體中得到pSUC2-CSEP02974-SP 酵母分泌載體。操作方法和反應(yīng)體系均參考產(chǎn)品使用說明書，所有載體均通過PCR檢測和生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。

1.2.6 酵母分泌試驗(yàn) 用酵母分泌系統(tǒng)對CSEP02974 的信號肽功能進(jìn)行驗(yàn)證。將pSUC2、pSUC2-Avr1b、pSUC2-CSEP02974SP 載體用經(jīng)典酵母轉(zhuǎn)化試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)化得到含有相應(yīng)載體的酵母菌株，操作步驟參考產(chǎn)品使用說明書。將含有不同載體的酵母菌株分別接種于CMD-W 和YPRAA 培養(yǎng)基平板上，驗(yàn)證YTK12 是否含有轉(zhuǎn)化酶的活性。轉(zhuǎn)化酶可將氯化三苯四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride， TTC）還原為1，3，5-三苯甲臜（1，3，5-triphenylformazan， TPF）形成不溶紅色沉淀，以進(jìn)一步驗(yàn)證信號肽的功能。

1.2.7 蛋白提取和免疫印跡分析 剪下本氏煙草葉片蛋白表達(dá)區(qū)域，加入液氮研磨葉片成粉狀。在1.5 mL 離心管中加入1 mL 植物蛋白裂解液和5 μL 蛋白酶抑制劑以及研磨的植物葉片，放于冰上冰浴30 min，每5 min 震蕩1 次，4 ℃下，12000 r/min 離心10 min，取上清液至新的離心管中。用移液槍吹打懸浮Anti-GFP 免疫磁珠，轉(zhuǎn)移30 μL 混合液到新的離心管中。加入500 μL 1×PBST，移液槍吹打懸浮Anti-GFP 磁珠，800 r/min離心1 min，棄上清液，向沉淀中加入提取的植物蛋白500 μL，4 ℃下，50 r/min 孵育6 h。4 ℃800 r/min 離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中備用。加入500 μL 1×PBST 上下翻轉(zhuǎn)樣品1 min，4 ℃，800 r/min 離心3 min，磁性分離后棄上清液。重復(fù)洗滌3 次，直至洗滌后的上清液OD 小于0.05，棄上清液。向所得沉淀中加入100 μL 1×PBST 吸打，加入30 μL 蛋白上樣緩沖液，加熱煮沸15 min，冷卻至室溫后用GFP 一抗緩沖液、熒光二抗進(jìn)行Western Blot 檢測。根據(jù)Western Blot 圖像中條帶大小判斷蛋白是否表達(dá)。

1.2.8 CSEP02974-dsRNA 的體外合成及處理選擇CSEP02974 序列中特異性最高的區(qū)域?yàn)閐sRNA 體外轉(zhuǎn)錄模板序列，根據(jù)Invitro TranscriptionT7 Kit（TaKaRa）使用說明合成并純化dsRNA。利用濃度為2×10⁵ 個/mL 的白粉菌孢子懸浮液接種古銅期橡膠樹葉片， 24 h 后噴施0.1 μg/mL dsRNA 至葉片接菌處。在接種后第7天對橡膠樹葉片病斑進(jìn)行致病性分析。

1.2.9 CSEP02974 表達(dá)的qRT-PCR 分析 分別收集橡膠樹葉片上經(jīng)過沉默處理后第7 天的葉片于液氮中研磨至粉末，用Eastep R Super totalRNA Extraction Kit 總RNA 提取試劑盒（PromegaBiotech）提取所有樣品的總RNA。用RevertAidFirst Stand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific）將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。橡膠樹的Actin 基因作為內(nèi)參，使用Quant-StudioTM5 RealTime PCR 儀器（Thermo FisherScientific）和SuperReal PreMix Plus 熒光定量試劑盒（TianGen Biotech）進(jìn)行qRT-PCR 檢測，利用QuantStudioTM Design & Analysis Softwarev1.5.2軟件對基因表達(dá)量進(jìn)行分析。操作方法參考使用說明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 CSEP02974抑制植物免疫防衛(wèi)反應(yīng)功能分析

