摘要：為明確2023年齊齊哈爾市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心甜瓜栽培基地的甜瓜幼苗莖基腐病的發(fā)病原因，篩選出對其具有高毒力的植物源殺菌劑，采用組織分離法對發(fā)病莖基部的甜瓜幼苗進(jìn)行病原菌的分離。得到兩株病原真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)及ITS-rDNA分子鑒定，分別為Fusarium oxysporum和Fusarium nirenbergiae。致病性試驗(yàn)表明兩株鐮孢菌都能夠侵染甜瓜幼苗莖部，導(dǎo)致莖基腐病的發(fā)生。5種植物源殺菌劑對兩株病原真菌的菌絲生長抑制和毒力測定試驗(yàn)結(jié)果表明，20%丁子香酚、0.5%苦參堿和2.1%丁子·香芹酚的所有有效濃度對兩種致病菌的菌絲生長抑制率均能達(dá)到30%以上。20%丁子香酚、0.5%苦參堿、0.5%小檗堿、2.1%丁子·香芹酚、80%乙蒜素對F.oxysporum的EC₅0值分別為9.413，21.497，36.670，48.342和48.575 mg·L^-1；對F.nirenbergiae的EC₅0值分別為13.768，14.697，43.260，32.475和34.158 mg·L^-1。綜合分析表明，5種植物源殺菌劑中，20%丁子香酚對甜瓜莖基腐病致病菌的毒力最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：甜瓜；鐮孢菌；莖基腐病；植物源殺菌劑

收稿日期：2024-03-01

基金項(xiàng)目：黑龍江省省屬本科高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)科研項(xiàng)目（145309327）；齊齊哈爾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目。

第一作者：齊澤錚（1999-），男，碩士研究生，從事甜瓜病害研究。E-mail：2651462975@qq.com。

通信作者：王芳（1981-），女，博士，副教授，從事植物抗病性研究。E-mail：wangfangnd@hotmail.com。

甜瓜（Cucumis melo L．）又名香瓜，是人們生活中最為常見的園藝作物，其口感清脆，氣味香甜，富含大量碳水化合物及營養(yǎng)物質(zhì)，在我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有十分重要的地位。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations）統(tǒng)計(jì)顯示，我國甜瓜生產(chǎn)面積與產(chǎn)量常年居世界首位。齊齊哈爾地區(qū)甜瓜栽培歷史悠久，具有得天獨(dú)厚的地理優(yōu)勢以及優(yōu)良的種植技術(shù)，甜瓜已成為齊齊哈爾市的主要經(jīng)濟(jì)作物^[1]。但隨著種植面積的擴(kuò)大，甜瓜枯萎病、根腐病、霜霉病等種植中的常見病害日益嚴(yán)重。其中由鐮孢菌屬真菌侵染引起的病害對甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)影響最大，嚴(yán)重影響了齊齊哈爾地區(qū)甜瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

化學(xué)殺菌劑效果好、見效快，因此施用化學(xué)殺菌劑仍是目前控制鐮孢菌病害最普遍的方法。苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇、咪鮮胺能顯著抑制尖孢鐮刀菌西瓜?；停‵usarium oxysporum f.sp. niveum）菌株的生長。平均EC₅0分別為1.099 1，0.456 7和0.049 2 μg·mL^-1[2]。咪鮮胺、戊唑醇和氟硅唑能抑制甜瓜枯萎病致病菌擬輪枝鐮刀菌（Fusarium verticillioides）的生長，EC₅0值分別為0.029 5，0.146 7和0.190 1 μg·mL^-1，病害防治試驗(yàn)中，0.144 μg·mL^-1的咪鮮胺對甜瓜枯萎病的防效達(dá)82.88%^[3]。但化學(xué)殺菌劑的長期使用已嚴(yán)重打破生態(tài)平衡。植物源殺菌劑是從植物的根、莖、葉、果實(shí)等部位提取的有效成分，經(jīng)過一定的加工方法制成具有殺菌作用的生物農(nóng)藥，對病原菌具有較強(qiáng)的抑制或殺死作用，且低毒、低殘留，施用后能夠降解，不會嚴(yán)重污染環(huán)境，在病害防治研究中得到了推廣和應(yīng)用^[4]。已有研究表明肉桂精油和姜黃油能有效抑制尖孢鐮刀菌黃瓜專化型的菌絲生長，EC₅0分別為140.20和514.88 μg·mL^-1[5]?？蒈峥勺饔糜趘elet家族蛋白，改變西瓜枯萎病菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并抑制其毒素產(chǎn)生、菌絲生長及孢子萌發(fā)等^[6]。

