[摘要]目的探討神經(jīng)肽S受體（neuropeptideSreceptor，NPSR）基因單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）位點(diǎn)（rs323917、rs323920、rs323922、rs2530547、rs324957）與原發(fā)性失眠（primaryinsomnia，PI）的相關(guān)性。方法選取2016年12月至2019年5月在甘肅省人民醫(yī)院睡眠醫(yī)學(xué)中心門(mén)診就診并確診的PI患者157例作為PI組，選取同期133名健康體檢者作為對(duì)照組。抽取受試者的靜脈血標(biāo)本，并提取DNA、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳，目標(biāo)位點(diǎn)測(cè)序?qū)s323917、rs323920、rs323922、rs2530547、rs324957單核苷酸位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，同時(shí)行標(biāo)準(zhǔn)多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)，分析基因多態(tài)性與PI的相關(guān)性。結(jié)果兩組受試者的NPSRSNP位點(diǎn)（rs323917、rs323920、rs323922、rs2530547）基因型分布和等位基因頻率及rs324957等位基因頻率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；rs324957位點(diǎn)基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.034）；兩組受試者不同單倍型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論NPSRrs324957SNP位點(diǎn)基因型表達(dá)或與PI相關(guān)，且以AG基因型為主。

[關(guān)鍵詞]神經(jīng)肽S；原發(fā)性失眠；單核苷酸多肽性

[中圖分類(lèi)號(hào)]R749；R596[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.21.001

StudyonthecorrelationbetweenneuropeptideSreceptorgenepolymorphismandprimaryinsomnia

FANJie1，2，HUIPeilin1，2，MAWei1，2，WANGXubin1，2，ZHAOYuan1，2，WANGJinfeng1，2，CHENXueping1，2，SUXiaoyan1，2，GUOBin1，2，XIEYuping1，2

1.CenterofSleepMedicine，GansuProvincialPeople’sHospital，Lanzhou730000，Gansu，China;2.GansuClinicalSleepMedicineResearch Center，Lanzhou730000，Gansu，China

[Abstract]ObjectiveToinvestigatethecorrelationbetweenneuropeptideSreceptor（NPSR）singlenucleotidepolymorphism（SNP）（rs323917，rs323920，rs323922，rs2530547，rs324957）andprimaryinsomnia（PI）.MethodsAtotalof157patientsdiagnosedwithPIintheoutpatientdepartmentofCenterofSleepMedicine，GansuProvincialPeople’sHospitalfromDecember2016toMay2019wereselectedasPIgroup，and133healthyphysicalexaminationsubjectsduringthesameperiodwereselectedascontrolgroup.VenousbloodsampleswerecollectedandDNA，polymerasechainreaction（PCR）amplificationandagarosegelelectrophoresiswereextracted.rs323917，rs323920，rs323922，rs2530547，rs324957singlenucleotidelociweregenotypizedbytargetsitesequencing.Meanwhile，standardpolysomnosismonitoringwasperformedtoanalyzethecorrelationbetweengenepolymorphismandPI.ResultsTherewerenosignificantdifferencesinthegenotypedistributionofNPSRSNPsites（rs323917，rs323920，rs323922，rs2530547）andallelefrequencyandrs324957allelefrequencybetweentwogroups（P>0.05）.Therewassignificantdifferenceingenotypedistributionofrs324957（P=0.034）.Therewasnosignificantdifferenceinthefrequencyofdifferenthaplotypesbetweentwogroups（P>0.05）.ConclusionTheexpressionofrs324957SNPgenotypesinNPSRmayberelatedtoPI，andAGgenotypeisdominant.