本研究選取橡膠樹白粉菌效應(yīng)蛋白CSEP-02974 進(jìn)行試驗(yàn)，經(jīng)過NCBI（national center forbiotechnology information， http：//ncbi.nlm.nih.gov/）比對，發(fā)現(xiàn)該蛋白與其他白粉菌種的蛋白均具有較高的氨基酸相似性（表2），表明CSEP02974 可能是保守的致病因子。

為了研究CSEP02974 是否具有保守的抑制植物免疫的功能，構(gòu)建了攜帶CSEP02974 的表達(dá)載體pBin-CSEP02974-GFP。通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，對擬南芥Col-0 進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得表達(dá)CSEP02974-GFP 的轉(zhuǎn)基因株系，并且通過逆轉(zhuǎn)錄PCR 分析驗(yàn)證擬南芥中CSEP02974-GFP 的表達(dá)（圖1A）。真菌來源的幾丁質(zhì)（chitin）和細(xì)菌來源的flg22 是已報道的PAMP[15]，分別用10 μmol/L 幾丁質(zhì)單體（GlcNAc）7 和10 μmol/L flg22 處理擬南芥葉片36 h，利用苯胺藍(lán)（aniline blue）染料對胼胝質(zhì)染色，并統(tǒng)計胼胝質(zhì)形成量。統(tǒng)計結(jié)果顯示，flg22和（GlcNAc）7 均可以激發(fā)野生型（WT）擬南芥葉片形成大量的胼胝質(zhì)，而表達(dá)CSEP02974 的擬南芥葉片中，胼胝質(zhì)數(shù)量明顯減少（圖1B，圖1C）。

通過魯米諾化學(xué)發(fā)光的方法檢測CSEP02974-GFP（濃度為5 μmol/L）處理后擬南芥葉片活性氧（ROS）的含量變化。結(jié)果顯示，（GlcNAc）7和flg22 誘導(dǎo)葉肉原生質(zhì)體ROS 的積累，在50 min時ROS 積累量較高，而表達(dá)CSEP02974 的葉盤中ROS 含量較少（圖1D）。

2.2 CSEP02974的分泌功能驗(yàn)證

為了測試CSEP02974 是否為分泌蛋白，通過SignalP-5.0 在線系統(tǒng)（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）對CSEP02974 的蛋白序列進(jìn)行分析，預(yù)測到CSEP02974 的第1～22位氨基酸為信號肽序列。為了確認(rèn)CSEP02974 的假定N 端信號肽的分泌功能，通過蔗糖酶缺陷型釀酒酵母YTK12 菌株測試信號肽活性[16]。將CSEP-02974 信號肽序列連接至含有蔗糖酶（invertase）基因的pSUC2 載體上，之后把構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)入YTK12 酵母菌株中，28 ℃培養(yǎng)3 d 后，轉(zhuǎn)化含CSEP02974 信號肽的YTK12 菌株在含棉子糖的YPRAA 培養(yǎng)基上生長較快。另外，在化學(xué)催化方法中，轉(zhuǎn)化含CSEP02974 信號肽的YTK12 菌株能使透明狀態(tài)的TTC溶液轉(zhuǎn)化為不可溶的紅色物質(zhì)TPF（圖2）。以上結(jié)果表明CSEP02974 信號肽具有活性，因此CSEP02974 可能為分泌蛋白。