齊齊哈爾市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心連年栽培種植的甜瓜幼苗發(fā)生莖基腐病，幼苗根莖腐爛，維管束變褐，造成了甜瓜幼苗的萎蔫甚至死亡，田間發(fā)病率達(dá)20%。為明確該病的病因，預(yù)防病害的發(fā)生，本研究對發(fā)病甜瓜幼苗進(jìn)行病原菌的分離與鑒定。并對5種常用植物源殺菌劑苦參堿、丁子香酚、丁子·香芹酚、乙蒜素和小檗堿進(jìn)行了致病菌的毒力測定及室內(nèi)藥劑篩選，為甜瓜莖基腐病的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2023年5月，從齊齊哈爾市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心采集具有典型發(fā)病癥狀的甜瓜（密冠8）幼苗作為病樣，進(jìn)行病原菌的分離。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離及形態(tài)學(xué)觀察 采用組織分離法進(jìn)行病原菌分離^[7]。用滅菌剪刀在甜瓜莖基病健交界處剪取3～5 mm的組織塊，置于75%酒精浸泡30 s，再經(jīng)1%的NaClO消毒2 min，最后用滅菌水沖洗3次。將消毒過的病組織置于PDA平板上，于25 ℃恒溫、黑暗培養(yǎng)。待長出菌落后，挑取菌落邊緣的少量菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，進(jìn)一步經(jīng)單孢分離獲得病原菌的純培養(yǎng)物。將純培養(yǎng)物接種于PDA試管中，于4 ℃冰箱中保存。25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，觀察菌落的生長形狀、顏色、氣生菌絲的疏密程度以及分生孢子形態(tài)、大小等結(jié)構(gòu)。

1.2.2 病原菌DNA提取及ITS-rRNA序列擴(kuò)增 采用生工（上海）生物工程有限公司提供的基因組DNA快速抽提試劑盒（真菌）進(jìn)行病菌基因組DNA的提取。以真菌基因組DNA為模板，采用ITS引物ITS1 P和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。CR反應(yīng)體系為：Taq PCR Master Mix 15 μL，總DNA模板2.0 μL，ITS1 2.0 μL，ITS4 2.0 μL，ddH₂O 4.0 μL，反應(yīng)總體積為25 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工（上海）生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 致病性測定 刮取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的病原菌菌絲，置于四層紗布上，使用滅菌水沖洗、過濾獲得孢子懸浮液備用。經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)算，孢子懸浮液濃度為1×10⁷個(gè)·mL^-1。使用1%NaClO對甜瓜種子進(jìn)行消毒，無菌水清洗后曬干，播種于無菌營養(yǎng)土中，溫室培養(yǎng)，待長出第一片真葉時(shí)采用灌根法^[8]進(jìn)行接種。每株幼苗加入20 mL孢子懸浮液，以加入20 mL無菌水為對照。接種7 d后觀察甜瓜幼苗發(fā)病情況。每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)10株幼苗。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 登錄GenBank網(wǎng)站，采用BLAST軟件對測序結(jié)果進(jìn)行同源性比較，以Clustal W進(jìn)行多序列比對后，用MEGA 7.0的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用自舉法（bootstrap）對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行檢驗(yàn)，共1 000次循環(huán)。

