摘要 表面增強拉曼散射（SERS）作為一種高靈敏分析技術(shù)，在環(huán)境分析和食品安全等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用潛力。SERS 傳感器極易受到環(huán)境基質(zhì)的干擾，因此，采用前處理等方法消除環(huán)境因素的干擾非常重要。其中，構(gòu)建電分離/富集-檢測一體化分析策略是實現(xiàn)復(fù)雜樣本中痕量荷電分子精準檢測的重要策略之一。本研究以絲網(wǎng)印刷電極（SPCE）為載體，采用電化學(xué)還原一步法制備還原氧化石墨烯（RGO）和金納米顆粒（AuNPs）復(fù)合物（Au-RGO）負載的SPCE，結(jié)合電動捕獲技術(shù)進行荷電分子的選擇性分離和高效富集，利用Au-RGO 的信號放大作用，實現(xiàn)了對西瑪津、殺草強、甲基對硫磷和馬拉硫磷4 種農(nóng)藥殘留的高靈敏SERS檢測。本方法的線性檢測范圍寬（0.001～500 μmol/L），檢出限為0.3～2.0 nmol/L。將本方法用于果蔬樣品的檢測，檢測結(jié)果與氣相色譜-質(zhì)譜方法的檢測結(jié)果一致。本方法避免了傳統(tǒng)SERS 傳感器用于環(huán)境和食品分析時面臨的復(fù)雜基質(zhì)干擾和前處理繁瑣等問題，為環(huán)境污染物的現(xiàn)場快速檢測提供了技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞 表面增強拉曼散射；傳感器；電富集；石墨烯；農(nóng)藥

農(nóng)藥對保護作物和減少產(chǎn)量損失發(fā)揮了重要作用[1-2]。但是，農(nóng)藥濫用會對人類健康和生態(tài)環(huán)境造成嚴重危害[3-4]。因此，建立農(nóng)藥殘留快速準確的檢測方法意義重大。傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留快速檢測方法包括比色法和電化學(xué)分析法等，具有操作簡便、測定快速和分析范圍廣等優(yōu)勢，但是這些方法選擇性低，并且所用試劑或材料會污染環(huán)境[5-8]。表面增強拉曼光譜（Surface enhanced Raman spectroscopy， SERS）作為一種可用于現(xiàn)場快速檢測的分析技術(shù)，具有高靈敏度、高選擇性、無損以及可實時快速檢測等優(yōu)勢，在環(huán)境污染物即時檢測領(lǐng)域備受關(guān)注[9-11]。目前， SERS 傳感器用于環(huán)境分析的常規(guī)方式是將納米材料與樣本共孵育后進行檢測，該方法雖然簡單，但是極易受到環(huán)境基質(zhì)的干擾，從而影響SERS 信號的重現(xiàn)性和準確性[12]。為了有效解決該問題，常需要采用復(fù)雜的樣品前處理步驟，由于需要多步操作，容易產(chǎn)生假陽性和假陰性結(jié)果[13]。

電分離技術(shù)是一種利用外加電場實現(xiàn)分析物有效分離的方法，具有可精準調(diào)控和綠色環(huán)保等特點[14-15]。結(jié)合SERS 和電分離各自的優(yōu)點，有望實現(xiàn)復(fù)雜樣品中痕量組分的精準檢測。目前，文獻報道的對于農(nóng)藥的SERS 檢測中的常規(guī)預(yù)濃縮過程通常耗時且復(fù)雜，并且大多只能在特定條件下使用[16]。電動捕獲（Electrokinetic trapping， EKT）提供了一種通過靜電力將帶電分子驅(qū)動至SERS 基底的新策略[17-18]。Lacharmoise 等[19]利用外加電場實現(xiàn)了染料分子的選擇性吸附和SERS 檢測，靈敏度為500 nmol/L。Li 等[20]利用電沉積法制備Ag-SPE 電極，并用于苯胺和苯酚衍生物的電富集SERS 分析，檢測時間小于5 min。但是，目前電富集-SERS 技術(shù)也面臨一些亟待解決的問題，如樣品用量大、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差、檢測靈敏度低等，構(gòu)建分離/富集-檢測一體化裝置是解決該問題的關(guān)鍵。

