摘 要 為明確雪茄煙與不同作物輪作對根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和功能的影響，利用Mi-Seq高通量測序技術(shù)分析雪茄煙-雪茄煙連作（C1）、雪茄煙-萬壽菊輪作（C2）、雪茄煙-玉米輪作（C3）和雪茄煙-水稻輪作（C4）處理的根際土壤真菌群落組成和功能特征。結(jié)果表明：1）不同輪作作物根際土壤真菌群落的物種數(shù)目不同，輪作水稻處理的真菌物種數(shù)目最多（603個），輪作玉米的真菌物種數(shù)目最少（509個）；2）不同作物輪作對根際土壤真菌分布有重要的影響，與連作相比，輪作萬壽菊或水稻增加了根際土壤真菌群落的多樣性和豐富度，但輪作玉米降低了真菌群落的豐富度；3）在門水平上，不同輪作處理對根際土壤真菌優(yōu)勢菌群的組成影響不大，但對優(yōu)勢菌的相對豐度影響較大；4）屬水平上，輪作處理的鐮刀菌屬（Fusarium）、亡革菌屬（Thanatephorus）、枝孢屬（Cladosporium）、被孢霉屬（Mortierella）的相對豐度較連作增加；5）輪作模式影響根際土壤真菌的組成、多樣性及功能。因此，在雪茄煙栽培中應(yīng)結(jié)合當(dāng)?shù)貙嶋H情況選擇適宜的輪作模式，從而提高耕地資源利用率及雪茄煙的優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)水平。

關(guān)鍵詞 雪茄煙；輪作；根際土壤；真菌；群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S572 文獻標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.15.003

雪茄煙（Cigar）是一種晾制煙，具有香氣濃郁、吃味濃、勁頭大等煙質(zhì)特性[1]。世界優(yōu)質(zhì)的雪茄煙葉主要產(chǎn)自巴西、古巴、多米尼加和印度尼西亞等國家[2]。數(shù)據(jù)顯示，中國式卷煙生產(chǎn)及銷量均略有下降，但中國雪茄煙的產(chǎn)量、銷量及銷售額均顯著增長，雪茄煙產(chǎn)業(yè)已成為我國煙草行業(yè)新的經(jīng)濟增長點[3]。但目前我國生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雪茄煙葉的技術(shù)水平不高，中高端雪茄煙原料絕大部分以進口為主，嚴重影響中式雪茄產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟的快速增長[4]。雪茄煙葉的生產(chǎn)對土壤、氣候等環(huán)境因素的要求較高，微生物在土壤生態(tài)修復(fù)及可持續(xù)利用中發(fā)揮著不可代替的作用[5]。因此，研究不同輪作模式對土壤微生物群落的影響，對推動中式雪茄煙產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

植物的健康生長受植物與微生物相互作用的影響[6]。在土壤微生物群落中，真菌是主要成員之一，有益真菌可以促進植物生長、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性或抑制病原菌的生長，有害真菌則侵染植物，阻礙植物健康生長[7-9]。

作物輪作是指在同一塊地里輪流種植不同類型的作物。輪作可以增強土壤微生物活性，增加有益微生物，減少有害微生物，修復(fù)土壤生態(tài)環(huán)境[10]。例如，煙-蒜輪作改善了土壤微生態(tài)環(huán)境，富集了有益微生物，減少了病原微生物[11]。輪作增加了作物多樣性，對土壤微生物有積極的影響，也使微生物群落因作物殘留物的差異而不同。然而，種植方式對雪茄煙根際土壤微生態(tài)的影響尚未得到詳細研究，尤其是連作后雪茄煙根際土壤微生物動態(tài)變化，這種認識的缺乏影響雪茄煙種植業(yè)的發(fā)展。本研究利用高通量Illumina MiSeq測序分析不同種植方式下雪茄煙根際土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)，為克服雪茄煙連作障礙提供新的依據(jù)，促進雪茄煙種植業(yè)的發(fā)展。

1 "材料與方法

1.1 "試驗地點

采樣點位于云南保山潞江壩（北緯24.94°，東經(jīng)98.87°）。地處云南怒江大峽谷、高黎貢山東側(cè)山腳，距離保山市區(qū)67 km。潞江壩地區(qū)氣候?qū)儆趤啛釒釒Ц蔁岷庸葰夂?，海?40～3 510 m，海拔高，日照時間長，晝夜溫差大，全年無霜凍。選擇連續(xù)種植了3年（每年種植2茬）雪茄煙的地塊，開展不同栽培方式的比較試驗。

