摘 要：旨在建立一種副結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis，MAP）精準快速的檢測方法，結(jié)合重組酶介導(dǎo)擴增（recombinase-aid amplification，RAA）和側(cè)向流試紙條（lateral flow dipstick，LFD）技術(shù)，以MAP的特異性多拷貝插入元件IS900設(shè)計引物和探針，通過優(yōu)化反應(yīng)時間和溫度等條件，建立可用于MAP現(xiàn)場可視化檢測的RAA-LFD方法。該檢測方法在35℃條件下恒溫反應(yīng)30min即可實現(xiàn)對MAP目的基因的有效擴增。試驗結(jié)果顯示：該方法可特異性地檢測出MAP，不與其他常見的病原發(fā)生交叉反應(yīng)；對MAP標準品的最低檢測限可達到10fg·μL^-1；使用該方法對149份牛奶樣品進行檢測，與傳統(tǒng)的PCR相比，其敏感性為100%。綜上，本研究成功建立了一種針對于MAP的精準快速的試紙條檢測方法，并具有廣泛的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：副結(jié)核分枝桿菌；重組酶介導(dǎo)擴增；側(cè)向流試紙條

中圖分類號：S852.618

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-3255-06

收稿日期：2023-10-07

基金項目：“十四五”重點研發(fā)計劃（2022YFD1800703）

作者簡介：南 岳（2000-），男，河南周口人，碩士，主要從事牛結(jié)核病防治研究，E-mail：2965008308@qq.com；龍美貞（1998-），女，土家族，重慶酉陽人，碩士，主要從事牛結(jié)核病防治研究，E-mail：1727293215@qq.com。南岳和龍美貞為同等貢獻作者

*通信作者：周向梅，主要從事牛結(jié)核病防治研究，E-mail：zhouxm@cau.edu.cn

Establishment and Preliminary Application of Recombinase-mediated Amplification-

sidestream Detection for Detection of Mycobacterium paratuberculosis

NANYue，LONGMeizhen，WANGYuanzhi，LIUYiduo，ZHOUXiangmei^*

（National Key Laboratory of Veterinary Public Health and Safety，College of

Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing100193，China）

Abstract：To establish arapid and accurate method for detection of Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis（MAP），primers and probes were designed according to the specific multicopy insert element IS900of MAP.A recombinase-aid amplification combined with lateral flow dipstick（RAA-LFD）method was established for visual detection of MAP in the field within30min at35℃after being optimized.The assay was specific with the target sequence of MAP with adetection limit up to10fg·μL^-1.One hundred and forty-nine stool samples were tested by this method，showing100%sensitivity with the PCR.In short，the RAA-LFD assay developed in this study was arapid，reliable method which can be broadly used.

Key words：Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis; recombinase-aid amplification; lateral flow dipstick

*Corresponding author：ZHOU Xiangmei，E-mail：zhouxm@cau.edu.cn

副結(jié)核?。≒aratuberculosis）是由鳥分枝桿菌種副結(jié)核亞種的副結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis，MAP）引起的反芻動物消耗性疾病，表現(xiàn)為慢性增生性腸炎^[1]。MAP呈革蘭染色陽性，抗酸染色陽性，細胞壁較厚^[2]。這種保護性細胞壁和聚團生長的特性使MAP具有較強的環(huán)境抵抗力^[3]。MAP主要通過糞-口途徑傳播，經(jīng)消化道感染同群或其它健康動物，除此之外，也可經(jīng)母乳傳播^[4-6]。