2.3 CSEP02974 的定位分析

為了研究CSEP02974 在分泌后是否轉(zhuǎn)運(yùn)至植物細(xì)胞內(nèi)，本研究利用本氏煙草瞬時表達(dá)所測試的蛋白并研究其定位（圖3A）。使用30%蔗糖溶液誘導(dǎo)煙草細(xì)胞質(zhì)壁分離， 并以共表達(dá)的Lti6b-mRFP 作為細(xì)胞膜標(biāo)簽[17]。以單獨(dú)的GFP作為對照，當(dāng)將煙草PR1 蛋白信號肽（SP）連接至GFP，觀察到SP-GFP 蛋白在植物胞質(zhì)中信號減弱（圖3B），說明PR1 蛋白信號肽可以引導(dǎo)GFP 蛋白分泌出植物細(xì)胞。將SP 替換CSEP02974 自身信號肽和使CSEP02974 融合GFP標(biāo)簽，觀察到SP-CSEP02974-GFP 在植物胞質(zhì)中信號較強(qiáng)（圖3B），表明SP引導(dǎo)CSEP02974分泌出細(xì)胞后，CSEP02974 又可被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)。同時，觀察到含自身信號肽的CSEP02974-GFP或刪除信號肽的CSEP02974-GFP（CSEP02974^ΔSP_GFP）和單獨(dú)GFP類似，均主要定位在胞質(zhì)中（圖3B）。上述結(jié)果表明CSEP02974 可被植物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)。

2.4 CSEP02974的致病性分析

為研究CSEP02974 在白粉菌侵染過程中的作用，接種白粉菌24 h 后，將合成的CSEP02974-dsRNA 稀釋至0.1 μg/mL 后噴施于已接種白粉菌的橡膠樹葉片表面，并于接種7 d 后觀察白粉菌侵染情況（圖4A）。與野生型（WT）和噴灑GFP序列的dsRNA（GFP-dsRNA） 相比， 噴施CSEP02974-dsRNA 的植株上白粉菌引起的癥狀明顯減輕，病斑面積僅為GFP-dsRNA 處理的11.11%（圖4B）。對經(jīng)dsRNA 處理過的橡膠樹葉片進(jìn)行取樣，以白粉菌EF1a 引物為內(nèi)參，采用qRT-PCR 檢測CSEP02974 在侵染過程中的表達(dá)情況（圖4C）。結(jié)果表明，CSEP02974-dsRNA 處理后，CSEP02974 的表達(dá)水平為野生型的39%，為GFP-dsRNA 處理的48%。以上結(jié)果表明，葉面噴施CSEP02974-dsRNA 可導(dǎo)致侵染橡膠樹的白粉菌基因沉默，并顯著抑制白粉菌的侵染和在葉片內(nèi)的擴(kuò)展。

3討論

橡膠樹為多年生木本植物，因其自然特性，其抗病基因鑒定和育種較難開展，抗病資源稀缺；并且對于專性寄生真菌，特別是白粉菌，目前對這類真菌的效應(yīng)蛋白的基因功能缺乏了解，因此，亟需進(jìn)行寄主-病原互作機(jī)制的研究，以探尋抑菌的新靶點(diǎn)。

活性氧迸發(fā)和胼胝質(zhì)的積累被認(rèn)為是植物應(yīng)對病原物侵染的基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)[18]，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)方法，觀察候選效應(yīng)蛋白是否能誘導(dǎo)或抑制模式植物細(xì)胞活性氧爆發(fā)、胼胝質(zhì)沉積等反應(yīng)，是真菌效應(yīng)蛋白篩選的常用方法[19-20]。如稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）效應(yīng)蛋白Slp1、小麥禾生球腔菌（Mycosphaerella graminicola）效應(yīng)蛋白Mg3LysM 可抑制幾丁質(zhì)觸發(fā)的免疫[21-22]；水稻黃單胞菌T3SS 效應(yīng)蛋白可抑制flg22誘導(dǎo)的擬南芥的PTI[23]；玉米黑粉菌分泌的Pep1 通過抑制植物的過氧化物酶活性，清除活性氧的積累來保護(hù)菌絲[24]。為了檢測克隆的候選效應(yīng)蛋白是否具有免疫抑制的功能，本研究構(gòu)建了表達(dá)CSEP02974-GFP 的轉(zhuǎn)基因擬南芥，用PAMP 進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)CSEP02974 可抑制flg22 和幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的胼胝質(zhì)和活性氧的積累，確定CSEP02974 為毒性蛋白。