1.2 "試驗設(shè)置及采樣

在連續(xù)3年種植雪茄煙（云雪39號）的地塊中，設(shè)置4個輪作處理（見表1）：連續(xù)種植雪茄煙-雪茄煙（C1）、雪茄煙-萬壽菊輪作（C2）、雪茄煙-玉米輪作（C3）和雪茄煙-水稻輪作（C4）。每個處理重復(fù)3次，共12個小區(qū)，小區(qū)面積20 m×5 m=100 m2，用深2 m的混凝土隔開四周。各作物種植密度：雪茄煙25 950株·hm-2、萬壽菊44 440株·hm-2、玉米25 950株·hm-2、水稻83 325株·hm-2。各小區(qū)的田間管理措施一致。

土樣采集于2022年9月2號上午進行，按照五點取樣法采樣。隨機選取長勢一致的植株，連同根系一起取出，除去較大的土塊，用無菌長毛刷采集植株根系的泥土，收集完畢后，將5個取樣點的泥土混勻，成為對應(yīng)取樣點的一個土樣品副本（約1 kg），然后放入無菌敷料自封箱中，每個處理取3個重復(fù)，合計12個土壤混合樣品，并作為土壤待測標(biāo)本。將所采集的土壤樣品置于-80 ℃冰箱保存，后續(xù)進行高通量測序分析。

1.3 "DNA提取、PCR擴增和Illumina MiSeq測序

使用Fast DNA SPIN KIT For Soil （MP Biomedicals， LLC）試劑盒進行基因組DNA提取，具體步驟按試劑盒說明書操作。DNA質(zhì)量檢測采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，如果條帶清晰、完整，可以直接在后續(xù)測試中使用。

PCR反應(yīng)體系50 μL：2 μL模板DNA、2 μL正向引物（10 μmol L-1）、2 μL反向引物（10 μmol L-1）、4 μL dNTPs （2.5 μmol L-1）、5 μL 10×Pyrobest緩沖液、0.3 μL Pyrobest DNA聚合酶（2.5 μL-1）和34.7 μL ddH2O。引物用ITS F：（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和R：（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）[12]。

根據(jù)Illumina的基因組DNA文庫制備程序，將采集的DNA產(chǎn)物用于構(gòu)建Illumina配對的末端文庫。然后按照標(biāo)準(zhǔn)方案在Illumina MiQ平臺（北京擎科生物有限公司）上對擴增子文庫進行配對末端測序。

1.4 "測序數(shù)據(jù)的處理和分析

對原始測序序列進行優(yōu)化，獲得有效序列，并對有效序列進行聚類/去噪，劃分OTUs/ASVs（后面統(tǒng)一稱之為Feature），并按照Feature的序列組成得到它的物種分類；基于Feature特征的分類分析，并結(jié)合Alpha多樣性分析根際土壤真菌物種多樣性，Excel軟件統(tǒng)計Ace、Chao1、Shannon及Simpson指數(shù)，利用SPSS軟件進行單因素方差分析[13]。

2 "結(jié)果與分析

2.1 "高通量測序數(shù)據(jù)分析

不同作物輪作的12個根基土壤樣品，共測得原始序列959 658條，經(jīng)過濾和雙端拼接得到有效序列803 001條，平均有效序列66 916條。所有序列都在相似度97%的水平下進行OTU分類，獲得的OTU總數(shù)為6 513個，平均每個樣本的OTU數(shù)量為542個。

2.2 "Alpha多樣性分析

由表2可見，使用Mi-Seq平臺對收集的樣品進行高通量測序，所有樣品覆蓋率（Coverage）數(shù)值均為1，說明物種被檢測出來的概率為100%，能夠真實反映樣品情況。根際土壤真菌群落α多樣性分析結(jié)果顯示：與連作相比，輪作萬壽菊顯著增加了土壤真菌群落的豐富度和多樣性；輪作玉米增加了土壤真菌群落的多樣性，減少了真菌群落的豐富度，但差異不顯著；輪作水稻顯著增加了土壤真菌群落的多樣性，豐富度也增加但不顯著。說明，輪作萬壽菊或水稻能夠增加根際土壤真菌群落的多樣性和豐富度，且輪作不同作物對根際土壤真菌群落的影響程度也不同。

