摘要：脫落酸不敏感蛋白5（abscisic acid insensitive 5，ABI5）屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)。本研究采用同源克隆的方法獲得了黃瓜CsABI5基因，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和組織特異性表達(dá)分析，并分析了其在鹽脅迫和ABA處理下的表達(dá)情況。結(jié)果表明，CsABI5基因的CDS為1 230 bp，編碼409個(gè)氨基酸，其編碼蛋白的分子量為44. 88 kDa，理論等電點(diǎn)為9.53，親水性平均系數(shù)為-0.603，屬于親水性堿性蛋白。多序列比對(duì)顯示該蛋白與其他物種的ABI5蛋白具有較高的相似性，C端均含有典型的保守bZIP結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示葫蘆科的ABI5聚為一支，CsABI5與甜瓜的CmABI5親緣關(guān)系最近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）測(cè)定發(fā)現(xiàn)，CsABI5在黃瓜營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中均有表達(dá)，在果刺中相對(duì)表達(dá)量最高。四葉期幼苗受100 mmol/L NaCI和100 μmol/L ABA處理后CsABI5表達(dá)量顯著上調(diào)，均在處理6h升至最高。本研究結(jié)果可為抗逆黃瓜品種的選育提供參考。

關(guān)鍵詞：黃瓜：ABI5蛋白：鹽脅迫：生物信息學(xué)分析：表達(dá)特性

中圖分類號(hào)：S642.2：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024） 08-0030-07

脫落酸（abscisic acid，ABA）是植物五大內(nèi)源激素之一，不僅在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，還能響應(yīng)極端溫度、干旱、鹽堿等各種環(huán)境脅迫，是平衡植物生長(zhǎng)代謝的關(guān)鍵因子。通過(guò)對(duì)擬南芥突變體的研究，鑒定到許多對(duì)ABA不敏感（ABA-insensitive，ABI）的基因，例如ABI1、AB12、ABI3、ABI4、ABI5。其中，ABI1和ABI2是兩個(gè)高度同源的蛋白磷酸激酶，是ABA信號(hào)通路中的負(fù)調(diào)控因子：ABI3和ABI4分別屬于B3蛋白家族和AP2/ERF家族：ABI5屬于堿性亮氨酸拉鏈類（basic leucine zipper，bZIP）轉(zhuǎn)錄因子，具有一個(gè)典型的bZIP結(jié)構(gòu)域。目前，在擬南芥、水稻、小麥、玉米、蘋果等植物中對(duì)ABI5基因功能均開(kāi)展了相關(guān)研究，明確其在調(diào)控種子萌發(fā)、開(kāi)花時(shí)間、根生長(zhǎng)以及響應(yīng)逆境脅迫等生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。此外，ABI5還與其他植物激素信號(hào)通路中的因子相互作用，以調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育。

黃瓜（Cucumis sativus）是葫蘆科一年生草本植物，是中國(guó)設(shè)施栽培蔬菜中的第二大作物。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過(guò)表達(dá)黃瓜RELATED TOABI3/VP1（CsRAV1）基因能提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)ABA的抗性：黃瓜CHY ZINC-FINGER ANDRING PROTEIN1（CsCHYR1）基因的表達(dá)受ABA誘導(dǎo)，并且通過(guò)與NAC轉(zhuǎn)錄因子CsATAF1相互作用調(diào)節(jié)植株的耐旱性。ABI5在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要功能，然而在黃瓜中卻鮮有報(bào)道。本研究采用同源克隆方法從黃瓜中克隆了CsABI5基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析以及在不同器官中和NaCl、ABA處理下的表達(dá)模式分析，以期為抗逆黃瓜品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用華北型黃瓜自交系9930，2023年8月種植于上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院五厙實(shí)訓(xùn)基地。選擇長(zhǎng)至5片真葉的黃瓜植株，取其根、莖、子葉、真葉；選擇長(zhǎng)至20節(jié)位的黃瓜植株，取其花瓣、果刺、果皮和卷須。選擇具有4片真葉的幼苗，一部分用100 mmol/L NaCl溶液澆灌進(jìn)行鹽脅迫處理，澆灌量約500 mL;另一部分用100 μmol/LABA噴施植株葉片，并均在處理0、1、3、6、12 h取葉片。所取樣品液氮速凍后置于-80℃冰箱中備用。

