摘 要：明確當(dāng)陽(yáng)魚(yú)腥草花葉病致病菌種類，為當(dāng)陽(yáng)魚(yú)腥草花葉病的田間防治提供依據(jù)。采集魚(yú)腥草花葉葉片提取當(dāng)陽(yáng)魚(yú)腥草典型病樣的總RNA，利用sRNA深度測(cè)序，結(jié)合生物信息學(xué)分析初步確定病原菌，利用該病毒外殼蛋白（CP）特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，所得序列進(jìn)行BLAST比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，以進(jìn)一步確定病原菌種類。利用sRNA深度測(cè)序和生物信息學(xué)初步確定魚(yú)腥草花葉病致病菌為黃瓜花葉病毒（CMV），特異性引物擴(kuò)增得到878 bp特異性條帶，經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與已發(fā)表的CMV序列高度同源，相似性最高達(dá)97.84%。通過(guò)CMV病毒CP基因的核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可得魚(yú)腥草花葉病病毒屬于CMV 亞組II。引起魚(yú)腥草花葉病的病原屬于黃瓜花葉病毒II亞組，研究結(jié)果為魚(yú)腥草花葉病防治提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：魚(yú)腥草；黃瓜花葉病毒；sRNA深度測(cè)序；RT-PCR

中圖分類號(hào)：S649 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2024）09-054-05

Molecular identification of mosaic disease on Houttuynia cordata Thumb. in Dangyang

ZHOU Jie1， WU Fanghua2， YAN Fei3， QI Chuandong1， GUO Fengling1， WU Jinping1

（1. Institute of Economic Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Vegetable Ecological Cultivation on Highland， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Hubei Key Laboratory of Vegetable Germplasm Enhancement and Genetic Improvement， Wuhan 430064， Hubei， China; 2. Agricultural Service Center of Lianghe Town， Dangyang City， Yichang 444114， Hubei， China; 3. Institute of Plant Virology， Ningbo University， Ningbo 315211， Zhejiang， China）

Abstract： The identification of pathogenic bacteria species causing Houttuynia cordata mosaic disease in Dangyang will provide a theory basis for the field control of the disease. The mosaic leaves of Houttuynia cordata were collected to extract the total RNA of typical mosaic disease samples， and sRNA deep sequencing was conducted. Based on bioinformatics analysis， the pathogen was initially identified. Using the virus coat protein（CP）specific primers for RT-PCR detection， the obtained sequences were subjected to BLAST alignment and a phylogenetic tree construction to further identify the pathogen. Using sRNA deep sequencing and bioinformatics analysis， it was initially determined that the causative virus of Houttuynia cordata mosaic disease was cucumber mosaic virus（CMV）. Specific primers amplified a specific band of 878 bp， which was found to be highly homologous to published CMV sequences through BLAST alignment， with a similarity of 97.84%. By constructing a phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of CMV virus CP gene， it can be concluded that Houttuynia mosaic virus belongs to subgroup II of CMV. This result provides a theoretical basis for the prevention and treatment of Houttuynia cordata mosaic disease.

Key words： Houttuynia cordata; Cucumber mosaic virus; sRNA sequencing; RT-PCR

收稿日期：2023-12-28；修回日期：2024-04-17

基金項(xiàng)目：湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項(xiàng)目（2021-620-000-001-007）；國(guó)家特色蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-24-G-17）

作者簡(jiǎn)介：周 潔，女，助理研究員，主要從事特色蔬菜資源挖掘與利用工作。E-mail：384881257@qq.com

吳方華，男，正高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事魚(yú)腥草、大蒜等特色蔬菜栽培技術(shù)研究與應(yīng)用。E-mail：2683028688@qq.com