該病被認為是為對奶牛行業(yè)產(chǎn)生危害最嚴重的疾病之一。我國于1953年在內(nèi)蒙古自治區(qū)的呼萌謝爾塔拉牧場首次報道，之后該病逐漸開始在我國大范圍傳播^[7]。然而，其檢測手段尚不完善，主要是基于MAP病原學(xué)和宿主對病原的免疫反應(yīng)進行檢測，在大多數(shù)國家對牛、羊等易感動物的控制程序中，最常見的診斷方法是血清ELISA、糞便PCR或病原培養(yǎng)和病理學(xué)觀察。糞便培養(yǎng)被廣泛認為是診斷副結(jié)核病的金標準，但對于處于感染早期的動物，該方法檢出率較低^[8]。我國在2011年發(fā)布了《副結(jié)核分枝桿菌實時熒光PCR檢測方法》（GB/T27637—2011），但操作較為復(fù)雜，對樣品要求較高。目前，主流的檢測方法都有一定缺點，且不適用于獸醫(yī)臨床基層，這阻礙了副結(jié)核病的凈化。因此，開發(fā)適用于臨床的檢測方法對副結(jié)核病的凈化具有重要意義。

近年來，重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴增（recombinase aided amplification，RAA）技術(shù)逐漸被應(yīng)用到病原檢測的研究中，該技術(shù)主要利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶代替?zhèn)鹘y(tǒng)PCR的熱循環(huán)解鏈過程，不需要依賴熱循環(huán)設(shè)備，37℃左右擴增20～30min即可^[9]。本試驗將RAA技術(shù)與側(cè)向流試紙條（lateral flow dipstick，LFD）結(jié)合^[10]，開發(fā)出針對MAP的快速檢測方法，無需復(fù)雜的實驗室儀器，可滿足牛場對MAP快速、現(xiàn)場化的檢測需求。

1 材料與方法

1.1 菌株和樣品

副結(jié)核分枝桿菌標準株MAP K-10、大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）、牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis，M.bovis）、志賀菌（Shigella Castellani）、沙門菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）均來源于國家傳染性海綿狀腦病實驗室。待檢牛奶樣品來源于北京某牛場。

1.2 主要儀器和試劑

7H9培養(yǎng)基（美國BD Biosciences公司）；7H10培養(yǎng)基（美國BD Biosciences公司）；OADC Enrichment（美國BD Biosciences公司）；柱式分枝桿菌DNA提取試劑盒（北京百奧萊博科技公司）；RAA-basic檢測試劑盒（杭州眾測生物科技有限公司）；RAA-nfo核酸擴增試劑（試紙條型）（杭州眾測生物科技有限公司）；一次性核酸檢測試紙條（杭州優(yōu)思達生物技術(shù)公司）。

1.3 MAP的培養(yǎng)及基因組的提取

以MAP標準株的全基因組作為標準品進行試驗。將實驗室保存的MAP標準株K-10均勻涂布于7H10固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)2～3周至長出單菌落。將單菌落接種于7H9液體培養(yǎng)基中，37℃180r·min^-1震蕩培養(yǎng)，至對數(shù)期（OD_600nm為0.6～0.8）。參照DNA提取試劑盒說明書（北京百奧萊博科技公司）提取MAP的全基因組DNA，于-80℃儲存。

1.4 引物設(shè)計

對GenBank上MAP的IS900基因序列進行對比分析，以確定該基因的保守區(qū)域。根據(jù)RAA技術(shù)的引物設(shè)計原則（具體見RAA-basic-檢測試劑盒說明書），利用DNAMAN軟件設(shè)計RAA引物，同時，在下游引物5′端用生物素（抗原標記物）標記。

根據(jù)引物對設(shè)計探針（Probe），探針長度在46～52nt，5′端用FAM基團（抗原標記物）標記，內(nèi)部含有‘dSpacer’（堿基核苷酸類似物四氫呋喃殘基，有時稱為THF-）；3′端有C3-spacer（聚合酶延伸阻斷基團）。引物及探針由金唯智生物科技公司合成（序列見表1）。