本研究以絲網(wǎng)印刷碳電極（Screen-printed carbon electrode， SPCE）為載體，采用電化學(xué)還原一步法制備了還原氧化石墨烯和金納米顆粒復(fù)合物（Gold nanoparticles-reduced graphene oxide， Au-RGO）負載的SPCE 芯片，結(jié)合EKT 的特異捕獲和SERS 的多組分同時檢出的優(yōu)勢，可實現(xiàn)對多種荷電農(nóng)藥的原位選擇性分離和高效富集，利用Au-RGO 的信號放大作用，實現(xiàn)痕量農(nóng)藥的高靈敏SERS 檢測。與文獻報道的分析方法相比[21-22]，本方法利用EKT 可精準調(diào)控荷電分子的吸附行為，實現(xiàn)亞nmol/L 級農(nóng)藥的快速篩查。將EKT 和SERS 技術(shù)相結(jié)合，可實現(xiàn)在一滴水樣中多種農(nóng)藥殘留的同時檢測，有效降低了假陽性和假陰性的發(fā)生率，為現(xiàn)場監(jiān)測提供了準確可靠的分析技術(shù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

FEI-Sirion 200 場發(fā)射掃描電子顯微鏡（美國FEI 電子光學(xué)公司）；BWS415-785S 便攜式拉曼光譜儀（美國必達泰克公司）；CHI 660D 電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；UV2600 紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；DS-1 高速組織搗碎機（上海標本模型廠）；Milli-Q 超純水凈化系統(tǒng)（上海泰坦科技股份有限公司）。

HAuCl4·3H2O、Na2HPO4、NaH2PO4、K3Fe（CN）6、H3BO3、H3PO4、氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）粉末和冰醋酸（阿拉丁試劑（上海）有限公司）；孔雀石綠（Malachite green， Mal）、蘇丹紅Ⅲ（Sudanred Ⅲ， SR）、甲基對硫磷（Methyl-parathion， Mep）、西瑪津（Simazine， Sim）、殺草強（Amitrole， Ami）、馬拉硫磷（Malathion， Mal）、3，5-二氯苯酚（3，5-Dichlorophenol， 3，5-DCP）、4-硝基-1H-吡唑-3-甲酸（4-Nitro-1H-pyrazole-3-carboxylic acid， 4-NPC）、4-硝基苯基膦酸二鈉（Disodium 4-nitrophenylphosphonate，4-NPP）和4-膦酰基丁酸三乙酯（4-Phosphonylbutyrate triethyl ester， 4-PPB）均為分析純試劑（分子結(jié)構(gòu)見電子版文后支持信息圖S1），購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。110 型絲網(wǎng)印刷電極（SPCE，西班牙Metrohm DropSens 公司）的工作電極和對電極均為碳，參比電極為Ag/AgCl。實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

準確稱取適量農(nóng)藥標準品，加入5 mL 無水乙醇，西瑪津和殺草強用Britton-Robinson 緩沖液（pH=5.0±0.5）定容至50 mL， 甲基對硫磷和馬拉硫磷用Britton-Robinson 緩沖液（pH=9.0±0.5）定容至50 mL，得到1 mg/L 的農(nóng)藥標準溶液。避光冷藏保存，使用時稀釋至所需濃度。

1.2 實驗方法

1.2.1 電沉積液的制備

將4 mg GO 粉末分散在4 mL 超純水中，超聲2 h， 逐滴加入80 μL HAuCl4 溶液（0.5 mg/mL），常溫條件下攪拌5 min， 制得電化學(xué)沉積液。

1.2.2 Au-RGO@SPCE 電極的制備

將SPCE 在超純水中超聲清洗3 min， 氮氣吹干。將SPCE 工作區(qū)域完全浸入0.5 mol/L H2SO4 中，在–1.0 ～ +1.0 V 電位范圍內(nèi)循環(huán)伏安掃描直至得到較穩(wěn)定的電化學(xué)信號，用超純水沖洗， N2 吹干后備用。

將預(yù)處理好的SPCE 電極浸入制備的電沉積液中，在–1.5 ～ +0.6 V 電位范圍內(nèi)循環(huán)伏安掃描20 圈（掃描速度50 mV/s）后，用超純水沖洗， N2 吹干，即得Au-RGO@SPCE。為了進一步比較， 將電沉積液替換為1 mg/mL GO 或0.5 mg/mL HAuCl4，采用同樣的方法制備RGO@SPCE 或Au@SPCE。

1.2.3 荷電分析物的EKT-SERS分析

以乙醇-水（1∶1， V/V）為溶液稀釋液，采用分級稀釋法配制不同濃度的農(nóng)藥溶液。為了實現(xiàn)正電荷分析物（ Mal、Ami 和Sim）的選擇性分離， 將20 μL 含有不同濃度正電荷分析物的溶液滴加到Au-RGO@SPCE 上恒壓處理5 min， 電壓為?0.15 V （vs. Ag/AgCl）；用于富集負電荷分析物（SR、Mep 和Mal）時，將20 μL 含不同濃度負電荷分析物的溶液滴加到Au-RGO@SPCE 上，在+0.15 V （vs. Ag/AgCl）下恒壓處理5 min，采用超純水沖洗電極表面， N2 吹干后進行SERS 分析。測試條件如下：785 nm 激光（10 mW）， 積分時間35 s， 放大倍數(shù)/數(shù)值孔徑為10×/0.25 的顯微物鏡聚焦。