1.2.5 殺菌劑室內(nèi)毒力測定 以75%肟菌·戊唑醇水分散顆粒劑（德國拜耳）為化學(xué)對照藥劑，將供試藥劑配制成一定質(zhì)量濃度的母液，繼而稀釋成不同質(zhì)量濃度的藥液（表1）。采用菌絲生長速率法^[9]測定殺菌劑對分離菌株的抑菌作用。將供試菌株接種于PDA平板上，于25 ℃恒溫、黑暗培養(yǎng)7 d后，用打孔器切取直徑5 mm的菌餅，菌絲朝下置于含有系列質(zhì)量濃度殺菌劑的PDA平板中央，以培養(yǎng)基加1 mL無菌水平板為對照，每個(gè)處理重復(fù)4次。

采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算各殺菌劑不同濃度抑菌百分率，比較各藥劑的活性大小。

抑制率（%）=（對照組菌落直徑-藥劑處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-菌餅直徑）×100

將殺菌劑濃度轉(zhuǎn)化為對數(shù)作為橫坐標(biāo)（x），抑制率轉(zhuǎn)化成幾率值作為縱坐標(biāo)（y），利用最小二乘法建立獨(dú)立回歸方程Y=aX+b和相關(guān)系數(shù)r。根據(jù)此方程計(jì)算出藥劑的有效抑制中濃度EC₅0（mg·L^-1），即幾率值為5，抑制率為50%。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 對計(jì)算得出的結(jié)果用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離及形態(tài)學(xué)觀察

從發(fā)生腐爛的幼苗莖基部（圖1）分離獲得兩株代表性真菌，分別編號為TGF-2和TGJ-12。分別接種于PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7 d后，對菌 落正反面進(jìn)行觀察，TGF-2菌落呈圓形，正反面均為白色。氣生菌絲茂密緊致，緊貼培養(yǎng)基生長（圖2A）。產(chǎn)孢量較少，分生孢子呈腎形，小分生孢子有0～2個(gè)隔膜，大分生孢子有3～4個(gè)隔膜（圖2B）；TGJ-12菌落呈圓形，有紫色色素產(chǎn)生，中心呈深紫色，邊緣為淡紫色，菌絲茂密蓬松（圖2C）。產(chǎn)孢量較多，分生孢子體積較小，小分生孢子呈卵形，有0～2個(gè)隔膜，大分生孢子前端稍尖，有3～5個(gè)隔膜（圖2D）。

2.2 病原菌分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用ITS引物對靶標(biāo)基因序列擴(kuò)增，得到目的片段序列。測序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST分析比對，使用Mega 7.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株TGF-2與Fusarium oxysporum （KY318502）聚在同一分支，TGJ-12與Fusarium nirenbergiae （MW016585）聚在同一分支，因此將菌株TGF-2鑒定為Fusarium oxysporum，將菌株TGJ-12鑒定為Fusarium nirenbergiae。

2.3 病原菌致病性測定

病原菌接種7 d后，觀察甜瓜幼苗發(fā)病情況。與對照相比（圖4A），接種TGF-2和TGJ-12孢子懸浮液的甜瓜幼苗莖基部枯萎腐爛和變黑，葉片出現(xiàn)萎蔫。其中，接種TGF-2孢子懸浮液的部分甜瓜幼苗枯萎死亡（圖4B），接種TGJ-12孢子懸浮液的幼苗全部萎蔫致死（圖4C）。結(jié)果表明，兩株鐮孢菌均能侵染甜瓜幼苗，導(dǎo)致病害發(fā)生，但兩株鐮孢菌的致病能力不同，TGJ-12的致病性要強(qiáng)于TGF-2。

2.4 殺菌劑室內(nèi)毒力測定

不同稀釋濃度的6種殺菌劑均能顯著抑制兩種鐮孢菌菌絲的生長。根據(jù)供試殺菌劑的有效濃度及對兩種鐮孢菌的抑菌率求得6種殺菌劑的毒力回歸方程及EC₅0。由表2可知，6種殺菌劑中對TGF-2毒力最好的為20%丁子香酚，其EC₅0值為9.413 mg·L^-1。其次為75%肟菌·戊唑醇、0.5%苦參堿、0.5%小檗堿、2.1%丁子·香芹酚，EC₅0值分別為15.555，21.497，36.670和48.342 mg·L^-1。EC₅0值最大的為80%乙蒜素，達(dá)到48.575 mg·L^-1。說明20%丁子香酚對TGF-2的抑制效果最好，80%乙蒜素對TGF-2的抑制效果最差。

