摘要： 【目的】研究西伯利亞百合萌發(fā)階段的分子調(diào)控機制，篩選響應褪黑素、促進百合鱗莖萌發(fā)的潛在乙烯響應因子（ethylene response factor，ERF）?！痉椒ā繉ν屎谒靥幚硐碌奈鞑麃啺俸闲△[莖關鍵時期樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，并對差異表達基因進行功能注釋，篩選響應褪黑素、促進百合鱗莖萌發(fā)的ERF 潛在基因。對篩選的關鍵基因LoERF96 進行克隆和生物信息學分析，通過實時熒光定量分析小鱗莖4 個不同生長發(fā)育時期中LoERF96 基因的表達量。【結(jié)果】根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選得到780 個差異表達基因，其中上調(diào)表達基因392 個，下調(diào)表達基因388 個。GO 富集分析結(jié)果顯示：富集的差異基因主要生物學過程包括代謝過程、細胞過程、生物調(diào)節(jié)、刺激響應、信號、生殖過程等。KEGG 代謝途徑分析結(jié)果顯示：差異基因的代謝途徑包括植物激素信號轉(zhuǎn)導、植物MAPK 信號途徑、苯丙烷生物合成、淀粉和蔗糖代謝、光合作用、碳代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工等。通過同源克隆得到LoERF96 基因，該基因序列全長435 bp，編碼144 個氨基酸，有1 個AP2 保守結(jié)構(gòu)域，蛋白相對分子質(zhì)量約為16.32 ku，理論等電點為4.94，是沒有跨膜結(jié)構(gòu)的親水性蛋白，預測亞細胞定位于細胞核中。RT-qPCR 表達結(jié)果顯示：在百合4 個不同生長發(fā)育過程中，LoERF96 基因的相對表達量總體呈先上升后下降的趨勢。【結(jié)論】西伯利亞百合中的乙烯響應因子LoERF96 受褪黑素誘導表達，這一結(jié)果為探究百合AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子萌發(fā)階段的生物學功能提供了理論基礎和參考。

關鍵詞： 百合；LoERF96；基因克??；轉(zhuǎn)錄組；生物信息學分析

中圖分類號： S682.265.01 文獻標志碼： A 文章編號： 1004–390X （2024） 04?0119?12

百合（Lilium spp.） 是百合科（Liliaceae） 百合屬（Lilium） 所有種類的總稱，通常為具有根狀莖、塊莖或鱗莖的多年生草本。西伯利亞百合（Lilium‘Siberia’） 屬于東方百合，由天香百合（L. auratumLindl.）、藥百合（L. speciosum var. gloriosoidesBaker） 等品種雜交而成，由于其花大而美麗，開放時氣味芳香，是非常受消費者歡迎的鮮切花之一[1]。切花的生產(chǎn)需要優(yōu)質(zhì)的商品種球，鱗片繁殖成本低、操作簡便、繁殖系數(shù)高，是目前種球商品化生產(chǎn)最常用的技術途徑[2]。百合種球從鱗片扦插到成球的生產(chǎn)周期較長，小鱗莖培養(yǎng)成合格的種球一般需要2～3 年，如何提高小鱗莖的繁殖系數(shù)、促進鱗莖膨大對百合種球的生產(chǎn)至關重要。因此，研究促進百合小鱗莖萌發(fā)的分子機制及挖掘調(diào)控萌發(fā)的潛在基因具有重要意義。

AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子是植物中的一大類因子，該家族參與多種生物學過程，包括植物形態(tài)建成、病菌防御、對各種脅迫的響應機制、激素信號轉(zhuǎn)導等[3]。AP2/ERF 家族轉(zhuǎn)錄因子主要分為脫水反應元件結(jié)合蛋白（dehydration-responsive elementbinding protein，DREB）、乙烯響應因子（ethyleneresponse factor，ERF）、APETALA2 （AP2） 和ABI3/VP1 相關因子（related to ABI3/VP1，RAV）四大亞家族以及少數(shù)未分類因子（Soloists）[4]。ERF 亞家族不僅參與植物發(fā)育和生理過程的多種功能，還參與種子萌發(fā)和芽休眠。SlPti4 是番茄（Solanum lycopersicum L.） 果實成熟、種子萌發(fā)和非生物脅迫響應的重要調(diào)節(jié)因子[5]；油桃（Prunuspersica var. nectarina） 中的ERF 家族成員PpeEBB1可調(diào)控桃芽萌發(fā)[6]；在碭山酥梨中，PpyERF060、PpyABF3 和PpyMADS71 互作可整合乙烯與脫落酸的信號通路，進而調(diào)控梨芽休眠進程[7]；櫻桃（Prunus pseudocerasus） 中的PpcERF5 表達被脫落酸（abscisic acid，ABA） 誘導上調(diào)，這可能是其參與櫻桃花芽休眠調(diào)控的方式之一，過表達Ppc-ERF5 基因還可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥（Arabidopsis"thaliana） 種子的萌發(fā)率[8]。