1.2.4 實際樣品分析

蘋果、橙子和蔬菜購自本地超市。將果皮切成1 cm×1 cm 大小，用組織搗碎機勻漿處理，準確稱取勻漿1.0 g 于10 mL 離心管中，加入5 mL 無水乙醇，渦旋振蕩2 min， 以4500 r/min 離心5 min， 取2 mL 上清液用0.22 μm 濾膜過濾，濾液用Britton-Robinson 緩沖液（pH=5.0±0.5 或pH=9.0±0.5）定容至10 mL，隨后進行SERS 測試。對于添加回收實驗，移取10 μL 不同濃度的農(nóng)藥標準溶液，滴加在1 cm×1 cm 的果皮表面，在室溫下自然晾干，后續(xù)處理與上述方法相同。

2 結(jié)果與討論

2.1 Au-RGO@SPCE的制備與表征

制備的RGO@SPCE、Au@SPCE 和Au-RGO@SPCE 的掃描電鏡（SEM）圖如圖1A～1C 所示，可見電極表面沉積了多層褶皺狀RGO 及高密度金納米顆粒（Gold nanoparticles， AuNPs）結(jié)構(gòu)， AuNPs 粒徑在10～30 nm 之間。如圖1D 所示， GO、RGO 和Au-RGO 在1300 和1600 cm–1 處均出現(xiàn)明顯的拉曼位移，分別對應(yīng)石墨烯結(jié)構(gòu)的D 帶和G 帶，其中， Au-RGO 中RGO 的D/G 的強度（ID/IG=1.9）最大，表明GO 已被還原為RGO[23]。采用電化學(xué)阻抗譜進一步研究了Au-RGO@SPCE 的界面特性。如圖1E 所示， Au-RGO 修飾SPCE 的電荷轉(zhuǎn)移電阻（Charge transfer resistance， Rct）最小，這可能是由于RGO 和AuNPs 具有良好導(dǎo)電性能[24]。X 射線光電子能譜（電子版文后支持信息圖S2A～S2C）顯示， AuNPs 已成功負載在RGO 表面。此外，由X 射線光電子能譜（圖1F）的高分辨C1s 譜可見， RGO 導(dǎo)致285.7 eV 的C—N 峰強度增加，并且286.1 eV 處C—OH 峰強度明顯降低，這主要歸因于GO 轉(zhuǎn)變?yōu)镽GO[25]。紫外-可見吸收光譜（見電子版文后支持信息圖S3）顯示， Au-RGO@SPCE 在245 和520 nm 處具有明顯的吸收峰，分別歸屬于C=C 鍵的π → π *躍遷[ 26]和AuNPs 的表面等離子共振信號[ 27]。以上結(jié)果表明，已成功制備Au-RGO@SPCE 材料。

2.2 Au-RGO@SPCE的電分離/富集-SERS性能研究

考察了沉積循環(huán)圈數(shù)、HAuCl4 濃度和掃描速率對Au-RGO@SPCE 的SERS 性能的影響（電子版文后支持信息圖S4 和S5），結(jié)果表明，循環(huán)掃描20 圈、HAuCl4 濃度為60 μmol/L、掃描速率為50 mV/s 時，MG 在795 cm–1 處的拉曼信號強度最大。進一步探究了外加電壓對Au-RGO@SPCE 的SERS 性能的影響，結(jié)果見電子版文后支持信息圖S6 和S7。當外加電壓分別為–0.15 V 和+0.15 V （vs. Ag/AgCl）時， MG和SR 的SERS 信號強度達到最大值。

為了進一步探究富集時間對Au-RGO@SPCE 的SERS 性能影響，測定了不同初始濃度（1000、100 和10 nmol/L）的MG 在不同富集時間時的SERS 光譜。由圖2 可見，隨著富集時間延長， MG 在795 和1365 cm–1 處的的拉曼特征峰強度逐漸增加，約5 min 后達到穩(wěn)定。SR 分子也顯示出相似的結(jié)果（電子版文后支持信息圖S8）。上述結(jié)果表明，在極低的待測物濃度下，通過施加電位可以對荷電分子進行高效分離和富集，從而實現(xiàn)高靈敏度和高特異性檢測。

為了進一步驗證Au-RGO@SPCE 的SERS 性能，選擇Sim、Ami、Mep 和Mal 4 種農(nóng)藥進行測試，結(jié)果如圖3 所示。結(jié)合EKT 和SERS，可實現(xiàn)對4 種農(nóng)藥的高特異性檢測，農(nóng)藥濃度與SERS 特征峰強度呈良好的線性關(guān)系， Sim、Ami、Mep 和Mal 的檢出限分別為2.0、0.6、0.3 和0.8 nmol/L， 此傳感器檢測上述4 種農(nóng)藥的線性范圍和檢出限優(yōu)于文獻報道方法（見電子版文后支持信息表S1）。

