摘 要：為了探討棘孢木霉（Trichoderma asperellum）對(duì)蘋果幼苗生長(zhǎng)、葉片光合參數(shù)和抗氧化系統(tǒng)的影響，設(shè)計(jì)了組培苗和盆栽苗兩大試驗(yàn)系列。結(jié)果表明，棘孢木霉在蘋果根際具有較強(qiáng)的定殖能力，并且能夠顯著促進(jìn)組培苗根系的生長(zhǎng)。具體來(lái)說(shuō)，接種后的幼苗根部定殖率高達(dá)9×103CFU/克，根表面積、根長(zhǎng)、根體積及投影面積均呈現(xiàn)出顯著的增長(zhǎng)趨勢(shì)。在盆栽苗設(shè)計(jì)試驗(yàn)中也觀察到了棘孢木霉對(duì)蘋果幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。與對(duì)照組相比，接種后的幼苗在株高、葉片光合作用及抗氧化酶系統(tǒng)方面均表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。在幼苗生長(zhǎng)的40～50天時(shí)，生長(zhǎng)速度達(dá)到了峰值，相較于對(duì)照組，增長(zhǎng)率分別為27.97%和32.86%。此外，經(jīng)棘孢木霉誘導(dǎo)的蘋果苗在葉片光合作用方面也展現(xiàn)出優(yōu)異的表現(xiàn)，包括光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）及葉綠素含量（Chi）的顯著提升。同時(shí)，過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性也明顯增強(qiáng)，而胞間CO2濃度及丙二醛（MDA）含量則顯著降低。

關(guān)鍵詞：棘孢木霉；蘋果；葉片；光合作用；抗氧化系統(tǒng)

目前，化學(xué)肥料和農(nóng)藥對(duì)保障糧食、果蔬高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)起到不可替代的作用。它們的過(guò)度使用已經(jīng)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染和破壞，同時(shí)也對(duì)食品安全和食品貿(mào)易產(chǎn)生了不良影響。研究表明，微生物農(nóng)藥和微生物肥料具有可持續(xù)性及與環(huán)境相容性的特點(diǎn)，有望成為化學(xué)藥劑的潛在替代品。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者致力于研究木霉對(duì)植物的促生機(jī)制。

對(duì)植物起促生作用的有益微生物種類多樣，包括鏈霉菌屬（Streptomyces）、根瘤菌屬（Rhizobium）等。木霉屬（Trichoderma）真菌，具有高效性和廣譜性的抑菌功能并且能促進(jìn)植物生長(zhǎng)[1-3]，廣泛存在于土壤中。21世紀(jì)前大多研究都注重在木霉生物防治方面，對(duì)其促生機(jī)制研究甚少[4-6]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，木霉菌可以穩(wěn)定地定殖在植物的根部，并通過(guò)改良土壤、引起植物新陳代謝的變化、分泌植物生長(zhǎng)激素、抑制病原菌生長(zhǎng)、誘導(dǎo)植物抗性、提高養(yǎng)分利用率等方式促生[7]。接種哈茨木霉菌可以有效促進(jìn)番茄幼苗生長(zhǎng)并提高產(chǎn)量[8]，而鉤狀木霉菌則對(duì)辣椒疫病具有生物防治作用[9]。此外，當(dāng)植株面臨非生物脅迫時(shí)，木霉的誘導(dǎo)作用可以顯著降低植株中的活性氧水平，從而提高其對(duì)逆境的抵抗力。例如，在玉米接種綠色木霉和哈茨木霉后，鹽和干旱對(duì)玉米的傷害得到了有效緩解[10-11]。

雖然目前關(guān)于木霉對(duì)作物生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆性的影響已有研究報(bào)道，但受試物種主要集中在番茄、小麥、玉米和水稻等禾本科植物上，而關(guān)于木霉對(duì)木本植物蘋果生長(zhǎng)發(fā)育影響的研究較少。鑒于此，筆者在本試驗(yàn)中以蘋果幼苗為試材，評(píng)價(jià)菌株ACCC30536對(duì)幼苗生長(zhǎng)、葉片光合參數(shù)、葉綠素含量以及抗氧化酶活性等生理指標(biāo)的影響，以期為木霉開(kāi)發(fā)成為新型生物農(nóng)藥提供一定的理論和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 供試菌株 棘孢木霉 ACCC30536菌株購(gòu)買自泰斯拓生物。