2.3 "不同輪作模式的根際土壤真菌物種組成分析

由圖1可知，不同輪作處理下被鑒定出的真菌數(shù)目有差異。輪作水稻的包含603種，輪作玉米包含509種，輪作萬壽菊包含538種，雪茄煙連作包含521種種；4種輪作模式共有的有16種，分別占C1、C2、C3、C4處理的3.07%、2.97%、3.14%、2.65%；C1、C2、C3、C4處理各自特有的種分別為408、405、363、483種，占對應(yīng)處理的78.31%、75.28%、71.32%、80.01%。與連作相比，輪作水稻和萬壽菊顯著增加了根際土壤的真菌數(shù)目，且輪作水稻處理特有的真菌數(shù)最多；輪作玉米則減少了根際土壤的真菌數(shù)目，且特有的真菌數(shù)最少。表明，輪作水稻或萬壽菊能夠增加根際土壤真菌群落的豐富度。

2.3.1 "門水平上優(yōu)勢菌

在門水平上（圖2a，見封三），雪茄煙連作處理的優(yōu)勢菌為子囊菌門（Ascomycota，31.76%），其次是壺菌門（Chytridiomycota，28.15%）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota，9.18%）；輪作萬壽菊的優(yōu)勢菌種有子囊菌門（Ascomycota，47.00%）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota，23.08%）、壺菌門（Chytridiomycota，5.83%）；輪作玉米的優(yōu)勢菌種有子囊菌門（Ascomycota，57.40%）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota，13.16%）、球囊菌門（Glomeromycota，11.95%）；輪作水稻的優(yōu)勢菌種有子囊菌門（Ascomycota，63.01%）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota，14.12%）、霉菌門（Mortierellomycota，6.04%）。綜上，不同輪作模式對根際土壤真菌優(yōu)勢菌群的組成影響不大，但對優(yōu)勢菌群的相對豐度影響較大。

2.3.2 "屬水平上的優(yōu)勢菌

在屬水平上（圖2b，見封三），雪茄煙連作處理的優(yōu)勢屬為鐮刀菌屬（Fusarium，3.56%）；輪作萬壽菊處理的優(yōu)勢屬為鐮刀菌屬（Fusarium，12.97%）、亡革菌屬（Thanatephorus，8.66%）；輪作玉米處理的優(yōu)勢屬為枝孢屬（Cladosporium，23.3%）、鐮刀菌屬（Fusarium，6.12%）；輪作水稻處理的優(yōu)勢屬為枝孢屬（Cladosporium，20.49%）。與連作相比，輪作處理增加了枝孢屬（Cladosporium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、亡革菌屬（Thanatephorus）、被孢霉屬（Mortierella）、Ramicandelaber的相對豐度，減少了unidentified、未定義真菌（unclassified_Fungi）和Others的相對豐度。

2.4 "物種組成差異分析

對4種輪作模式下土壤真菌群落結(jié)構(gòu)相似性進行聚類分析，結(jié)果顯示，真菌群落聚為3組（圖3，見封三）。C1、C2單獨各成一個分支，C3與C4模式真菌群落聚集在同一個分支上。表明，輪作玉米或水稻對根際土壤真菌群落的影響效果相似，輪作萬壽菊、雪茄煙連作對根際土壤真菌群落的影響效果相似。

進一步分析輪作模式下根際土壤真菌在屬水平上的差異，對相對豐度排前11位的真菌屬進行單因素方差分析（圖4，見封三）。發(fā)現(xiàn)被孢霉屬（Mortierella）、亡革菌屬（Thanatephorus）、枝孢屬（Cladosporium）在不同種植模式下有顯著差異；C1處理的unclassified_Fungi與其他處理有顯著差異；C2處理的鐮刀菌屬（Fusarium）、Ramicandelaber與其他處理有顯著差異；C4處理的unclassified_Ascomycota、unclassified_Basidiomycota與其他處理有顯著差異。

