摘要：探究北沙參根系研磨液及其根際土壤浸提液對北沙參種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，以初步確定北沙參化感自毒作用的存在。本試驗先制備0.05 g/mL的北沙參根系研磨液（RT）和0.50 g/mL的根際土壤浸提液（ST），繼而測定其對北沙參種子萌發(fā)、幼苗生長及其生理生化指標的影響。結(jié)果表明：RT與ST對北沙參種子萌發(fā)有顯著抑制作用：其幼苗生長也受到較大影響，根長、株高、根粗與鮮重大多顯著降低，葉片總?cè)~綠素含量顯著下降，類胡蘿卜素含量顯著升高。兩處理幼苗葉片的PSⅡ最大光化學效率（Fv/Fm）、電子傳遞速率（ETR）、PSⅡ潛在活性（Fv/Fo）、光化學猝滅系數(shù)（qP）、實際光化學效率[Y（Ⅱ）]均受到明顯抑制；幼苗滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)受到顯著影響，葉片脯氨酸、可溶性蛋白含量顯著升高，可溶性糖含量顯著降低：幼苗葉片的抗氧化系統(tǒng)響應脅迫后超氧化物歧化酶活性顯著降低，抗壞血酸過氧化物酶活性顯著升高，丙二醛含量顯著增加。綜之，北沙參根系研磨液及其根際土壤浸提液中存在化感自毒物質(zhì)，影響北沙參種子萌發(fā)與幼苗生長，且化感自毒作用可能是北沙參連作障礙產(chǎn)生的主要原因之一。

關鍵詞：北沙參；化感自毒；連作障礙；種子萌發(fā)：幼苗生長

中圖分類號：S567.5+3 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024） 08-0087-09

北沙參為傘形科多年生植物珊瑚菜（Glehnialittoralis Fr. Schmidt ex Miq.）的干燥根，其主要化學成分為香豆素類、多糖類和聚炔類等，具有消炎抗菌、養(yǎng)陰清肺等功效，是臨床常用的中藥。山東萊陽是北沙參的道地產(chǎn)區(qū)，其氣候、土壤等條件適宜北沙參生長，種植歷史可以追溯到幾百年前。目前北沙參的市場需求量日益上漲，其種植規(guī)模在不斷擴大，山東萊陽、內(nèi)蒙古赤峰和河北安國等地都是北沙參的主產(chǎn)區(qū)。然而，在現(xiàn)階段栽培過程中，連作障礙問題嚴重影響了北沙參的產(chǎn)量與質(zhì)量，其藥用品質(zhì)顯著下降，嚴重阻礙北沙參產(chǎn)業(yè)發(fā)展。目前的研究發(fā)現(xiàn)，藥用植物普遍存在連作障礙問題，而土壤理化性質(zhì)改變、土壤根際微生物生態(tài)失衡以及化感自毒作用被認為是連作障礙產(chǎn)生的主要原因。

化感自毒作用是指成熟植物通過向環(huán)境中釋放化學物質(zhì)來影響其自身物種幼苗生長的現(xiàn)象。在化感作用研究過程中，用適當溶劑提取化感物質(zhì)進行生物測定對研究其作用機理非常重要。大量研究發(fā)現(xiàn)，用植物水浸液或其土壤浸提液澆灌種子、幼苗可以模擬連作時的自毒環(huán)境，證實植物的自毒活性。董艷鑫等研究表明，西洋參根及其連作土壤浸提液可明顯抑制西洋參幼苗生長。周武先等研究發(fā)現(xiàn)，黨參根莖研磨液和根際土壤浸提液達到一定濃度時會對川黨參幼苗生長產(chǎn)生顯著抑制作用。但目前關于北沙參根及其根際土壤的自毒性以及其對種子萌發(fā)、幼苗生長的影響尚不清楚，這不利于北沙參連作障礙問題的解決。為此，本研究用一定濃度的北沙參根系研磨液及其根際土壤浸提液澆灌北沙參種子及幼苗，研究其對種子萌發(fā)和幼苗生長特性、光合作用、滲透調(diào)節(jié)、抗氧化酶系統(tǒng)活性等生理生化過程的影響，以期明確北沙參化感自毒作用的存在以及化感作用對北沙參的生理效應，旨在為探索北沙參連作障礙機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