1.5 反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

按照眾測生物RAA-basic檢測試劑盒說明書配制擴增體系：反應(yīng)干粉1管，25μL ABuffer，1.5μL濃度為2μmol·L^-1的上、下游引物，0.5μL濃度為2μmol·L^-1的探針，5μL DNA樣品或待檢樣品，用無核酸酶水補至47.5μL。B Buffer需要添加至反應(yīng)試管蓋上，反應(yīng)開始前蓋上管蓋，上下顛倒數(shù)次，充分混勻后低速離心10s（一定要混合均勻）；此后馬上移至水浴鍋中。首先優(yōu)化反應(yīng)溫度，將反應(yīng)時間控制在30min，設(shè)置反應(yīng)溫度為39、35、30、25、20、15℃，同時設(shè)置以無核酸酶水為DNA模板的陰性對照，反應(yīng)結(jié)束后，利用通用型核酸試紙條進行檢測。其次優(yōu)化反應(yīng)時間，以最佳反應(yīng)溫度孵育，設(shè)置反應(yīng)時間為35、30、25、20、15min，同時設(shè)置以無核酸酶水為DNA模板的陰性對照，反應(yīng)結(jié)束后，利用通用型核酸試紙條進行檢測。

1.6 特異性試驗

使用本研究建立的MAP IS900RAA-LFD方法分別對MAP、E.coli、M.bovis、Shigella Castellani、Salmonella、S.aureus核酸進行檢測，設(shè)置MAP標準株全基因組作為陽性對照，無核酸酶水為陰性對照。

1.7 敏感性試驗

用無核酸酶水10倍倍比稀釋“1.3”中構(gòu)建的標準品，控制DNA濃度為1ng·μL^-1～1fg·μL^-1，取1μL為模板，同時設(shè)置無核酸酶水為陰性對照，在最佳反應(yīng)條件下進行RAA-LFD反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，利用通用型核酸試紙條進行檢測，以確定該方法的靈敏性。

1.8 臨床樣品檢測

采用本試驗建立的RAA-LFD方法對臨床收集的牛奶（149份）樣品進行檢測，并將檢測結(jié)果與PCR檢測結(jié)果進行對比。

2 結(jié) 果

2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

首先，設(shè)置反應(yīng)時間為30min，設(shè)置反應(yīng)溫度為39、35、30、25、20、15℃，以無核酸酶水為DNA模板的陰性對照，結(jié)果顯示，當溫度為35℃時，檢測線最明顯，擴增效果最好。

隨后，將反應(yīng)溫度控制在35℃，設(shè)置反應(yīng)時間為35、30、25、20、15min，以無核酸酶水為DNA模板的陰性對照，結(jié)果顯示，當反應(yīng)時間為30min時，擴增效果最好。因此，設(shè)置35℃恒溫擴增30min為后續(xù)試驗最佳反應(yīng)條件。

2.2 特異性試驗

使用本研究建立的檢測方法分別對MAP、E.coli、M.bovis、Shigella Castellani、Salmonella、S.aureus進行檢測，以MAP標準株K-10全基因組為陽性對照、無核酸酶水為陰性對照進行參考。結(jié)果（圖1）顯示，只有MAP擴增產(chǎn)物的試紙條才會在檢測區(qū)域出現(xiàn)條帶，其他均為陰性，說明本方法具有較強的特異性。

2.3 靈敏度試驗

使用“1.3”中構(gòu)建的標準品進行10倍的梯度稀釋，選取1ng·μL^-1～1fg·μL^-1共6個濃度各1μL為模板，在最佳反應(yīng)條件下進行RAA-LFD反應(yīng)。結(jié)果顯示，該方法的靈敏度10fg·μL^-1（圖2）。

2.4 臨床樣品檢測

在149份牛奶樣品中，PCR檢測MAP陽性33份，陰性116份；RAA-LFD法檢測MAP陽性55份，陰性94份（表2），兩種方法的檢測結(jié)果符合率=（33+94）/149×100%=85.23%。

3 討 論

1894年，德國科學(xué)家Johne和Frothinghaw首次在牛中發(fā)現(xiàn)副結(jié)核病，因此該病也稱約翰氏?。↗ohne’s disease，JD）^[11]。當前我國副結(jié)核病流行情況形勢嚴峻，如何有效的對MAP進行檢測是凈化副結(jié)核病的關(guān)鍵一步。目前對MAP的檢測局限于細菌學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測，不論是靈敏度還是準確性都還有巨大的提升空間。