2.3 Au-RGO@SPCE的選擇性、重復(fù)性及穩(wěn)定性

為了驗證Au-RGO@SPCE 的選擇性，考察了調(diào)控外加電位對MG 和SR 混合溶液的SERS 譜圖的影響，結(jié)果如圖4 所示。當外加電位為–0.15 V（vs. Ag/AgCl）時，隨著電富集時間延長， MG 的信號逐漸增強；當電位切換為0.15 V （vs. Ag/AgCl）時， MG 的信號逐漸降低，而SR 的信號逐漸增強，這主要歸因于外加電場誘導(dǎo)的荷電分子的選擇性吸附[28]?？疾炝烁蓴_物對于荷電農(nóng)藥SERS 檢測的影響。采用Au-RGO@SPCE 測試混合溶液的SERS 光譜，混合溶液包括帶正電農(nóng)藥及干擾分子（Sim、Sim、4-NPC 和3，5-DCP）、帶負電農(nóng)藥及干擾分子（Mep、Mal、4-PPB 和4-NPP），結(jié)果見電子版文后支持信息圖S9。當外加電壓為–0.15 V （vs. Ag/AgCl）時， Sim（623 和980 cm–1）和Ami（1044 和1289 cm–1）的特征峰清晰可見（電子版文后支持信息表S2 和S3）。類似地，當外加電壓為+0.15 V （vs. Ag/AgCl）時，出現(xiàn)Mep（657 和1351 cm–1）和Mal（1030 和1078 cm–1）的特征峰（電子版文后支持信息表S4 和S5），帶相同電荷的干擾物（4-NPC、3， 5-DCP、4-PPB 和4-NPP）對上述特征峰不產(chǎn)生干擾。

考察了Au-RGO@SPCE 的批內(nèi)和批間信號重現(xiàn)性，在同一個Au-RGO@SPCE 上隨機選取8 個點采集SERS 光譜，如電子版文后支持信息圖S10A 和S10B 所示， 1350 cm–1 的處的拉曼信號強度的相對標準偏差（RSD）為3.97%。在相同條件下，對同一批次的10 個Au-RGO@SPCE 和5 個不同批次Au-RGO@SPCE進行SERS 測試，測定1 μmol/L MG 標準溶液的響應(yīng)信號RSD 分別為5.42%和6.72%（電子版文后支持信息圖S10C 和S10D），表明Au-RGO@SPCE 具有良好的批內(nèi)和批間重現(xiàn)性?？疾炝藘Υ鏁r間對傳感器的SERS 性能的影響， Au-RGO@SPCE 保存5 周后，其SERS 檢測性能變化很?。娮影嫖暮笾С中畔DS10E 和S10F）。上述結(jié)果表明，制備的Au-RGO@SPCE 具有良好的選擇性、重現(xiàn)性和儲存穩(wěn)定性。

2.4 果蔬樣品中多種農(nóng)藥殘留的同時檢測

為了驗證EKT-SERS 方法用于實際樣品中多種農(nóng)藥殘留分析的可行性，采集了Au-RGO@SPCE 檢測不同果蔬樣本的SERS 譜圖。如圖5A 所示，橘子和蔬菜中檢出微量農(nóng)藥殘留。在果蔬樣品中添加不同濃度的Sim（120 ng/cm2）和Sim（80 ng/cm2）， SERS 譜圖顯示出加標農(nóng)藥的特征信號（圖5B）， EKT 處理前后農(nóng)藥的SERS 光譜變化較大（圖5C），同時利用EKT-SERS 方法與GC-MS 方法對加標樣本進行分析，兩種方法檢測結(jié)果的偏差小于10%（圖5D）。上述結(jié)果證明，基于Au-RGO@SPCE 的EKT-SERS 策略可用于實際樣品中多種農(nóng)藥殘留的檢測，結(jié)果準確、可靠。

3 結(jié)論

建立了一種基于Au-RGO@SPCE 的EKT-SERS 的分析新策略，采用電化學(xué)還原一步法制備SERS 基底，利用EKT 技術(shù)的選擇性分離和富集特點，實現(xiàn)了多種荷電農(nóng)藥的原位分離和富集，并利用Au-RGO的信號放大能力，實現(xiàn)了多種痕量農(nóng)藥的高靈敏SERS 檢測。本方法可用于復(fù)雜樣本中農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場快速篩查和精準分析，有望在環(huán)境分析和食品安全領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

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