通信作者：郭鳳領(lǐng)，女，研究員，主要從事特色蔬菜資源挖掘與利用工作。E-mail：444769935@qq.com

吳金平，女，研究員，主要從事特色蔬菜資源挖掘與利用工作。E-mail：274184394@qq.com

魚(yú)腥草（Houttuynia cordata Thunb.）又名折耳根，是三白草科蕺菜屬多年生草本植物，其含有多酚、多糖、甾醇類和黃酮類化合物等[1]，具有清熱解毒等功效，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用植物[2]。隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)健康食品的追求也逐步提升，魚(yú)腥草作為一種健康蔬菜也隨之進(jìn)入市場(chǎng)，因此單靠采集野生魚(yú)腥草已不能滿足市場(chǎng)需求。據(jù)湖北宜昌當(dāng)陽(yáng)兩河鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心統(tǒng)計(jì)，當(dāng)陽(yáng)兩河鎮(zhèn)1998年開(kāi)始試種魚(yú)腥草，到2023年種植面積已超過(guò)1400 hm2，年產(chǎn)量8.8萬(wàn)t，全產(chǎn)業(yè)鏈產(chǎn)值達(dá)到18.88億元，是中國(guó)蔬菜流通協(xié)會(huì)授予的全國(guó)首個(gè)“中國(guó)魚(yú)腥草之鄉(xiāng)”。

目前，關(guān)于魚(yú)腥草藥用價(jià)值方面的研究較多。已有研究發(fā)現(xiàn)，其所含魚(yú)腥草素具有抗炎和抗病毒的功效[3]，黃酮類物質(zhì)具有祛痰止咳等功效[4]。此外，魚(yú)腥草提取液對(duì)南瓜白粉病也具有一定的防治效果[5]。關(guān)于魚(yú)腥草種植過(guò)程中的病害鑒定及防控多為白絹病、炭疽病等真菌病害的報(bào)道[6-7]。由于魚(yú)腥草利用根莖無(wú)性繁殖導(dǎo)致病害增多[8]，加上集約化種植，近年來(lái)魚(yú)腥草花葉病在當(dāng)陽(yáng)市兩河鎮(zhèn)呈現(xiàn)明顯的加重趨勢(shì)，據(jù)當(dāng)陽(yáng)市兩河鎮(zhèn)農(nóng)技推廣中心調(diào)查數(shù)據(jù)，2021年間嚴(yán)重的田塊發(fā)生率在70%以上，給當(dāng)?shù)佤~(yú)腥草種植業(yè)造成不良影響。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于魚(yú)腥草病毒病的研究較少，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所特色蔬菜課題組在對(duì)兩河鎮(zhèn)魚(yú)腥草種植基地調(diào)查的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，該病的田間癥狀主要表現(xiàn)為部分葉片深綠色斑駁，葉片變厚，葉脈深綠。筆者擬通過(guò)sRNA高通量測(cè)序和RT-PCR技術(shù)對(duì)當(dāng)陽(yáng)魚(yú)腥草花葉病病原進(jìn)行鑒定，明確該病害致病菌類型，以期為魚(yú)腥草田間病毒病的防控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2021年3－4月于當(dāng)陽(yáng)市兩河鎮(zhèn)魚(yú)腥草示范基地隨機(jī)采集具有典型花葉病癥的葉片9份和健康的魚(yú)腥草葉片1份，每份10片葉子，共累積10份樣品保存?zhèn)溆?，液氮速凍后置?80 ℃冰箱保存。

分子生物學(xué)試劑盒：總RNA提取利用RNA提取試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，USA），反轉(zhuǎn)錄利用全式金TransScript? Ⅱ One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒，DNA純化回收利用全式金瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 魚(yú)腥草總RNA的提取和測(cè)序 將準(zhǔn)備的葉片樣品（10份）分別在液氮中充分研磨，參照Trizol試劑RNA提取試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，USA）說(shuō)明書(shū)步驟提取各個(gè)樣品的總RNA，其中9份病樣總RNA由諾禾致源生物科技有限公司進(jìn)行sRNA深度測(cè)序，在Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)上以PE150 bp進(jìn)行高通量測(cè)序，采用CLC Genomic Workbench 11以默認(rèn)參數(shù)（QIAGEN，Hilden，Germany）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 魚(yú)腥草花葉病毒的RT-PCR檢測(cè) 根據(jù)深度測(cè)序后的比對(duì)結(jié)果設(shè)計(jì)引物，用于RT-PCR檢測(cè)和驗(yàn)證sRNA測(cè)序結(jié)果，以健康的魚(yú)腥草葉片作為陰性對(duì)照，選取1號(hào)魚(yú)腥草花葉病樣進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。以總RNA為模板，參照全式金TransScript? Ⅱ One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒操作說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，作為PCR擴(kuò)增的模板。PCR引物為黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）CP基因通用檢測(cè)引物（CMVCPuF 5'-TCTCATGGATG CTTCTCCGCG -3'，CMVCPuR 5'-CCGTAAGCTGGACAACC-3'）[9]。PCR反應(yīng)體系為10 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.2 μL，Green Tap Mix 5 μL，加ddH2O 3.6 μL。循環(huán)體系為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并參照全式金瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 利用MEGA 7.0軟件對(duì)擴(kuò)增得到的CMV CP基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用鄰接法（Neighbor-joining），分支置信度（bootstrap）設(shè)置為1000構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚(yú)腥草花葉病田間癥狀