6種殺菌劑中對TGJ-12毒力最好的為75%肟菌·戊唑醇，其EC₅0值為4.129 mg·L^-1，其次為20%丁子香酚、0.5%苦參堿、2.1%丁子·香芹酚、80%乙蒜素，EC₅0值分別為13.768，14.697，32.475和34.158 mg·L^-1。EC₅0值最大的為0.5%小檗堿，達(dá)到43.260 mg·L^-1。說明75%肟菌·戊唑醇對TGJ-12的抑制效果最好，而0.5%小檗堿對TGJ-12的抑制效果最差。

3 討論

鐮孢菌屬（Fusarium）真菌在自然界中分布廣泛，是世界范圍內(nèi)最具破壞性的土傳病原真菌之一，可以引起植物、動物和人類的疾病^[10]。鐮孢菌屬具有腐生性和致病性成員^[11-12]，在病原真菌分離過程中經(jīng)常遇到鐮孢菌菌株。致病性菌株能夠在150多種主要經(jīng)濟(jì)作物中引起嚴(yán)重的病害，其中包括西瓜、甜瓜、小麥等^[13]。受侵染的植株會表現(xiàn)出如萎蔫、壞死、落葉、維管束系統(tǒng)變褐等癥狀。每年由不同種鐮孢菌引起的病害對不同作物造成的減產(chǎn)約為30%～80%，甚至更多^[14-15]。近年來，由鐮孢菌導(dǎo)致的多種植物莖基腐病頻繁發(fā)生。假禾谷鐮孢菌（F.pseudograminearum）侵染小麥導(dǎo)致莖基腐；擬輪枝鐮孢菌（F.verticillioides）侵染旱黃瓜引起莖基腐；尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、木賊鐮孢菌（F.equiseti）、茄腐鐮刀菌（F.solani）等多種鐮孢菌單一或聯(lián)合侵染引起百香果莖基腐^[16-18]。本研究從發(fā)生莖基腐病的甜瓜幼苗莖基部分離、純化獲得兩株代表性真菌TGF-2及TGJ-12。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，TGF-2為F.oxysporum，TGJ-12為F.nirenbergiae。病原菌致病性試驗(yàn)證明兩株鐮孢菌均能引起甜瓜幼苗莖基部的腐爛壞死與維管束變褐。F.oxysporum在十大真菌病原體中排在第五位。寄主廣泛，可侵染多種植物，引起枯萎病、根腐病等病害。目前，常以施用化學(xué)殺菌劑、輪作、分子育種等方式對其引起的病害進(jìn)行防治^[19]。F.nirenbergiae能侵染復(fù)葉槭、百香果等植物引起枯萎病。研究表明咪鮮胺及多菌靈對其菌絲生長有較好的抑制效果，EC₅0為0.049 2和0.626 6 μg·mL^-1[20]。

植物源殺菌劑的天然抑菌活性物質(zhì)均源自植物，對病原菌的生長起到顯著的抑制作用，降低對環(huán)境的污染以及對人類健康的危害^[21]。對羊肚菌子實(shí)體爛柄病的致病菌鐮孢菌（Fusarium spp.）毒力測定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)0.3%苦參堿、0.3%丁子香酚及6%春雷霉素的濃度為1 mg·L^-1時(shí)，對鐮孢菌菌絲生長的抑制率分別達(dá)到76.74%、52.33%和52.33%，結(jié)果表明植物源殺菌劑能夠抑制羊肚菌子實(shí)體爛柄病的致病菌鐮孢菌的生長^[22]。使用丁子香酚、5%香芹酚、20%乙蒜素、0.5%小檗堿和1.3%苦參堿對蘋果樹腐爛病菌（Valsa mail）的毒力測定結(jié)果表明，所使用的植物源殺菌劑對蘋果樹腐爛病病原菌也能夠起到抑制作用^[23]。植物源殺菌劑在由鐮孢菌引起的莖基腐病的防治中也得到了廣泛研究。對小麥莖基腐病的病原菌假禾谷鐮孢菌的毒力測定試驗(yàn)表明，厚樸酚、香芹酚、牛至油等八種植物源殺菌劑均能有效抑制禾谷鐮孢菌的生長，且都能夠減輕病害的發(fā)生^[24]。