[Keywords]NeuropeptideS;Primaryinsomnia;Singlenucleotidepolymorphism

失眠是一種常見(jiàn)的睡眠障礙，分為原發(fā)性失眠（primaryinsomnia，PI）和繼發(fā)性失眠。PI幾乎以睡眠障礙[難以進(jìn)入睡眠和（或）難以維持或睡眠后精力不能恢復(fù)]為唯一的癥狀，盡管有足夠的睡眠時(shí)間，但仍會(huì)出現(xiàn)睡眠問(wèn)題，并導(dǎo)致至少一種相關(guān)的日間障礙，影響社交、工作或其他重要領(lǐng)域，每周至少發(fā)生3次，持續(xù)時(shí)間>3個(gè)月，并排除由其他心理/精神障礙及軀體疾病、藥物或酒精等導(dǎo)致的失眠[1]。關(guān)于PI的成因，有研究發(fā)現(xiàn)PI患者有家族聚集現(xiàn)象[2]。Beaulieu-Bonneau等[3]對(duì)953例成人患者的調(diào)查顯示，35%的患者至少有一個(gè)一級(jí)親屬曾罹患或正罹患失眠，提示PI具有遺傳特征[4]。神經(jīng)肽S（neuropeptideS，NPS）及神經(jīng)肽S受體（neuropeptideSreceptor，NPSR）是最新發(fā)現(xiàn)的一種睡眠調(diào)節(jié)系統(tǒng)，它們可激活下丘腦后部組胺能、食欲素能神經(jīng)元產(chǎn)生覺(jué)醒，這為深入研究失眠的發(fā)病機(jī)制提供新的思路[5-6]。

本研究通過(guò)選擇NPSR基因的5個(gè)標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）位點(diǎn)rs323917、rs323920、rs323922、rs324957及rs2530547進(jìn)行基因分型，探討PI與基因多態(tài)性的關(guān)系，為PI診斷和治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年12月至2019年5月在甘肅省人民醫(yī)院睡眠醫(yī)學(xué)中心門(mén)診就診并確診的PI患者157例作為PI組，選擇年齡、性別與PI組相匹配且保證兩組間無(wú)血緣關(guān)系的133名健康體檢者作為對(duì)照組。對(duì)兩組受試者進(jìn)行紅外線(xiàn)音視頻同步記錄整夜多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)（audioandvideopolysomnosis，AV-PSG），受試者監(jiān)測(cè)當(dāng)晚不服用睡眠藥物，按平時(shí)作息時(shí)間進(jìn)入監(jiān)測(cè)室，整夜多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)（polysomnosis，PSG）記錄的時(shí)間不低于7h。多導(dǎo)睡眠圖指標(biāo)包括清醒期（W期）、非快速眼動(dòng)1期（N1期）、非快速眼動(dòng)2期（N2期）、非快速眼動(dòng)3期（N3期）、快速眼動(dòng)期（R期）。本研究經(jīng)甘肅省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)（倫理審批號(hào)：syll20150043）。所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》[1]第5版的PI診斷標(biāo)準(zhǔn)，至少滿(mǎn)足以下1項(xiàng)：a.入睡困難；b.維持睡眠困難，表現(xiàn)為頻繁覺(jué)醒或醒后難以入睡；c.早醒且不能再入睡。②每周睡眠困難≥3次。③失眠不是因某種物質(zhì)（如濫用毒品、藥物）等導(dǎo)致的生理效應(yīng)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①由其他原因引起的繼發(fā)性失眠，尤其是根據(jù)《中國(guó)失眠癥診斷和治療指南》[7]鑒別排除焦慮障礙所致失眠；②有其他嚴(yán)重軀體疾病者，如高血壓病、心臟病、甲狀腺功能異常、糖尿病等；③有其他明確的失眠原因，如近期有重大心理應(yīng)激而致失眠者；④不適合量表評(píng)估的低齡和高齡人群；⑤PSG結(jié)果為主觀(guān)性失眠患者；⑥PSG結(jié)果呼吸暫停低通氣指數(shù)（apnea-hypopneaindex，AHI）>15次/h者；⑦有與國(guó)外種族聯(lián)姻家族史者；⑧未簽署知情同意書(shū)者。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡、性別與PI組相匹配正常人群；②兩組間無(wú)血緣關(guān)系。