當(dāng)陽(yáng)市兩河鎮(zhèn)魚(yú)腥草示范基地中魚(yú)腥草花葉病的癥狀主要表現(xiàn)為葉片褪綠黃化斑駁、葉脈黑褐色，主要集中在葉片邊緣，嚴(yán)重時(shí)擴(kuò)展至整片葉片，部分葉片厚度增加或呈現(xiàn)點(diǎn)狀或條狀壞死，部分葉片萎黃，整株沒(méi)有明顯矮化現(xiàn)象（圖1）。

2.2 魚(yú)腥草花葉病的sRNA深度測(cè)序

為鑒定魚(yú)腥草上可能存在的病原，選取表現(xiàn)典型癥狀的魚(yú)腥草植株進(jìn)行高通量測(cè)序，共得到總計(jì)32 126 252條原始數(shù)據(jù)（reads），采用Blastn或Blastx與GenBank登錄序列進(jìn)行比對(duì)分析，得到110 501條拼接序列（contigs），這些拼接序列的長(zhǎng)度范圍在15～18 773 bp，進(jìn)一步將這些序列與目前已登錄的所有病毒序列進(jìn)行比對(duì)，僅比對(duì)到3個(gè)病毒相關(guān)的拼接序列，長(zhǎng)度分別是3427、3282、2461 bp，經(jīng)Blastn序列比對(duì)分別匹配到黃瓜花葉病毒的RNA1（KX883818）、RNA2（KX883817）和RNA3（EU665002）。根據(jù)以上結(jié)果，初步判斷引起魚(yú)腥草花葉病的病毒為黃瓜花葉病毒。

2.3 魚(yú)腥草花葉病毒的RT-PCR檢測(cè)

為了驗(yàn)證sRNA測(cè)序分析的結(jié)果，利用特異性引物對(duì)CMV的CP基因序列進(jìn)行測(cè)序分析，以健康無(wú)病的魚(yú)腥草葉片為陰性對(duì)照，以CMV病毒為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示，1號(hào)魚(yú)腥草樣品中擴(kuò)增得到大小為878 bp的片段，陽(yáng)性對(duì)照也可得到該片段，而健康魚(yú)腥草葉片樣品中并未得到該目標(biāo)條帶（圖2）。

將所得序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列與報(bào)道的50個(gè)CMV分離物CP基因序列核苷酸序列相似性為96.71%～97.84%。其中與CMV杭州番茄分離物的核苷酸序列（GenBank登錄號(hào)：DQ249298.1）相似性最高，達(dá)到97.84%，說(shuō)明魚(yú)腥草花葉病樣品中分離得到的病毒為CMV病毒。將得到的魚(yú)腥草花葉病病毒命名為CMV-YXC，選取GenBank中具有代表性的CMV病毒CP基因的核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。結(jié)果顯示，魚(yú)腥草中分離的CMV病毒的CP基因序列與CMV II亞組的代表菌株日本西紅柿（GenBank登錄號(hào)：AB176847.1）及中國(guó)西紅柿分離物（GenBank登錄號(hào)：DQ249298.1）、韓國(guó)甘露子分離物（GenBank登錄號(hào)：LC487909.1）和中國(guó)萬(wàn)壽菊分離物（GenBank登錄號(hào)：EU665002.1）等分布在進(jìn)化樹(shù)同一分支。