目前對白粉菌效應(yīng)蛋白的功能驗(yàn)證常用的方法是基因沉默。SIGS 作為一種新型基因沉默技術(shù)，其以病原菌生長發(fā)育和致病相關(guān)基因?yàn)榘袠?biāo)，將體外合成的針對靶基因的dsRNA 噴施于植物表面，抑制靶基因的表達(dá)[25]。SIGS 已被應(yīng)用于多種植物病害機(jī)理研究，并展示出良好的應(yīng)用前景。已有報道指出，SIGS 技術(shù)能夠有效沉默核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、葡萄孢菌（Botrytiscinerea）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）等農(nóng)業(yè)上重要的病原真菌[26]。局部應(yīng)用靶向DCL1 和DCL2 的dsRNA 可抑制水果、蔬菜和花卉的灰霉菌病[23]。SIGS 在白粉菌中的應(yīng)用也較為廣泛，如葫蘆科白粉菌CNAP8878、CNAP9066等6 個保守非注釋蛋白通過dsRNA 誘導(dǎo)的基因沉默后，出現(xiàn)明顯的沉默表型，白粉菌生物量和病狀大幅減少[8]。通過SIGS 技術(shù)沉默橡膠樹白粉菌β-微管蛋白（Tub）、甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）和幾丁質(zhì)合酶（Chs）基因，導(dǎo)致致病力下降，病斑大幅減少[6]。這為白粉菌的基因沉默技術(shù)提供了新方向。在白粉菌中對CSEP02974 進(jìn)行基因沉默，通過熒光定量PCR 分析和表型觀察發(fā)現(xiàn)，沉默該基因會導(dǎo)致白粉菌擴(kuò)展侵染受抑制。

近年來，對白粉菌效應(yīng)蛋白的功能鑒定、靶標(biāo)篩選等研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但關(guān)于白粉菌效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的研究甚少，在效應(yīng)蛋白功能機(jī)制的研究中，對效應(yīng)蛋白的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制具有重要的研究價值[27]。本研究通過酵母分泌系統(tǒng)驗(yàn)證了CSEP02974信號肽具有分泌活性，通過煙草系統(tǒng)探明了CSEP02974被分泌后進(jìn)入宿主細(xì)胞。目前，效應(yīng)蛋白在稻瘟菌中的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，稻瘟菌效應(yīng)蛋白從病原菌的侵染菌絲中分泌后，細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)蛋白PWL2 會進(jìn)入受體植物的細(xì)胞質(zhì)中直接作用于宿主，并能通過轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入諸多還未侵染菌絲的相鄰宿主細(xì)胞中，質(zhì)外體效應(yīng)蛋白Bas4會停留在由EIHM 膜（extrainvasive hyphal membrane， EIHM）與侵染菌絲膜形成的質(zhì)外體隔間里[28-29]。效應(yīng)蛋白的這一系列作用機(jī)制的差異性取決于效應(yīng)蛋白分泌后定位特點(diǎn)的多樣性。本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時表達(dá)技術(shù)在煙草葉片中瞬時表達(dá)全長效應(yīng)蛋白，發(fā)現(xiàn)CSEP02974 在細(xì)胞質(zhì)壁分離分泌到細(xì)胞外后，在細(xì)胞膜上仍可見到熒光，推測CSEP02974被分泌到細(xì)胞外后又進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，推測CSEP-02974 是細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)蛋白。

綜上，本研究利用異源表達(dá)系統(tǒng)、農(nóng)桿菌侵染系統(tǒng)、酵母分泌系統(tǒng)以及相對定量、亞細(xì)胞定位、SIGS技術(shù)鑒定了橡膠樹白粉菌關(guān)鍵致病因子，為致病機(jī)理研究提供有利支撐。