1.1.2 供試植物 嘎拉蘋果組培苗，培養(yǎng)于魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)林作物抗逆育種實(shí)驗(yàn)室，設(shè)置室內(nèi)溫度 24 ℃，光/暗周期 14小時(shí)/10 小時(shí)。

1.1.3 試劑與培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂 （PDA） 培養(yǎng)基（表1）。

1.1.4 主要儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) TU-1810 （北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；ME104E1/1000 電子天平 （賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；SW-CJ-1BU 型潔凈工作臺(tái) （蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；ZQZY-CF 型振蕩培養(yǎng)箱 （上海知楚儀器有限公司）、DHT-450A 高溫鼓風(fēng)干燥箱（上海島韓實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 棘孢木霉孢子懸浮液制備 將棘孢木霉在PDA平板上28 ℃生長(zhǎng)7天，將10毫升無(wú)菌水加入培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿中的孢子刮下。將孢子懸浮液轉(zhuǎn)移至30個(gè)直徑為30毫米玻璃珠的無(wú)菌錐形瓶（150毫升）中，用封口膜封口，將其放入恒溫振蕩器，最后制成木霉孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子濃度，將其調(diào)整為1×105CFU/毫升，備用。

1.2.2 蘋果組培苗處理 將生根30～40天的蘋果苗在超凈工作臺(tái)中移栽至裝有滅菌苔蘚組培瓶中，放在植物組培室生長(zhǎng)5天，然后將制作好的棘孢木霉孢子懸浮液接種至苔蘚組培瓶中。

1.2.3 蘋果組培苗根部定殖的測(cè)定 取接菌后的蘋果苗根部于 FAA 透明液中固定 1 分鐘，制作臨時(shí)裝片，于顯微鏡下觀察蘋果苗根部菌絲定殖情況。采用菌落計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)棘孢木霉菌定殖數(shù)量。在超凈工作臺(tái)內(nèi)取出接菌后的蘋果苗，將根部苔蘚清理干凈，利用研缽將蘋果根部研磨破碎，梯度稀釋后涂在PDA 培養(yǎng)基中，統(tǒng)計(jì)定殖數(shù)量。

1.2.4 蘋果盆栽苗處理 將生根30～40天的蘋果苗移栽至蛭石與營(yíng)養(yǎng)土混合（體積比1∶1）的營(yíng)養(yǎng)缽中（7厘米×7 厘米），之后緩苗1周，選取大小一致的蘋果苗分為2組?？瞻讓?duì)照組（CK）用無(wú)菌水、處理組（T）用1×105CFU/毫升的棘孢木霉孢子懸浮液對(duì)蘋果苗進(jìn)行澆灌處理。

1.2.5 蘋果苗形態(tài)指標(biāo)測(cè)定 處理45天后，將生長(zhǎng)在苔蘚組培瓶中蘋果植株取出，去除附著在根系上的苔蘚，從根莖處剪斷，用純水清洗根系3～4遍，放入掃描盒后鋪平，使用SNAPSCAN310掃描儀掃描拍照，用Win RHIZO根系掃描儀對(duì)掃描后的圖像進(jìn)行分析。

處理60天后，每組隨機(jī)選取5棵蘋果幼苗，用米尺測(cè)定株高；取整株植物于電子天平稱鮮質(zhì)量。

1.2.6 蘋果苗光合參數(shù)及葉綠素含量測(cè)定 在09：00—11：00用 LI-6400光合測(cè)定儀測(cè)定植株功能葉的光合參數(shù)。葉綠素含量采用紫外分光光度法測(cè)定[12]。

1.2.7 蘋果苗抗氧化酶活性測(cè)定 在不同處理植株上取相同部位成熟葉片，每個(gè)處理3次重復(fù)，用純水洗干凈且吸干水分，將葉片剪碎，用電子天平稱0.1克葉片，加入1毫升磷酸緩沖液（pH 7.5），進(jìn)行冰浴勻漿。8000 g4 ℃離心10分鐘，取上清液，至冰上待測(cè)。