褪黑素在調(diào)節(jié)植物生長、種子發(fā)芽、葉片衰老、光合效率、果實成熟等生理生長過程以及調(diào)控植物增強抗逆性、抵御細菌和真菌病害方面具有重要作用[9-11]。褪黑素是與植物激素相關的基因表達的重要調(diào)節(jié)劑，它與植物激素之間表現(xiàn)出復雜的交叉作用，如參與生長素、吲哚乙酸、赤霉素、細胞分裂素、脫落酸、乙烯、水楊酸、茉莉酮、油菜素類固醇的代謝[12-14]。擬南芥中的褪黑素可通過降低IAA17 及衰老相關基因的表達抑制植物的衰老進程[15]；褪黑素處理可以通過影響氨基酸代謝來提高冷藏果實的可溶性糖含量、香氣水平和果實品質(zhì)[16]；番茄中低濃度的外源褪黑素處理可以促進不定根的形成[17]；相反，高濃度的褪黑素處理會抑制生長素的生物合成以及轉(zhuǎn)運途徑中許多基因的表達[18]；用褪黑素處理多年生黑麥草（Lolium perenne L.），增加了熱應激下褪黑素的內(nèi)源含量，從而降低ABA 含量[19]；外源褪黑素可促進Cr 脅迫下百日草（Zinnia elegans） 的種子萌發(fā)，提高其對Cr 脅迫的抗性[20]；在黃瓜（Cucumis sativus L.） 幼苗中， 褪黑素通過調(diào)節(jié)ABA 和赤霉素（gibberellin，GA4） 的生物合成和分解代謝以減輕NaCl 的脅迫抑制作用，促進發(fā)芽[21]。

百合萌發(fā)的相關作用機制很復雜，高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術為探究萌發(fā)分子機制提供了途徑和方法，可用于系統(tǒng)研究百合萌發(fā)過程的相關代謝通路。AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、代謝、生物和非生物脅迫方面扮演著重要角色，而關于促進百合鱗莖萌發(fā)的報道較少。為深入研究百合萌發(fā)階段的分子調(diào)控機制，通過對褪黑素處理下的百合小鱗莖進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，并對差異表達的基因進行功能注釋，篩選受褪黑素誘導的LoERF96 基因；對該基因進行克隆及生物信息學分析，利用實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 分析其在小鱗莖4 個不同生長發(fā)育時期的基因表達量，為探究百合AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子在萌發(fā)過程中的生物學功能提供理論基礎和參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試百合小鱗莖由西伯利亞百合大種球（云南沃德球根生物科技有限公司） 鱗片包埋繁殖獲得。將西伯利亞百合大種球中外層的鱗片剝下，包埋于椰糠基質(zhì)中，在28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中遮光培養(yǎng)45 d，然后將獲得的小鱗莖置于4 ℃ 環(huán)境中低溫冷藏70 d，冷藏結(jié)束后將小鱗莖洗凈、晾干待用。

1.2 樣本處理

選取生長狀態(tài)良好、大小一致、鮮質(zhì)量為（0.20±0.10） g 的百合小鱗莖，隨機平均分為2 組，每組72 個（含3 次重復），其中一組為處理組，用100 μmol/L 褪黑素溶液浸泡2 h；另一組為對照組，用蒸餾水浸泡2 h。將浸泡處理后的小鱗莖放在濾紙上晾干，將小鱗莖栽培到椰糠為基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，每個營養(yǎng)缽栽培3 個；將營養(yǎng)缽放入25 ℃ 的光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，小鱗莖破土長出芽即認為萌發(fā)，分別在第0、7、14 和21 天取樣，液氮速凍后置于?80 ℃ 超低溫冰箱保存，用于后續(xù)試驗。

1.3 總RNA 提取

按照RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，DP441） 說明書，分別提取4 個不同時期處理組和對照組的西伯利亞百合小鱗莖總RNA，用NanoDrop 2000 分光光度計檢測RNA 的純度和濃度，用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的質(zhì)量；檢測合格后，取部分試驗第21 天的RNA 進行轉(zhuǎn)錄組測序及目的基因克隆試驗；4 個時期的全部RNA 材料均用于后續(xù)的基因表達分析。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序

RNA 檢測合格后進行轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建，用含有Oligo （dT） 的磁珠富集真核生物mRNA 將mRNA隨機打斷，以mRNA 為模板合成cDNA 第1 鏈和第2 鏈并進行cDNA 純化，然后進行末端修復、加A 尾并連接測序接頭，PCR 富集得到cDNA文庫。用N50 數(shù)值對組裝文庫進行質(zhì)量評估檢測，Unigene N50 越長，說明組裝質(zhì)量越好。 N50的定義為：將所有Unigene 從長到短排序，并依次累加長度，當累加片段長度達到總片段長度的50% 時，對應的片段長度即為N50。文庫質(zhì)檢合格后，用Illumina NovaSeq6000 測序平臺進行測序（委托北京百邁客生物科技有限公司完成）。

1.5 Unigene 功能注釋

將Unigene 序列與非冗余蛋白質(zhì)序列（nonredundantprotein sequence，NR） 數(shù)據(jù)庫、Swiss-Prot 蛋白質(zhì)序列 （Swiss-Prot protein sequence，Swi-ss-Prot） 數(shù)據(jù)庫、原核生物同源蛋白簇 （clusters oforthologous groups，COG）、真核生物同源蛋白簇（eukaryotic orthologous groups，KOG）、 eggNOG4.5數(shù)據(jù)庫、Pfam 數(shù)據(jù)庫（protein family，http：//pfam.sanger.ac.uk/）、京都基因與基因組百科全書 （Kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG） 和（gene ontology，GO，http：//www.geneontology.org/）數(shù)據(jù)庫比對，獲得Unigene 的注釋信息。