2.5 "環(huán)境功能預(yù)測

借助FUNGuild進行功能預(yù)測分析（圖5，見封三），發(fā)現(xiàn)不同種植模式下根際土壤真菌具有多種功能。輪作處理的動物內(nèi)生菌-動物病原體-未定義腐生真菌（Animal Endosyinions-Animal Pathogen-Undeincd Saproeruph）、動物內(nèi)生菌-動物病原體-內(nèi)生菌-植物病原菌-未定義腐生真菌（Animal Endosyhiore-Animal pathages-Endophyte-Plant Pathogen-Undeincd Saproeruph）和內(nèi)生菌-地衣菌寄生菌-植物病原菌-未定義腐生真菌（Endophyte-Lichen Parasite-Plant Pathogen-Undefined Saprotroph）的相對豐度較連作顯著降低，且輪作萬壽菊或水稻處理效果最明顯；輪作處理的叢枝菌根（Arbuscular Mycorrhizal）相對豐度較連作顯著增加，且輪作玉米處理效果最明顯。

3 "結(jié)論與討論

根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)受多種因素的影響，如作物種類、栽培管理措施和土壤環(huán)境因子[14]。本研究中，與雪茄煙連續(xù)單一種植相比，輪作萬壽菊或水稻能夠增加根際土壤真菌群落的多樣性和豐富度，尤其是輪作水稻。研究表明，根際土壤真菌的多樣性和豐富度與生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定呈正相關(guān)[15]。本試驗中，水-旱輪作（雪茄煙-水稻）的根際土壤中真菌群落豐富度指數(shù)顯著高于旱-旱輪作（雪茄煙-雪茄煙、雪茄煙-萬壽菊、雪茄煙-玉米）模式，這與張新成等的研究結(jié)果相一致[16]。推測其可能是水-旱輪作和旱-旱輪作的C/N比例不同導(dǎo)致的結(jié)果，通常情況下C/N與真菌增長呈正相關(guān)。因此，雪茄煙-水稻輪作模式能夠顯著增加真菌群落的豐富度。

連作會改變土壤真菌平衡，減少有益真菌，增加致病真菌[17]。合理輪作在一定程度上能夠改善土壤生態(tài)環(huán)境，如增加真菌多樣性，抑制病原過度繁殖，產(chǎn)生拮抗菌等，從而減少作物病害的發(fā)生[18]。輪作增加土壤真菌種群的豐富度和多樣性，連作則突出優(yōu)勢種群[19]。本研究結(jié)果顯示：門水平上，輪作處理的子囊菌門、擔(dān)子菌門、球囊菌門和梳霉門優(yōu)勢菌相對豐度較連作增加，壺菌門變化則與之相反；屬水平上，輪作處理的枝孢屬、鐮刀菌屬、亡革菌屬、被孢霉屬、Ramicandelaber的相對豐度較連作增加，這與前人的研究結(jié)果不太一致。陽祥等研究發(fā)現(xiàn)，通過輪作方式能夠降低被孢霉屬的相對豐度，推測其原因可能是輪作所選的作物不同，導(dǎo)致作物根系分泌物質(zhì)的差異，改變了土壤環(huán)境對真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[20]。后期研究中我們將進一步關(guān)注不同作物根系分泌物質(zhì)對土壤環(huán)境因子產(chǎn)生的影響，明確關(guān)鍵物質(zhì)對根際土壤微生物群落的影響機制。

本研究利用FFUNGuild功能預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，不同作物輪作處理下，土壤中真菌的主要營養(yǎng)類型是腐生菌，與陳興瓊等人的研究結(jié)果相符[21]。推測其原因是本研究樣本中子囊菌門相對豐度較高（31.76%～63.01%），而子囊菌門多為腐生真菌。與雪茄煙單一連作相比，輪作處理顯著升高了叢枝菌根的相對豐度，其中輪作玉米效果最明顯。說明合理輪作能夠增加根際土壤中的有益微生物。此外，本研究仍有較大比例的土壤真菌功能未被鑒定，這說明在未來的研究中需對真菌群落功能的復(fù)雜性深入分析。

綜上所述，本研究利用高通量測序技術(shù)的分析結(jié)果表明，不同作物輪作根際土壤的真菌種群數(shù)不同，輪作水稻的真菌種群數(shù)最多，輪作玉米的真菌種群數(shù)最少。不同作物輪作對根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢菌相對豐度有明顯影響，輪作能夠顯著增加子囊菌門和叢枝菌根等的相對豐度。

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（責(zé)任編輯：易 "婧）

收稿日期：2024-04-01

基金項目：云南省煙草公司重大科技專項項目（2022530000241005）。

作者簡介：沈俊儒（1974—），博士，助理研究員，主要研究方向為煙草標(biāo)準(zhǔn)化。E-mail： 121831391@qq.com。

*為通信作者，E-mail： kcs@yaas.org.cn。