處于生長收獲期的三年生北沙參及其根際土壤于2022年11月14日采自山東省煙臺市萊山區(qū)萊山街道友誼村（121°35＇92＂E，37°37＇26＂N，海拔1 350 m）的北沙參種植田。采集土壤樣品時先去除根周圍的地表土，然后挖出北沙參植株并收集粘附在根上的土壤，再將北沙參及其根際土壤分別裝入自封袋中做好標記，低溫條件下帶回實驗室。土壤樣品混勻后，自然風干過2 mm篩。北沙參清洗后放人4℃冰箱保存。北沙參種子來源于煙臺大學珊瑚菜種質(zhì)資源庫。

1.2 試驗方法

1.2.1 北沙參根系研磨液的制備

稱取北沙參根莖250 g，用蒸餾水洗凈后切碎，置于陶瓷研缽中，加入少量石英砂充分研磨，加入蒸餾水1L，超聲處理1h后靜置24 h，用4層無菌紗布過濾，然后將濾液以10 000 r/min離心10 min，取上清液即得到0.25g/mL的北沙參根系研磨原液。將其保存于4℃冰箱中備用，試驗使用時稀釋至0.05 g/mL。

1.2.2 北沙參根際土壤浸提液的制備

稱取過篩、風干后北沙參根際土壤500 g，加入蒸餾水定容至IL，超聲處理后充分攪拌靜置24 h，用濾紙抽濾后取上清液，得到0.5 g／mL的北沙參根際土壤浸提液。將其保存于4℃冰箱中備用。

1.2.3 種子及幼苗化感作用試驗

北沙參種子沙藏破眠后，流水沖洗處理干凈，均勻放置在鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿30粒種子，分別加入各處理液5 mL。試驗設置根系研磨液（RT）、土壤浸提液（ST）2個處理，以蒸餾水為對照（CK），各處理重復3次。將培養(yǎng)皿置于恒溫25℃、光照黑暗各12 h的培養(yǎng)室內(nèi)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中按需加入適量處理液以保持培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙的濕度。

另萌發(fā)一批用于幼苗化感作用試驗的北沙參種子，將露白發(fā)芽、大小基本一致的播種至上口徑26 cm、底徑22 cm、高20 cm的育苗盆中，每盆30粒，將其放置于恒溫25℃、光照黑暗各12 h的培養(yǎng)室內(nèi)進行培育。試驗設置根系研磨液（RT）、土壤浸提液（ST）2個處理，以蒸餾水為對照（CK），各處理重復3次。每隔3-4 d每盆分別澆灌300mL處理液，并保持栽培基質(zhì)濕潤。培育1個月后破壞性取樣，進行相應指標的測定。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 種子萌發(fā)指標測定

每天統(tǒng)計一次種子萌發(fā)數(shù)，待萌發(fā)數(shù)量連續(xù)3d保持不變時停止統(tǒng)計，并計算種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)。

發(fā)芽率（%）=正常發(fā)芽種子數(shù)／供試種子總數(shù)×100;發(fā)芽勢（%）=發(fā)芽達到最高峰時的發(fā)芽種子數(shù)／供試種子總數(shù)×100;

發(fā)芽指數(shù)=∑（Gt/Dt）。式中，Gt為發(fā)芽試驗終期內(nèi)每天的子發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)。

1.3.2 幼苗生長指標測定

培育1個月后，每處理隨機選取5株幼苗，測其株高、根長、根粗、鮮重等生長指標。取新鮮葉片，用丙酮乙醇混合法測定葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量；用NBT光化還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性：用紫外分光光度法測定抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性；用硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量；用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量：用考馬斯亮藍G-250法測定可溶性蛋白含量：用蒽酮法測定可溶性糖含量：使用Max-Imaging - PAM調(diào)制葉綠素熒光儀測定葉綠素熒光參數(shù)：用NBT和DAB染色法分別表征北沙參幼苗葉片超氧陰離子（O-·2）及過氧化氫（H2O2）的積累（試劑盒由武漢賽維爾生物科技有限公司生產(chǎn)）。