1.2方法

1.2.1SNP位點(diǎn)的選擇從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI）SNP數(shù)據(jù)庫(kù)及HapMap計(jì)劃選擇NPSR基因功能性SNP。納入標(biāo)準(zhǔn)：①外顯子區(qū)能改變氨基酸表達(dá)，在中國(guó)人群中最小等位基因頻率>5%；②在非翻譯區(qū)，中國(guó)人群中最小等位基因頻率>5%；③在5'啟動(dòng)子2kb內(nèi)，中國(guó)人群中最小等位基因頻率>5%。共得到13個(gè)標(biāo)簽SNP，本研究選擇5個(gè)標(biāo)簽SNP位點(diǎn)。

1.2.2標(biāo)本采集和DNA提取采集受試者外周靜脈血2ml用以提取DNA。

1.2.3引物設(shè)計(jì)及合成5個(gè)SNP位點(diǎn)的引物序列5個(gè)SNP位點(diǎn)的引物序列見(jiàn)表1。

1.2.4聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）擴(kuò)增目的片段將擴(kuò)增產(chǎn)物送往博淼生物科技（北京）有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用chromas軟件進(jìn)行分析處理。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，比較采用c2檢驗(yàn)；采用SHEsis軟件在線(xiàn)檢測(cè)基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡（Hardy-Weinbergequilibrium，HWE）檢驗(yàn)，單倍型分析及連鎖不平衡檢驗(yàn)分析5個(gè)標(biāo)簽SNP是否具有獨(dú)立代表意義；行×列表c2檢驗(yàn)比較組間單個(gè)基因型及等位基因頻率。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組受試者的一般資料比較

兩組受試者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（bodymassindex，BMI）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；睡眠效率、總睡眠時(shí)間、睡眠持續(xù)時(shí)間、睡眠覺(jué)醒次數(shù)、N1期占比、N2期占比、N3期占比、R期占比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見(jiàn)表2。

2.2HWE檢驗(yàn)

本研究所選取的5個(gè)標(biāo)簽SNP位點(diǎn)已在HapMap中國(guó)漢族人群基因數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行連鎖不平衡篩查，為防止偏倚，對(duì)入選的5個(gè)標(biāo)簽SNP再次進(jìn)行HWE檢驗(yàn)，結(jié)果顯示P>0.05，5個(gè)SNP位點(diǎn)基因型符合HWE，樣本具有群體代表性。

2.3兩組受試者的5個(gè)SNP位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布

兩組受試者的rs323917、rs323920、rs323922、rs2530547位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率及rs324957等位基因頻率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；rs324957位點(diǎn)基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.034）；兩組受試者不同單倍型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表3。

2.45個(gè)SNP位點(diǎn)連鎖不平衡檢驗(yàn)分析

應(yīng)用基于最大似然算法的SHEsis軟件進(jìn)行連鎖不平衡檢驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)由rs323920-rs323922構(gòu)成的單倍型高度連鎖（D'>0.9，r2>0.8），見(jiàn)圖1和圖2。

2.5兩組受試者的5個(gè)SNP位點(diǎn)組成的常見(jiàn)單倍型頻率比較

同樣應(yīng)用基于最大似然算法的SHEsis軟件進(jìn)行單倍型推斷，比較兩組受試者不同單倍型頻率的差異。兩組受試者5個(gè)標(biāo)簽SNP位點(diǎn)組成的常見(jiàn)單倍型（單倍型頻率>5%）有7種，P>0.05，見(jiàn)表4。