本研究中使用的5種植物源殺菌劑在TGF-2的毒力測定試驗(yàn)中，20%丁子香酚的EC₅0值最低且低于作為陽性對照的75%肟菌·戊唑醇。在對TGJ-12的毒力測定試驗(yàn)中，5種植物源殺菌劑的EC₅0值均高于作為陽性對照的75%肟菌·戊唑醇，其中EC₅0值最低的也為20%丁子香酚。綜合結(jié)果表明在5種植物源殺菌劑中20%丁子香酚對甜瓜莖腐病的兩種致病鐮孢菌均能起到最好的抑制效果。但本研究未探究20%丁子香酚對甜瓜莖基腐病的影響，因此后續(xù)仍需補(bǔ)充盆栽防治試驗(yàn)驗(yàn)證20%丁子香酚的防治能力并對其抑菌機(jī)理進(jìn)行探究。

4 結(jié)論

本研究從發(fā)生莖基腐病的甜瓜幼苗根莖組織中分離得到兩株真菌，經(jīng)鑒定分別為F.oxysporum和F.nirenbergiae。致病性試驗(yàn)表明兩種鐮孢菌均能侵染甜瓜導(dǎo)致莖基腐病的發(fā)生。在5種植物源殺菌劑對兩種致病菌的毒力測定試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，20%丁子香酚對F.oxysporum和F.nirenbergiae的EC₅0值最低，分別為9.413和13.768 mg·L^-1，表明20%丁子香酚對致病菌的毒力最強(qiáng)。本研究旨在為防治甜瓜莖基腐病高效植物源殺菌劑的選擇提供理論依據(jù)。

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Identification of Pathogens Causing Muskmelon Stem

Basal Rot and Screening of Botanical Fungicides

QI Zezheng¹， YU Lu¹， GUO Xuyu¹， KANG Yue¹， ZHANG Chao²， LIU Xiujie²， WANG Fang¹

（1.College of Life Sciences and Agroforestry， Qiqihar University/Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Resistance Gene Engineering and Protection of Biodiversity in Cold Areas， Qiqihar 161006， China; 2. Qiqihar Agricultural Technology Extension Center， Qiqihar 161006， China）

Abstract：In 2023， stem basal rot disease of muskmelon seedlings was found in the muskmelon cultivation base of Qiqihar Agricultural Technology Extension Center. In order to identify the cause of the disease and screen out effective botanical fungicides with high virulence against pathogens， tissue separation method was used to isolate the pathogens from infected stem. Two pathogenic fungi were and purified from diseased seedlings， and were identified as Fusarium oxysporum and Fusarium nirenbergiae by morphological characteristic and ITS-rDNA sequences. Pathogenicity experiments showed that both strains can infect melon seedlings， leading to the occurrence of stem rot disease. Five plant botanical fungicides were accessed the inhibition on the mycelial growth and the toxicity to two fungi. The results showed that all effective concentrations of 20% eugenol， 0.5% matrine and 2.1% carvacrol can inhibit the hyphae growth of two pathogens by more than 30%. The EC₅0 values of 20% eugenol， 0.5% matrine， 0.5% berberine， 2.1% eugenol， and 80% allicin for F.oxysporum were 9.413， 21.497， 36.670， 48.342 and 48.575 mg·L^-1， respectively. The EC₅0 values for" F.nirenbergiae were 13.768， 14.697， 43.260， 32.475 and 34.158 mg·L^-1， respectively. It indicates that among the five botanical fungicides， 20% eugenol has the strongest virulence against the pathogens of musk melon stem basal rot disease.

Keywords：melon; Fusarium; stem basal rot; botanical fungicides