1.4 化感效應效果評價

用化感效應指數(shù)（RI）反映不同處理液對種子萌發(fā)、幼苗生長的化感作用效果。采用Wil-liamson的方法進行統(tǒng)計分析：當T≥C時，RI=1-C/T;當T＜C時，RI=T/C-I，式中C為對照值，T為處理值。RI＞0，表示處理對其具有化感促進作用；RI＜0，表示處理對其具有化感抑制作用；RI=0，表示處理對其無化感作用。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010處理，SPSS 27軟件進行統(tǒng)計分析，顯著性差異采用單因素方差分析方法，多重比較采用Duncan's法，用GraphPad Prism 9.5.1繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT和ST對北沙參種子萌發(fā)的影響

由表1可知，北沙參根系研磨液（RT）和根際土壤浸提液（ST）處理下北沙參種子的萌發(fā)受到不同程度的影響，與對照組相比差異均顯著。RT處理下北沙參種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢以及發(fā)芽指數(shù)與CK組相比極顯著下降，分別降低34. 33%、54.18%和64.53%：ST處理下發(fā)芽率、發(fā)芽勢以及發(fā)芽指數(shù)受到顯著或極顯著抑制，分別降低9fR5IRlsT0NVlGAVOQm0Ew==13.44%、29. 18%和26 .22%。

兩個處理下北沙參種子萌發(fā)的化感效應指數(shù)均為負值，說明RT和ST對北沙參種子萌發(fā)均存在抑制作用。RT處理的化感作用綜合效應指數(shù)RI為-0.51，表明RT對種子萌發(fā)有明顯抑制作用：ST處理的RI為-0.23，其對北沙參種子萌發(fā)也具有抑制作用，但與RT相比影響較小。以上結(jié)果表明，北沙參根系研磨液及其根際土壤浸提液一定程度上均能夠抑制北沙參種子萌發(fā)。

2.2 RT和ST對北沙參幼苗生長的影響

由表2可以看出，北沙參根系研磨液（RT）和根際土壤浸提液（ST）處理極顯著抑制北沙參根長，與CK相比，分別降低57.90%和41.22%。兩處理下北沙參幼苗株高均顯著小于CK，分別降低58.03%、36.98%。RT對北沙參幼苗根粗與鮮重有顯著影響，較CK分別降低21 .21%、38.10%；ST處理根粗、鮮重與CK相比略有減小，與RT相比略有增加，差異均不顯著。

兩處理下幼苗根長、株高、根粗與鮮重的化感效應指數(shù)均＜0，說明RT與ST對北沙參幼苗生長均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。其中RT對幼苗根長、株高的抑制作用最強，RI均為-0.58; ST處理根粗、鮮重的RI稍大，抑制作用較小。RT的化感作用綜合效應指數(shù)小于ST，降低40.91%，說明RT的自毒作用較ST更強。以上結(jié)果表明，RT與ST對北沙參幼苗生長均有一定的化感自毒作用。

2.3 RT和ST對北沙參幼苗葉片光合色素含量的影響

如圖1所示，與CK相比，北沙參根系研磨液（RT）處理下幼苗葉片的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均顯著下降，分別降低13. 95%、13.51%和13.84%，其中葉綠素a和總?cè)~綠素含量達極顯著水平：類胡蘿卜素含量顯著增加，升高3.03%。根際土壤浸提液（ST）處理下葉片葉綠素a、總?cè)~綠素含量與CK相比極顯著下降，分別降低8.34%和8.84%；葉綠素b、類胡蘿卜素含量受到的影響較小，差異不顯著。以上結(jié)果說明，兩處理對北沙參幼苗葉片光合色素含量均有不同程度的影響：北沙參根系研磨液可以通過抑制葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量以及提高類胡蘿卜素含量來影響光合作用，根際土壤浸提液可以通過減少葉肉細胞中的葉綠素a和總?cè)~綠素含量來影響光合作用。與土壤浸提液相比，北沙參根系研磨液對光合色素含量的影響更大。

2.4 RT和ST對北沙參幼苗葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

由圖2可以看出，北沙參根系研磨液（RT）和根際土壤浸提液（ST）對北沙參幼苗葉片的PSⅡ最大光化學效率（Fv/Fm）、電子傳遞速率（ETR）、PSⅡ潛在活性（Fv/Fo）、光化學猝滅系數(shù)（qP）、實際光化學效率[Y（Ⅱ）]均有顯著抑制作用。RT處理下北沙參幼苗葉片的Y（Ⅱ）值較CK顯著降低，降幅為22.38%；Fv/Fm、ETR、Fv/Fo和qP值較CK極顯著下降，其值分別為0.67、0.35、2.17和0.63。ST處理下北沙參幼苗葉片的Fv/Fm值稍有下降（5.59%），而ETR、Fv/Fo、qP和Y（Ⅱ）值均顯著低于CK，分別降低27. 70%、16. 38%、11.93%和21.85%。以上結(jié)果說明，北沙參根系研磨液與根際土壤浸提液能夠?qū)χ仓甑腜SⅡ反應中心產(chǎn)生影響，進而導致光合能力下降，影響正常生長，且土壤浸提液比根系研磨液處理產(chǎn)生的影響小。