3討論

NPS是一種新型的20種氨基酸肽，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌組織中表達(dá)，NPS與NPSR特異性結(jié)合，是一種G蛋白偶聯(lián)受體[8]。NPSR前體mRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，包括大鼠的運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)、梨狀皮質(zhì)、前嗅核、丘腦、下丘腦、杏仁核及海馬結(jié)構(gòu)下托復(fù)合體等[9]。NPSR的廣泛分布暗示NPS-NPSR系統(tǒng)在多種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[10]。動(dòng)物研究表明，NPS-NPSR系統(tǒng)具有明顯的促覺(jué)醒作用，主要表現(xiàn)為延長(zhǎng)睡眠潛伏期、減少覺(jué)醒向慢波睡眠的轉(zhuǎn)換次數(shù)、相應(yīng)增加覺(jué)醒時(shí)間、縮短慢波睡眠和快速眼動(dòng)睡眠時(shí)間[11-12]。研究表明將NPS輸注到雙側(cè)前下丘腦，包括腹外側(cè)視前區(qū)（ventrolateralpreopticarea，VLPO）可顯著增加清醒發(fā)作的持續(xù)時(shí)間，并特別減少非快速眼動(dòng)睡眠，這表明NPS通過(guò)抑制VLPO中促進(jìn)睡眠的神經(jīng)元誘導(dǎo)清醒[13]。NPSR的基因突變抑制嚙齒類(lèi)動(dòng)物的睡眠，然而，睡眠需求依然存在，這些動(dòng)物沒(méi)有表現(xiàn)出與睡眠障礙相關(guān)的記憶障礙[14]。以上結(jié)果表明NPS的促醒作用在不同物種之間是一致的。總之，基于NPS-NPSR與睡眠相關(guān)性基礎(chǔ)研究結(jié)論已較為一致，但關(guān)于NPSR基因研究較少，目前關(guān)于研究多態(tài)性位點(diǎn)與PI的致病機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一定論，少量研究顯示NPSR基因的突變可導(dǎo)致人類(lèi)原發(fā)性失眠，SNP變異導(dǎo)致人類(lèi)睡眠變化[15]。以往研究證明遺傳因素是睡眠障礙的主要因素之一；雙胞胎研究表明睡眠特征和失眠有遺傳基礎(chǔ)[17]；PI患者的一級(jí)親屬患失眠的風(fēng)險(xiǎn)增加6.65倍[16-17]；成人自我報(bào)告睡眠時(shí)間和失眠的遺傳率分別為0.25%～0.44%和0.22%～0.59%[18-19]。盡管有證據(jù)表明存在相當(dāng)大的遺傳成分（遺傳率為38%～59%），但迄今為止，只有少數(shù)遺傳基因座可調(diào)節(jié)失眠的風(fēng)險(xiǎn)[20]。針對(duì)失眠主訴（n=113006）的全基因組關(guān)聯(lián)研究證明其多基因結(jié)構(gòu)，并涉及3個(gè)全基因組顯著性基因座和7個(gè)基因[21-22]。

本研究團(tuán)隊(duì)前期關(guān)于NPSR基因多態(tài)性和原發(fā)性失眠之間關(guān)聯(lián)的研究結(jié)果表明，兩種不同的等位基因組合（CATGTC和GCCAAT）可能是原發(fā)性失眠的致病因素[23]。NPS基因多態(tài)性rs323920位點(diǎn)和rs324957位點(diǎn)可能是原發(fā)性失眠的易感基因位點(diǎn)，NPSR-SNP位點(diǎn)CACGGTCCCCAGC單倍型組合為原發(fā)性失眠人群的危險(xiǎn)基因[24]；而筆者通過(guò)對(duì)NPSR基因的5個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)4個(gè)位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率及rs324957等位基因頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但rs324957基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在PI患者中rs324957位點(diǎn)基因型以AG型為主，因此NPSR基因rs324957位點(diǎn)多態(tài)性可能與PI具有相關(guān)性，即本研究進(jìn)一步證實(shí)NPSR基因多態(tài)性rs324957與漢族PI的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)NPSR基因多態(tài)性rs324957的等位基因和基因型頻率分布在PI組與對(duì)照組之間及兩組不同性別間的顯著差異，支持rs324957SNP是PI易感位點(diǎn)的假設(shè)。

綜上所述，本研究在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NPSR基因多態(tài)性SNP位點(diǎn)rs324957與PI之間的相關(guān)性，但仍需高質(zhì)量、大樣本量的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。未來(lái)通過(guò)增加樣本量對(duì)NPSR基因位點(diǎn)進(jìn)行篩選及研究，有望進(jìn)一步豐富PI發(fā)生機(jī)制與基因多態(tài)性之間的關(guān)系，從而指導(dǎo)臨床。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 美國(guó)精神醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì).精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)[M].5版.張道龍譯.北京：北京大學(xué)出版社，2014.