本研究以IS900為靶向基因，建立了一種RAA-LFD檢測方法，可在20～30min完成對MAP的快速檢測。IS900是副結(jié)核分枝桿菌的特異性多拷貝插入元件，與其他IS元件相比IS900的拷貝數(shù)更高，使得基于IS900的檢測更加敏感，研究認為IS900是各種基于PCR的分子檢測中特異性最強、靈敏度較高的序列^[12]，目前，已被用于開發(fā)PCR^[13]、RT-qPCR^[14]和LAMP^[15]等。近年來，包括RAA方法在內(nèi)的等溫擴增技術(shù)的發(fā)展使得分子診斷更加可靠和簡單，與PCR等其他檢測方法相比，RAA方法具有反應(yīng)程序簡單、反應(yīng)時間短、不需要特殊儀器等優(yōu)點，將RAA與LFD結(jié)合，使檢測結(jié)果可視化，簡化了檢測過程，可直接在現(xiàn)場進行檢測。許多學(xué)者將其用于開發(fā)副結(jié)核病診斷，Hansen等^[16]建立了RPA方法，Punati等^[15]開發(fā)了LAMP-LFD方法。此類簡單、快速的實時檢測方法也將逐步進入牛副結(jié)核病的臨床應(yīng)用中。RAA的引物設(shè)計與RT-qPCR和普通PCR有所區(qū)別，且目前尚無專業(yè)的引物設(shè)計軟件，所以設(shè)計引物是建立RAA檢測方法的第一步，設(shè)計好的引物還需要檢測其可行性。同時在試驗過程中也有一些需要注意的問題，比如RAA-LFD十分靈敏，所以極其容易出現(xiàn)污染現(xiàn)象，因此操作人員在進行試驗時需要格外注意避免環(huán)境污染；在水浴鍋進行擴增時，要注意體系與水的接觸，確保反應(yīng)體系受熱均勻；蓋緊試管蓋子防止反應(yīng)體系暴露在水中等。

對反應(yīng)條件進行優(yōu)化后，該方法顯示出良好的檢測性能。一方面，該方法與致病性大腸桿菌、牛分枝桿菌、志賀菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌等常見病原不產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異性良好。另一方面，RAA-LFD方法對副結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的靈敏度為10fg·μL^-1，比傳統(tǒng)PCR方法靈敏。

用PCR法和RAA-LFD法對149份牛奶樣品進行檢測。PCR檢測MAP陽性33份，陰性116份；RAA-LFD法檢測MAP陽性55份，陰性94份。這些觀察結(jié)果表明，與PCR相比，RAA-LFD法的臨床敏感性為100%。PCR陽性結(jié)果低可能是由于牛奶中存在一些未知的因素^[17]，如蛋白酶等，但這些因素可能不會影響RAA檢測。另外，由于RAA-LFD方法具有非常高的靈敏性，易受到氣溶膠的影響而產(chǎn)生假陽性結(jié)果，而牛場的環(huán)境比實驗室更容易產(chǎn)生氣溶膠污染，因此，在牛場使用RAA-LFD檢測牛副結(jié)核時，要特別注意避免氣溶膠的產(chǎn)生。該方法可用于牛場副結(jié)核的初篩，結(jié)合其它方法如血清學(xué)及病原學(xué)檢測可進一步確診。

4 結(jié) 論

本研究建立了檢測副結(jié)核分枝桿菌的RAA-LFD方法，試驗結(jié)果表明這是一種簡單、快速、易于進行的實時檢測方法，可在資源有限、儀器設(shè)備簡陋的基層或牧場檢測牛MAP，用于即時診斷，為副結(jié)核病的防治提供重要技術(shù)支撐。

參考文獻（References）：

[1]KIRKEBY C，GRSBLL K，NIELSEN SS，et al.Epidemiological and economic consequences of purchasing livestock infected with Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis[J].BMC Vet Res，2017，13（1）：202.