2.5 RT和ST對北沙參幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖3可知，北沙參根系研磨液（RT）和根際土壤浸提液（ST）對北沙參幼苗葉片的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量均有顯著影響。與CK相比，RT與ST處理下北沙參幼苗葉片的可溶性糖含量顯著下降，分別降低13.98%和13.58%：可溶性蛋白含量顯著增加，增幅分別達到91.0%和4.93%：脯氨酸含量顯著升高，兩處理分別達到132.90 μg/g和67.00 μg/g，RT處理增幅較大，較CK提升3.9倍，差異達到極顯著水平。以上結(jié)果說明，RT與ST能夠顯著影響北沙參幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的形成。

2.6 RT和ST對北沙參幼苗葉片抗氧化系統(tǒng)的影響

由圖4可知，北沙參根系研磨液（RT）和根際土壤浸提液（ST）處理下北沙參幼苗葉片的丙二醛（MDA）含量及抗氧化酶活性均受到不同程度的影響。RT與ST處理葉片MDA含量較CK分別升高31 .65%和22.49%，差異達極顯著水平，說明兩處理對北沙參幼苗葉片的細胞膜有一定毒害作用（圖4A）。如圖4B所示，RT與ST處理顯著抑制北沙參幼苗葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性，且RT的抑制作用更強，達極顯著水平。與CK相比，RT與ST處理極顯著提升抗壞血酸過氧化酶（APX）活性，增幅分別達到2.52倍和1.76倍（圖4C）。

NBT與DAB染色分別顯示了O-·2與H2O2的定位與分布情況（圖5）。與CK相比，NBT染色后RT與ST處理北沙參幼苗葉片的部分部位呈現(xiàn)出藍色斑點，且RT處理的分布更為廣泛。與CK相比，DAB染色后RT與ST處理北沙參幼苗葉片稍有棕色印記，且多分布在葉脈部位，但染色不明顯。以上結(jié)果說明，北沙參根系研磨液與根際土壤浸提液會破壞北沙參幼苗的生物膜系統(tǒng)，同時對其抗氧化系統(tǒng)造成損傷。

3 討論與結(jié)論

化感自毒作用普遍存在于藥用植物栽培過程中。在人參、地黃和三七等藥用植物的重茬地中發(fā)現(xiàn)，化感自毒作用產(chǎn)生的化感物質(zhì)逐漸積累，到一定量時會產(chǎn)生毒害作用，因此化感自毒作用是導致藥用植物連作障礙的主要原因之一。

種子萌發(fā)和幼苗生長階段對外部環(huán)境變化較為敏感，常用于分析化感自毒作用效應。Wang等利用stFzO0loYcFfV25T4N3CbA==苜蓿根系分泌物處理蒺藜、苜蓿種子及其幼苗，發(fā)現(xiàn)兩組處理的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、根長和株高等生長指標均受到顯著抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，RT與ST處理下北沙參種子萌發(fā)受到顯著影響，兩處理均降低北沙參種子的萌發(fā)率，延長萌發(fā)時間，顯著抑制種子活力，說明北沙參種子在萌發(fā)過程中受到一定的化感自毒作用。這可能是由于北沙參自身分泌的化感物質(zhì)，干擾了種子內(nèi)部的物質(zhì)能量轉(zhuǎn)換，造成細胞損傷，進而阻礙種子萌發(fā)，這與多花黃精植株及根際土水浸液對其種子萌發(fā)影響的效果基本一致。同時，本研究中，RT與ST處理北沙參幼苗生長的綜合效應顯示，根長、株高、根粗和鮮重也均受到抑制。這與陳君良等研究蘭州百合根系分泌物對百合幼苗的自毒作用結(jié)果類似，說明北沙參化感自毒作用抑制其幼苗生長，也進一步證明了北沙參化感自毒作用的存在。