3 討論與結(jié)論

當(dāng)陽(yáng)市兩河鎮(zhèn)是我國(guó)首個(gè)“魚(yú)腥草之鄉(xiāng)”，隨著魚(yú)腥草種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大，以根莖無(wú)性繁殖為主的魚(yú)腥草種植模式導(dǎo)致的種源帶菌問(wèn)題也日益凸顯，尤其是魚(yú)腥草花葉病的發(fā)生越來(lái)越嚴(yán)重，對(duì)魚(yú)腥草嫩莖葉的采收和地下莖的生長(zhǎng)均造成較大影響，給魚(yú)腥草產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展造成一定阻礙。

sRNA深度測(cè)序能夠在病毒濃度較低的情況下對(duì)植物組織中的病毒種類進(jìn)行鑒定，相比常規(guī)的病毒檢測(cè)方法，sRNA深度測(cè)序技術(shù)具有適用性強(qiáng)、靈敏度高和獲取信息豐富的特點(diǎn)[10]。筆者通過(guò)對(duì)兩河鎮(zhèn)魚(yú)腥草花葉病樣的采集，結(jié)合sRNA深度測(cè)序和RT-PCR檢測(cè)分析，結(jié)果表明當(dāng)陽(yáng)市魚(yú)腥草花葉病的病原為CMV病毒。

目前，黃瓜花葉病毒CMV是已知寄主最多、分布最廣、危害性最大的植物病毒之一，是雀麥花葉病毒科黃瓜花葉病毒屬的代表種，可侵染1000多種雙子葉植物和單子葉植物，是禾谷類作物、牧草、木本和草本觀賞植物、蔬菜及果樹(shù)上發(fā)生最廣、危害最大的病毒。在新疆喀什地區(qū)，該病毒和辣椒輕斑駁病毒PMMoV可復(fù)合侵染引起辣椒病毒病[11]，河南洛陽(yáng)地區(qū)辣椒、菜豆、花生和番茄上均發(fā)現(xiàn)了該病毒[12]。CMV病毒根據(jù)寄主類型、致病性和外殼蛋白序列等分為CMV I和CMV II亞組[13]，2個(gè)亞組在我國(guó)均已有報(bào)道，但CMV I發(fā)生概率遠(yuǎn)高于CMV II[12]，如首次在山西鵝絨藤上發(fā)現(xiàn)的花葉病病毒經(jīng)鑒定屬于CMV I中的成員[14]，在云南茉莉花上分離的CMV-YYJMLH屬于亞組I中的IB亞組，與CMV云南辣椒分離物親緣關(guān)系最近[15]。而此次引起魚(yú)腥草花葉病的黃瓜花葉病毒經(jīng)分析屬于CMV II，與中國(guó)和日本西紅柿上的分離物等親緣關(guān)系較近，并未鑒定得到CMV I。由此可見(jiàn)，目前當(dāng)陽(yáng)地區(qū)侵染魚(yú)腥草引起花葉病的病毒主要為黃瓜花葉病毒CMV II，由于CMV I的危害性和發(fā)生概率高于CMV II[16]，因此有必要繼續(xù)擴(kuò)大當(dāng)?shù)佤~(yú)腥草病毒病的檢測(cè)范圍和數(shù)量，做好當(dāng)陽(yáng)魚(yú)腥草示范基地的CMV監(jiān)測(cè)工作。

黃瓜花葉病毒在田間主要是通過(guò)蚜蟲(chóng)、種子及汁液傳播[17]，而魚(yú)腥草以根莖無(wú)性繁殖為主，生產(chǎn)中建議預(yù)防為主，使用防蟲(chóng)網(wǎng)，避免蚜蟲(chóng)傳毒；同時(shí)培養(yǎng)壯苗，適期定植；合理施用有機(jī)肥，采用配方施肥技巧，加強(qiáng)管理。在發(fā)病早期，噴灑24%混脂酸·銅水劑700～800倍液，或30%壬基酚磺酸銅水乳劑600倍液、2%寧南霉素水劑500倍液、0.5%菇類卵白多糖水劑300倍液，或1.5%植病靈Ⅱ號(hào)乳劑1000倍液、10%混雜脂肪酸銅水劑100倍液等。為保障魚(yú)腥草產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，在生產(chǎn)上加強(qiáng)對(duì)魚(yú)腥草蚜蟲(chóng)等蟲(chóng)害防控、減少田間農(nóng)事操作對(duì)植株的損傷，同時(shí)加強(qiáng)魚(yú)腥草種苗病毒檢測(cè)，做好抗病品種篩選鑒定，利用組織培養(yǎng)等技術(shù)進(jìn)行脫毒種苗生產(chǎn)相關(guān)研究，結(jié)合病毒防控和抗病無(wú)病種苗研發(fā)等多方面保障魚(yú)腥草產(chǎn)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展。