[2]RATHNAIAH G，ZINNIEL DK，BANNANTINE JP，et al.Pathogenesis，molecular genetics，and genomics of Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis，the etiologic agent of Johne’s disease[J].Front Vet Sci，2017，4：187.

[3]LORENCOVA A，BABAK V，KRALOVA A，et al.Survival of Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis in raw fermented sausages during production and storage[J].Meat Sci，2019，155：20-26.

[4]EISENBERG SW F，NIELEN M，KOETS AP.Within-farm transmission of bovine paratuberculosis：recent developments[J].Vet Quart，2012，32（1）：31-35.

[5]WHITTINGTON RJ，WINDSOR PA.In utero infection of cattle with Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis：a critical review and meta-analysis[J].Vet J，2009，179（1）：60-69.

[6]EPPLESTON J，WHITTINGTON RJ.Isolation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis from the semen of rams with clinical Johne’s disease[J].Aust Vet J，2001，79（11）：776-777.

[7]徐 剛，蔣曙光，王 蒴，等.牛副結(jié)核及其防治[J].草食家畜，2014（4）：53-56.

XU G，JIANG SG，WANG S，et al.Bovine paratuberculosis and prevention[J].Grass-Feeding Livestock，2014（4）：53-56.（in Chinese）

[8]NIELSEN SS，TOFT N.Ante mortem diagnosis of paratuberculosis：a review of accuracies of ELISA，interferon-γ assay and faecal culture techniques[J].Vet Microbiol，2008，129（3-4）：217-235.

[9]呂 蓓，程海榮，嚴慶豐，等.用重組酶介導(dǎo)擴增技術(shù)快速擴增核酸[J].中國科學(xué)：生命科學(xué)，2010，40（10）：983-988.

LV B，CHENG HR，YAN QF，et al.Recombinase-aid amplification：a novel technology of in vitro rapid nucleic acid amplification[J].Scientia Sinica Vitae，2010，40（10）：983-988.（in Chinese）

[10]廣 敏，靳洪振，彭康堯，等.聯(lián)合環(huán)介導(dǎo)等溫擴增和橫向流動試紙條可視化檢測副豬嗜血桿菌[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2023，28（1）：180-189.

GUANG M，JIN HZ，PENG KY，et al.Combined loop-mediated isothermal amplification and transverse flow test paper for visual detection of Haemophilus parasuis[J].Journal of China Agricultural University，2023，28（1）：180-189.（in Chinese）

[11]HOSTETTER J，KAGAN R，STEADHAM E.Opsonization effects on Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis--macrophage interactions[J].Clin Diagn Lab Immunol，2005，12（6）：793-796.

[12]SEMRET M，TURENNE CY，BEHR MA.Insertion sequence IS900revisited[J].J Clin Microbiol，2006，44（3）：1081-1083.

[13]PILLAI SR，JAYARAO BM.Application of IS900PCR for detection of Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis directly from raw milk[J].J Dairy Sci，2002，85（5）：1052-1057.

[14]PACHOORI A，GURURAJ K，SACHAN S，et al.Multiplex qPCR for differentiation of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in active and passive infection of goats[J].Appl Microbiol Biotechnol，2022，106（12）：4705-4717.

[15]PUNATI RD，MALLEPADDI PC，POONATI R，et al.Development and evaluation of LAMP-coupled lateral flow device for the detection of MAP in livestock at point of care resource-limited areas[J].Braz JMicrobiol，2019，50（4）：1105-1114.

[16]HANSEN S，SCH?FER J，F(xiàn)ECHNER K，et al.Development of arecombinase polymerase amplification assay for rapid detection of the Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis[J].PLoS One，2016，11（12）：e0168733.

[17]THORNTON CG，PASSEN S.Inhibition of PCR amplification by phytic acid，and treatment of bovine fecal specimens with phytase to reduce inhibition[J].J Microbiol Methods，2004，59（1）：43-52.

（編輯 白永平）