化感自毒作用可以通過抑制光合色素的產(chǎn)生以及影響光合傳遞鏈導致植物光合能力減弱，進而抑制植物生長。薛啟等發(fā)現(xiàn)，藿香不同部位浸提液能夠顯著降低藿香幼苗的葉綠素含量。本試驗中，RT與ST處理下北沙參幼苗葉片的葉綠素含量顯著下降，這與前人的研究結(jié)果一致：而RT處理下北沙參葉片的類胡蘿卜素含量則顯著升高，這可能是由于化感自毒作用脅迫下類胡蘿卜素含量的提高有助于接受過剩的激發(fā)態(tài)葉綠素分子，避免植物體內(nèi)積累大量活性氧，起到保護細胞的作用。此外，RT與ST還顯著抑制北沙參幼苗葉片的ETR、Fv/Fo、qP以及Y（Ⅱ），表明葉片的PSⅡ反應中心結(jié)構受到損壞，PSⅡ光能轉(zhuǎn)換效率、電子傳遞能力被抑制，導致其光合能力顯著下降。這與高旭等在豌豆幼苗相關試驗中的結(jié)果一致。

滲透調(diào)節(jié)是植物在脅迫狀態(tài)下維持正常生長代謝的重要調(diào)節(jié)方式，而滲透調(diào)節(jié)能力與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累量密切相關。本研究中，北沙參幼苗葉片的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸這三種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，經(jīng)RT與ST處理后，其含量均受到顯著影響，其中可溶性蛋白和脯氨酸含量與CK相比顯著升高，而可溶性糖含量則顯著降低。這可能是由于兩種處理液中的化感物質(zhì)損傷了植物體內(nèi)的膜系統(tǒng)，導致北沙參體內(nèi)積累大量可溶性蛋白與脯氨酸來提升滲透調(diào)節(jié)能力，同時調(diào)節(jié)可溶性糖的合成，使其體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)總量維持在一定水平，從而維持滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)的正常運行。這一結(jié)果與陳新棟等關于灌叢凋落葉對垂穗披堿草幼苗化感作用的研究結(jié)論類似。

在脅迫環(huán)境下，植物組織中的活性氧（ROS）含量會大量增加，而ROS的積累會損害植物膜結(jié)構及生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，化感自毒作用能夠誘導植物細胞內(nèi)ROS積累，損傷細胞膜結(jié)構，導致膜脂過氧化產(chǎn)生丙二醛（MDA）。本試驗結(jié)果表明，RT與ST處理下北沙參幼苗葉片的MDA含量與CK相比顯著增加，說明自毒作用造成了膜脂過氧化損傷，細胞膜系統(tǒng)受損加劇。該結(jié)果與劉蘋等關于花生根系分泌物對葉片膜脂過氧化影響的研究結(jié)果一致。此外，正常條件下植物能夠借助自身抗氧化酶的作用來清除產(chǎn)生的活性氧，從而抵御脅迫環(huán)境對植株本身產(chǎn)生的毒害作用。本試驗中，與CK相比，RT與ST處理北沙參幼苗葉片的SOD活性被顯著抑制，APX活性顯著升高。這可能是由于SOD與APX對于兩種處理液中的化感物質(zhì)的敏感程度不同所致，該結(jié)果與陸心宇關于化感自毒物質(zhì)對黃瓜抗氧化系統(tǒng)影響的研究結(jié)果類似。同時結(jié)合DAB與NBT兩種ROS染色結(jié)果可以推測，其SOD的活性氧清除機制遭到破壞，無法將O-·2歧化為H2O2，而APX又可以清除H2O2，因此導致DAB和NBT染色顯示出兩種處理下H2O2的積累不明顯，O-·2積累較為明顯，也說明北沙參的化感自毒作用會使其抗氧化系統(tǒng)受到不可逆的損傷。

本研究采用三年生北沙參及其根際土壤制備北沙參根系研磨液以及土壤浸提液，發(fā)現(xiàn)兩種處理液均能夠?qū)Ρ鄙硡⒎N子萌發(fā)及幼苗生長產(chǎn)生抑制作用。這證實了北沙參化感自毒作用的存在，并說明化感自毒作用可能是北沙參連作障礙產(chǎn)生的重要原因之一。

基金項目：山東省重點研發(fā)計劃項目（2019GSF108220）