1.2 基因克隆

基于黃瓜9930 V2版基因組（http：//cucurbit-genomics.org/ftp/genome/cucumber/Chinese_long/v2/）設(shè)計(jì)特異性引物CsABI5_F（5’- AT-GAATITCAGAAACTITGAGGATATCC-3’）和CsABI5_R（5’- CCATGGGCCAGTCAGTGTTC-3’）。使用植物RNA提取試劑盒（康為世紀(jì)生物科技股份有限公司）提取黃瓜葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，選用高保真酶PrimeSTAR Max Premix（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳回收后將目的片段連接至pClone007 Blunt Vector克隆載體（上海擎科生物科技有限公司），轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，12 h后挑取單菌落進(jìn)行PCR篩選，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。擴(kuò)增體系：PrimeSTARMax Premix 25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2μL，模板DNA 200 ng，ddH，O補(bǔ)充至50 μL。擴(kuò)增程序：94℃5 min;98℃10 s，55℃15 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃5 min。

1.3 CsAB15的生物信息學(xué)分析

通過(guò)ExPACy網(wǎng)站的ProtParam對(duì)CsABI5蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。通過(guò)Cell-PLoc 2.0網(wǎng)站對(duì)CsABI5的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用SOPMA網(wǎng)站對(duì)CsABI5的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用PlantCARE對(duì)CsAB15的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游2 000bp的序列進(jìn)行啟動(dòng)子元件預(yù)測(cè)。利用MEME對(duì)CsABI5的保守基序（Motif）進(jìn)行預(yù)測(cè)。將CsABI5的蛋白序列提交到NCBI網(wǎng)站，進(jìn)行序列比對(duì)，下載不同物種的bZIP蛋白序列（表1），利用DNA-MAN對(duì)9種植物的ABI5蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)MEGA X對(duì)21種bZIP蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。使用TBtools對(duì)進(jìn)化樹(shù)和Motif進(jìn)行可視化展示。

1.4 CsABI5的表達(dá)分析

分別提取黃瓜各器官的總RNA，檢測(cè)合格后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)CsABI5編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物RT-CsABI5F（5’-CTAAGGCACAAGGAAATTT-CACAT-3’）和RT - CsABI5R（5’- CGGCAGTC-CATATGTTTTTAAGAA -3’），進(jìn)行RT - qPCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)CsAB15在黃瓜不同器官中以及NaCl和ABA處理后的表達(dá)情況。使用康為世紀(jì)的Ultra-SYBR Mixture試劑盒進(jìn)行分析，PCR體系和程序見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。用黃瓜Actin（Csa6C484600）基因作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsABI5基因克隆及其編碼蛋白理化性質(zhì)

以黃瓜cDNA為模板，對(duì)CsAB15基因的編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，電泳后獲得一條約1 200 bp的條帶（圖1）。測(cè)序結(jié)果表明，CsAB15基因的CDS長(zhǎng)度為1230 bp，編碼409個(gè)氨基酸。CsABI5蛋白的分子式為C1943 H3131 N579 0612 S15，分子量為44. 88kDa，理論等電點(diǎn)為9.53，親水性平均系數(shù)為-0.603，屬于親水性堿性蛋白。CsABI5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角組成，其中無(wú)規(guī)則卷曲占比最高（57.46%），其次是α -螺旋（31.78%），延伸鏈（8.80%）和β-轉(zhuǎn)角（1.96%）占比較小。Cell-PLoc 2.0預(yù)測(cè)CsABI5蛋白定位于細(xì)胞核中。

2.2 CsABI5的進(jìn)化分析

將克隆得到的黃瓜CsABI5序列與其他9個(gè)物種的ABI5序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果（圖2）顯示：CsABI5與其他物種的ABI5蛋白相似系數(shù)介于32.1% - 96. 8%，與甜瓜CmABI5的相似性最高，其次是與冬瓜、野生灰籽南瓜、苦瓜、印度南瓜和美洲南瓜的ABI5蛋白，相似系數(shù)分別為96.8%、94. 4%、82. 9%、82. 5%、82. 2%0和82. 2%.此外，這些序列在C端均含有典型的bZIP結(jié)構(gòu)域。

利用21條不同植物的bZIP家族蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖3）表明，21個(gè)蛋白分為3組，所有葫蘆科植物的ABI5聚在Ⅱ組，擬南芥的ABI5單獨(dú)聚為Ⅲ組，其余物種的bZIP蛋白聚在Ⅰ組。CsABI5與甜瓜的CmABI5親緣關(guān)系最近。用MEME對(duì)21條蛋白序列的保守基序進(jìn)行分析，結(jié)果（圖3）顯示，所有蛋白序列均含有Motif5、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 9、Motif 1，其中Motif 1是bZIP結(jié)構(gòu)域。

2.3 啟動(dòng)子元件分析

由表2可見(jiàn)，CsAB15啟動(dòng)子區(qū)除了含有核心元件TATA和CAAT外，還包含1個(gè)脫落酸響應(yīng)元件（abscisic acid responsive）、1個(gè)防御脅迫響應(yīng)元件（defense and stress responsive）、1個(gè)干旱響應(yīng)元件（drought-inducibility）、2個(gè)赤霉素響應(yīng)元件（GA-responsive）以及10個(gè)光周期響應(yīng)元件（lightresponsive）。表明該基因可能在響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用。