超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定：反應(yīng)混合物含有 100毫摩爾/升 磷酸鹽緩沖液（pH 7.8），75毫摩爾/升核黃素，2毫摩爾/升NBT，3毫摩爾/升 EDTA，200毫摩爾/升蛋氨酸和 50毫升酶提取物，在光照下在 25 ℃下開(kāi)始光還原反應(yīng) 15分鐘后再暗反應(yīng)一段時(shí)間，在560納米下測(cè)量SOD的活性。

過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定：2.5毫升總反應(yīng)混合物包含 100毫摩爾/升磷酸緩沖液 （pH 7）和 100微升20 毫摩爾/升H2O2。通過(guò)添加酶提取物開(kāi)始反應(yīng)，3 分鐘內(nèi)在 240納米下監(jiān)測(cè) H2O2 含量的減少。

過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定：取 2 只光徑 1厘米比色杯，1 只加入反應(yīng)物（100毫摩爾磷酸緩沖溶液50毫升，加入愈創(chuàng)木酚 28微升和 30%H2O219微升混合均勻）3毫升，磷酸氫鉀溶液 1毫升作為參比液；在另一只比色管中加入反應(yīng)混合物 3毫升，酶液提取物 1毫升，立即放入紫外分光光度計(jì)TU-1810 （北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）中，470納米下測(cè)定光密度值，用愈創(chuàng)木酚氧化引起吸收度的增加來(lái)測(cè)量酶活性。使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量蛋白質(zhì)濃度[13]。

丙二醛含量測(cè)定：將稱取剪碎的葉片0.1克，用5毫升10%TCA和少量石英砂研磨，10 000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取提取液2毫升（對(duì)照加2毫升蒸餾水），加入2毫升0.6%TBA溶液，混勻物于沸水浴上反應(yīng)15分鐘，迅速冷卻后3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清液于分光光度計(jì)450、532、600納米處測(cè)量吸光度值[13]，計(jì)算公式：丙二醛含量=6.54×（OD532-OD600）-0.56×OD450。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用 Excel 整理數(shù)據(jù)，進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算；用 Sigma Plot 10 軟件對(duì)數(shù)據(jù)繪圖，數(shù)據(jù)取平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3，3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種棘孢木霉對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響

經(jīng)棘孢木霉誘導(dǎo)后，蘋果組培苗的生長(zhǎng)受到了顯著影響。在接種初期，地上部和地下部的生長(zhǎng)保持一致。隨著時(shí)間的推移，特別是在接種后的第45天，地下部展現(xiàn)出了明顯的生長(zhǎng)促進(jìn)作用，而地上部的變化相對(duì)較?。ㄈ鐖D1-A所示）。對(duì)根部進(jìn)行進(jìn)一步掃描分析，結(jié)果顯示，幼苗的根表面積、根長(zhǎng)、根體積和投影面積均顯著提高，與對(duì)照相比，分別增加了60.54%、63.48%、57.73%和60.54%（如圖1-B所示）。這些差異極為顯著，表明蘋果苗與棘孢木霉之間存在一種有益的相互作用，這種作用有效地促進(jìn)了蘋果幼苗地上部和地下部的協(xié)同生長(zhǎng)。

2.2 接種棘孢木霉對(duì)組培苗根部定殖的影響

接種棘孢木霉后，其在組培苗根部的定殖情況如圖2所示。圖2-A為對(duì)照組，只有少量側(cè)根；圖2-B為試驗(yàn)組，經(jīng)棘孢木霉誘導(dǎo)后的蘋果幼苗根部被菌絲緊密纏繞；圖2-C顯示棘孢木霉在根部的定殖率為9×103CFU/克。

2.3 接種棘孢木霉對(duì)盆栽苗生長(zhǎng)的影響

經(jīng)過(guò)棘孢木霉的誘導(dǎo)處理后，蘋果苗株高呈現(xiàn)出了穩(wěn)定的增長(zhǎng)趨勢(shì)。在生長(zhǎng)初期的前30天內(nèi)，蘋果苗的生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢；但在接下來(lái)的30～50天階段，其生長(zhǎng)速度顯著提升，特別是在誘導(dǎo)后的第40天和第50天，蘋果苗的高度分別顯著增加了27.97%和32.86%。經(jīng)過(guò)為期60天的生長(zhǎng)后，試驗(yàn)組蘋果植株的高度均明顯高于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)棘孢木霉的誘導(dǎo)處理的試驗(yàn)組蘋果植株的鮮質(zhì)量增加了39.99%，進(jìn)一步證實(shí)了棘孢木霉對(duì)蘋果植株生長(zhǎng)的積極促進(jìn)作用（如圖3所示）。