[2] STEINMB，MCCARTHYMJ，CHENCY，etal.Genome-wideanalysisofinsomniadisorder[J].MolPsychiatry，2018，3（11）：2238–2250.

[3] BEAULIEU-BONNEAUS，LEBLANCM，MéRETTEC，etal.Familyhistoryofinsomniainapopulation-basedsample[J].Sleep，2007，30（12）：1739–1745.

[4] WATSONNF，GOLDBERGJ，ARGUELLESL，etal.Geneticandenvironmentalinfluencesoninsomnia，daytimesleepinessandobesityintwins[J].Sleep，2006，29（5）：645–649.

[5] XUYL，REINSCHEIDRK，HUITRON-RESENDIZS，etal.NeuropeptideS：Aneuropeptidepromotingarousalandanxiolytic-likeeffects[J].Neuron，2004，43（4）：487–497.

[6] 侯一平，王燦，謝宇平，等.神經(jīng)肽S對(duì)睡眠覺(jué)醒的調(diào)節(jié)[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2014，40（4）：79–85，92.

[7] 中國(guó)睡眠研究會(huì).中國(guó)失眠癥診斷和治療指南[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2017，97（24）：1844–1856.

• XINGL，ZOUX，YINC，etal.DiverserolesofpontineNPS-expressingneuronsinsleepregulation[J].ProcNatlAcadSciUSA，2024，121（9）：e2320276121.
• SHENYC，SUNX，LIL，etal.Rolesofneuropeptidesinsleep-wakeregulation[J].IntJMolSci，2022，23（9）：4599.
• SHAOYF，WANGC，XIEJF，etal.NeuropeptideSamelioratesolfactoryspatialmemoryimpairmentinducedbyscopolamineandMK801throughactivationofcognatereceptor-expressingneuronsinthesubiculumcomplex[J].BrainStructFunct，2016，221：3327–3336.
• CASELLOSM，F(xiàn)LORESRJ，YARURHE，etal.Neuropeptidesystemregulationofprefrontalcortexcircuitry：Implicationsforneuropsychiatricdisorders[J].FrontNeuralCircuits，2022，16：796443.
• ZHAOP，SHAOYF，ZHANGM，etal.NeuropeptideSpromoteswakefulnessthroughactivationoftheposteriorhypothalamichistaminergicandorexinergicneurons[J].Neuroscience，2012，207：218–226.
• CHAUVEAUF，CLAVERIED，LARDANTE，etal.NeuropeptideSpromoteswakefulnessthroughtheinhibitionofsleep-promotingventrolateralpreopticnucleusneurons[J].Sleep，2020，43（1）：zsz189.
• AHNAOUA，DRINKENBURGWH.Neuropeptide-Sevokedarousalwithelectroencephalogramslow-wavecompensatorydriveinrats[J].Neuropsychobiology，2012，65（4）：195–205.
• SPADAJ，SANDERC，BURKHARDTR，etal.GeneticassociationofobjectivesleepphenotypeswithafunctionalpolymorphismintheneuropeptideSreceptorgene[J].PLoSOne，2014，9（6）：e98789.
• EHLENJC，JONESKA，PINCKNEYL，etal.MaternalUbe3alossdisruptssleephomeostasisbutleavescircadianrhythmicitylargelyintact[J].JNeurosci，2015，35：13587–13598.
• TICKB，BOLTONP，HAPPEF，etal.Heritabilityofautismspectrumdisorders：AMeta-analysisoftwinstudies[J].JChildPsycholPsychiatry，2016，57：585–595.
• LINDMJ，PHILIPRG.Geneticpathwaystoinsomnia[J].BrainSci，2016，6（4）：64.
• YAMAZAKIEM，GOELN.Geneticsofcircadianandsleepmeasuresinadults：Implicationsforsleepmedicine[J].CurrSleepMedRep，2020，6（1）：32–45.