2.4 CsAB15基因在黃瓜不同器官中的表達(dá)模式

利用RT-qPCR對(duì)CsABI5基因在黃瓜不同器官中的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果（圖4）顯示，CsAB15在黃瓜所有器官中均表達(dá)，但在果刺中的表達(dá)量最高，其次是子葉、莖、根、卷須、果皮、花瓣和葉。

2.5 CsABI5基因在鹽脅迫和ABA處理下的表達(dá)模式

將黃瓜幼苗用100mmol/L NaCl和100μmol/L ABA處理，利用RT - qPCR檢測(cè)CsAB15在處理不同時(shí)間的表達(dá)水平，結(jié)果（圖5）表明：CsABI5在NaCl處理后，表達(dá)量先升高，處理6h達(dá)到最高，是未處理的4.6倍，之后表達(dá)量快速下降，12 h后基本恢復(fù)到初始水平。ABA處理可誘導(dǎo)CsAB15顯著上調(diào)表達(dá)，處理6h的相對(duì)表達(dá)量最高，是未處理的15.1倍，之后也快速下降。

3 討論與結(jié)論

bZIP轉(zhuǎn)錄因子是植物生長(zhǎng)發(fā)育中重要的一類調(diào)節(jié)因子，能夠響應(yīng)多種生物和非生物脅迫，并賦予植物多種脅迫抗性。本研究采用同源克隆的方法在黃瓜中克隆到一個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子Cs-ABI5，CsAB15基因的CDS全長(zhǎng)1230 bp，編碼409個(gè)氨基酸。CsABI5蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角組成，含有保守的bZIP結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析顯示CsABI5與甜瓜的CmABI5親緣關(guān)系最近，這與經(jīng)典的系統(tǒng)分類結(jié)果一致。

擬南芥abi5突變體對(duì)ABA處理不敏感，種子萌發(fā)不受ABA抑制，而AB15過(guò)表達(dá)植株對(duì)ABA超敏感。ABI5可以直接結(jié)合靶基因啟動(dòng)子的ABA響應(yīng)元件抑制種子的萌發(fā)，能通過(guò)調(diào)控FLOWERING LOCUSC（FLC）的表達(dá)控制開(kāi)花時(shí)間，能通過(guò)調(diào)控葡萄糖的合成抑制根分生組織的生長(zhǎng)。水稻AB15-Likel（ABL1）在根、莖、葉等多個(gè)器官中表達(dá)，并受ABA以及鹽、干旱和滲透脅迫等的誘導(dǎo)。玉米ZmAB15受高溫、低溫、脫落酸、水楊酸、氯化鈉等多種脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，過(guò)表達(dá)ZmAB15植株呈現(xiàn)出明顯的脅迫敏感表型。擬南芥AB15在受到ABA誘導(dǎo)后，表達(dá)量增加，在6h后升至最高。本研究結(jié)果表明，黃瓜CsABI5受100 μmol/L ABA誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，處理6h時(shí)表達(dá)量最高，與擬南芥中的結(jié)果相似。另外，在CsABI5啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了脫落酸響應(yīng)元件、防御脅迫響應(yīng)元件、干旱響應(yīng)元件，Cs-ABI5可能通過(guò)這些元件響應(yīng)脅迫信號(hào)。

CsABI5在黃瓜各器官中均有表達(dá)，在果刺中相對(duì)表達(dá)量最高。草莓FaABI5同樣在所有器官中表達(dá)，但在根中相對(duì)表達(dá)量最高。而擬南芥AB15主要在成熟種子和花朵中表達(dá)，營(yíng)養(yǎng)組織中幾乎不表達(dá)。這說(shuō)明雖然ABI5在不同植物中的功能相對(duì)保守，但表達(dá)部位存在差異。

綜上，本研究通過(guò)同源克隆獲得了黃瓜CsA-BI5基因，其編碼蛋白含有保守的bZIP結(jié)構(gòu)域，與甜瓜CmABI5親緣關(guān)系最近，啟動(dòng)子區(qū)含有多種逆境應(yīng)答元件，在100 mmol/L NaC1和100μmol/L ABA處理6h內(nèi)上調(diào)表達(dá)且表達(dá)水平逐漸升高，之后表達(dá)量快速下降。本研究結(jié)果可為CsABI5參與黃瓜逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)研究提供理論依據(jù)，并為黃瓜耐逆品種選育奠定基礎(chǔ)。

基金項(xiàng)目：上海市“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”農(nóng)業(yè)領(lǐng)域項(xiàng)目（20392001300）