2.4 接種棘孢木霉對(duì)盆栽苗光合參數(shù)的影響

經(jīng)過(guò)棘孢木霉的誘導(dǎo)后，蘋果葉片的光合參數(shù)呈現(xiàn)出顯著高于對(duì)照組的趨勢(shì)。其中，凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和蒸騰速率（Tr）分別比對(duì)照組提高了23.8%、28.2%和39.34%。而細(xì)胞間CO2濃度（Ci）比對(duì)照組降低了8.49%。另外，葉綠素含量比對(duì)照組增加了22.76%。這些結(jié)果表明，棘孢木霉對(duì)蘋果葉片的光合作用有著積極的促進(jìn)作用（圖4）。

2.5 接種棘孢木霉對(duì)盆栽苗抗氧化系統(tǒng)的影響

經(jīng)過(guò)棘孢木霉的誘導(dǎo)處理后，蘋果葉片中的過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性均顯著提高，同時(shí)丙二醛（MDA）含量則有所降低。與對(duì)照組相比，接種了棘孢木霉的蘋果幼苗POD、SOD和CAT的活性分別提高了1.96%、42.22%和12.58%，MDA含量降低了17.87%。綜合來(lái)看，棘孢木霉對(duì)蘋果葉片的酶活性產(chǎn)生了顯著影響（圖5）。

3 討 論

定殖是衡量微生物與植物互作的重要標(biāo)志[14]。當(dāng)微生物定殖于植物根際時(shí)，可以為植物提供水和氮、磷等礦物元素，而植物為微生物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、碳水化合物和有機(jī)酸等。研究表明，木霉菌在鹽脅迫下促進(jìn)了氮素的獲取和光合參數(shù)的改善，從而促進(jìn)了枸杞的生長(zhǎng)[15]；棘孢木霉M45a定殖于水稻根系組織，株高、地上部干質(zhì)量、根際土壤總氮含量和硝態(tài)氮含量顯著增加[16]。本研究中將棘孢木霉與蘋果組培苗共培養(yǎng)，定殖于根部并顯著促進(jìn)了植株生長(zhǎng)，說(shuō)明其與根系發(fā)生了有益的相互作用。

一系列研究表明，木霉定殖能顯著促進(jìn)植物光合作用。例如，當(dāng)植物的根部與木霉菌發(fā)生互作時(shí)，會(huì)導(dǎo)致基因和色素的上調(diào)，從而提高植物的光合作用效率[17]。Shoresh等[18-19]通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法深入研究了玉米與木霉之間的互作，他們發(fā)現(xiàn)，木霉可以上調(diào)參與碳水化合物代謝、光合作用和應(yīng)激過(guò)程相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)玉米植株的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果表明，棘孢木霉侵染根系后，顯著促進(jìn)蘋果光合作用、增加蘋果葉片葉綠素含量。這暗示著，棘孢木霉可能通過(guò)提高蘋果葉綠素含量，使葉片更有效地吸收光能，并將其轉(zhuǎn)化為碳水化合物，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。

本研究結(jié)果表明，菌株還影響了蘋果幼苗的其他代謝活性。菌株提高了過(guò)氧化氫酶（CAT）和過(guò)氧化物酶（POD）的活性，降低了丙二醛（MDA）含量。POD和SOD可以參與清除細(xì)胞中的活性氧、防止細(xì)胞過(guò)氧化，在保持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整、增強(qiáng)植物抗逆性、延緩植株衰老等方面具有重要作用[20]。MDA含量是膜脂質(zhì)過(guò)氧化的指標(biāo)，指示植物的衰老程度。本研究中POD、SOD活性增強(qiáng)和MDA含量降低，表明木霉能夠有效提高蘋果的防御酶活性，降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平，因此具有較大的生防潛力。

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