綜上所述，筆者的研究首次證實(shí)了魚(yú)腥草花葉病的病原屬于CMV 亞組II，同時(shí)有必要對(duì)該病的發(fā)生做好監(jiān)測(cè)工作，通過(guò)病毒防控和抗病種苗研發(fā)為魚(yú)腥草產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供技術(shù)保障。

參考文獻(xiàn)

[1] YANG L，JIANG J G．Bioactive components and functional properties of Hottuynia cordata and its applications[J]. Pharmaceutical Biology，2009，47（12）：1154-1161．

[2] 劉敏，蔣躍平，劉韶．魚(yú)腥草中生物堿類化學(xué)成分及其生物活性研究進(jìn)展[J]．天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2018，30（1）：141-145．

[3] 陸曉珊，林也，唐琳，等．魚(yú)腥草的化學(xué)成分與安全性研究進(jìn)展[J]．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2021，39（3）：144-147．

[4] 趙強(qiáng)，楊潔，趙三虎，等．魚(yú)腥草總黃酮提取及其藥理作用研究進(jìn)展[J]．分子植物育種，2019，17（23）：7918-7923．

[5] 李發(fā)康，李培，李興昱，等．5種中草藥提取液對(duì)裸仁美洲南瓜白粉病的防治效果[J]．中國(guó)蔬菜，2020（3）：56-60．

[6] 魏林，梁志懷，陳玉榮，等．Trichoderma harzianum TUV-13對(duì)魚(yú)腥草白絹病的防治及其促生長(zhǎng)作用[J]．中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2012，28（3）：381-386．

[7] 周潔，吳金平，王明安，等．魚(yú)腥草炭疽病病原鑒定及室內(nèi)藥劑篩選[J]．南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2022，53（10）：2919-2927．

[8] 呂茹婧，鄭露，黃俊斌．魚(yú)腥草葉斑病病原鑒定[C]//中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)．中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2009年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2009．

[9] LI Y Y，MA Y，MENG Y，et al．First report of chilli vein mottle virus infecting Solanum aethiopicum in China[J]．Plant Disease，2018，102（6）：1181．

[10] 謝慧婷，李戰(zhàn)彪，崔麗賢，等．廣西局地西番蓮病毒病的病原鑒定及優(yōu)勢(shì)病毒分析[J]．植物病理學(xué)報(bào)，2020，50（4）：387-393．

[11] 柴阿麗，陳利達(dá)，許帥，等．新疆喀什辣椒輕斑駁病毒和黃瓜花葉病毒復(fù)合侵染的分子鑒定[J]．華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2020，35（增刊1）：332-337．

[12] 李月月，王前進(jìn)，田珊，等．黃瓜花葉病毒在洛陽(yáng)地區(qū)的發(fā)生及亞組鑒定[J]．廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，47（7）：114-120．

[13] 陳玉珍，譚新球，朱春暉，等．我國(guó)部分地區(qū)常見(jiàn)農(nóng)作物上黃瓜花葉病毒分離物核酸多樣性分析[J]．植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2016，43（3）：427-433．

[14] 杜江，馬振男，王德富，等．基于小RNA深度測(cè)序和RT-PCR鑒定鵝絨藤花葉病的病毒病原[J/OL]．草業(yè)科學(xué)，1-13[2023-03-29]．http：//kns.cnki.net/kcms/detail/62.1069.s.20231109.1617.004．

[15] 張?zhí)煲?，余代宏，曹玉蓮，等．云南茉莉花病毒種類初步鑒定及CMV茉莉花分離物CP基因序列分析[J/OL]．植物病理學(xué)報(bào)，1-14[2024-01-08]．https：//doi.org/10.13926/j.cnki.apps.001343．

[16] 申莉莉，宋麗云，龔明月，等．煙草黃瓜花葉病毒亞組Ⅰ分離物生物學(xué)特性[J]．中國(guó)煙草科學(xué)，2021，42（6）：30-35．

[17] 王達(dá)新，郭剛，殷曉敏，等．黃瓜花葉病毒研究進(jìn)展[J]．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013（3）：121-123．