摘要：目的 研究經(jīng)方四逆湯對A549肺癌干細胞增殖及凋亡的影響。方法 利用無血清懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)A549肺癌干細胞，檢測標志物CD133陽性率，驗證細胞干性。分別用不同劑量四逆湯含藥血清（10%、20%）干預(yù)A549肺癌干細胞。CCK-8、流式細胞檢測四逆湯干預(yù)后對A549肺癌干細胞增殖及凋亡能力的影響。通過qPCR檢測四逆湯干預(yù)后對A549肺癌干細胞增殖及凋亡能力的影響。結(jié)果 經(jīng)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞球CD133陽性率為（82.3667±0.47258）%，明顯高于肺癌細胞組（P<0.05）；經(jīng)CCK-8檢測四逆湯干預(yù)的肺癌干細胞組在48、72h時吸光值較對照組均顯著降低（P<0.05），四逆湯干預(yù)的肺癌干細胞凋亡率較對照組顯著升高（P<0.05）；四逆湯含藥血清可顯著降低A549肺癌干細胞PCNA、Ki67和Bcl-2 mRNA水平（P<0.05），顯著升高肺癌干細胞Bax mRNA水平（P<0.05）。結(jié)論 四逆湯能抑制A549肺癌干細胞增殖并促進其凋亡。

關(guān)鍵詞：四逆湯；肺癌干細胞；增殖；凋亡

中圖分類號：R734.2 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2024）07-0062-06

肺癌作為惡性腫瘤之首，其發(fā)病率、死亡率居高不下，針對肺癌的研究任重而道遠。肺癌干細胞（lung cancer stem cells，LCSCs）的提出是肺癌研究的一個新突破口。肺癌干細胞是肺癌組織內(nèi)未分化的細胞亞群，具有自我更新、分化的能力，被認為是肺癌母細胞，是肺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥的源頭，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［1-2］。從肺癌干細胞入手，從根本治療肺癌，是肺癌治療的方向。中醫(yī)藥在腫瘤干細胞領(lǐng)域的研究也取得了一定的成績，多項研究表面，中醫(yī)藥能有效抑制腫瘤干細胞的分化增殖，是肺癌干細胞研究的熱點［3-4］。張仲景《傷寒論》所載四逆湯，是扶陽代表方，有回陽救逆之效。陽虛寒凝是肺癌產(chǎn)生的重要病機之一，臨床以四逆湯治療中晚期肺癌取得了良好療效；多項研究表明，四逆湯能減輕患者癌痛、抑制癌癥轉(zhuǎn)移、減低化療耐藥性、提高肺癌晚期患者的生存質(zhì)量等作用［5-9］。本研究以四逆湯含藥血清干預(yù)肺癌干細胞，觀察其對肺癌干細胞增殖、凋亡的影響，為肺癌以陽虛論治提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑及耗材 四逆湯由附子、干姜、甘草組成，昆明市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供；實驗所需動物家兔購買于湖南太平洋生物有限公司；細胞系A(chǔ)549人肺癌細胞、胎牛血清、F-12K培養(yǎng)基購自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司；纖維細胞生長因子（FGF）購自賽默飛世爾科技公司，重組人表皮生長因子（EGF）購自上海生工生物公司；CCK-8試劑盒購自日本DOJINDO公司；anti-human CD133購自Biolegend生物公司。

1.2 四逆湯含藥血清制備 四逆湯組將熬好的中藥，按照1.5 g/kg灌胃兔子，每天2次，連續(xù)3 d，末次給藥一小時后處死取血?？瞻捉M灌胃兔子相同體積生理鹽水，每天2次，連續(xù)3 d，末次給藥1 h后處死取血，收集空白組全血和中藥血清組全血，低速離心后分離出上層血清，56℃水浴鍋中滅活30min，0.22um的濾膜過濾除菌，分裝至-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人肺癌 A549 細胞株的干細胞誘導(dǎo) 將A549細胞株培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期的 A549 細胞，用無血清干細胞培養(yǎng)基（DMEM 培養(yǎng)基+胰島素（4U/L）+B27（1X）+EGF（20 ng/mL）+bFGF20ng/mL）懸浮培養(yǎng)，以利于干細胞球的形成。隔 1～2 d更換培養(yǎng)基，2周后可見腫瘤細胞球形成，傳代用于后續(xù)實驗。

1.4 流式檢測 CD133 的表達 將誘導(dǎo)前后的細胞離心去上清，PBS清洗，4%PFA 在4℃下固定4～48h，用10%的二抗同源血清（PBS配置）封閉30 min，離心去上清不用清洗；滴加適當濃度一抗，4℃孵育過夜，PBS清洗3×3min；滴加適當濃度二抗，37℃孵育30 min；上級檢測。

1.5 CCK-8檢測 實驗分3組（空白組細胞、空白血清組、中藥血清組），誘導(dǎo)成功后鋪96孔板，按照實驗分組以10%的血清濃度加入空白血清和中藥血清組培養(yǎng)處理24、48、72h后，每孔加入10ul CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱中孵育2h；酶標儀在450nm波長處檢測每孔的吸光值（A）。細胞活力（%）=［A（實驗組）-A（空白組）］/［A（對照組）-A（空白組）］×100%；細胞抑制率（%）=［A（對照組）-A（實驗組）］/A（對照組）=1-細胞活力。

1.6 流式檢測細胞凋亡 實驗分2組（中藥血清組、空白血清組），誘導(dǎo)成功后按照實驗分組以10%的血清濃度加入空白血清和中藥血清組培養(yǎng)處理1h，收集細胞，加PBS洗兩遍，取300ul 預(yù)冷的1×Binding Buffer 重懸細胞，每管各加入5 ul Annexin V-FITC 和 10ul PI，輕微混勻后，室溫避光孵育10 min，再向每管中加入200ul預(yù)冷的1×Binding Buffer，混勻后上流式儀檢測。

1.7 實時熒光定量PCR（qRT-PCR） 通過添加TriQuick Reagent總RNA提取試劑（Solarbio，北京，中國）從細胞提取總RNA。用One Step SuperRT-PCR Mix Kit（Solarbio，北京，中國）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后，qPCR使用2×SYBR Green qPCR Master Mix（High ROX）（Servicebio，武漢，中國）在StepOnePlus real-time PCR system（Applied Biosystems，Thermo Fisher Scientific，Inc.）上進行。GAPDH作為標準化對照。引物（上海捷瑞生物工程有限公司）序列見表1。

1.8 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有實驗重復(fù)3次，定量結(jié)果采用均數(shù)±標準差（x±s）表示。2組之間定量數(shù)值比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間定量數(shù)值比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤干細胞誘導(dǎo)結(jié)果 通過無血清懸浮培養(yǎng)A549細胞14天，誘導(dǎo)肺癌干細胞形成。通過電子顯微鏡觀察細胞成球情況，經(jīng)流式檢測CD133的表達情況。結(jié)果顯示細胞成球情況良好（圖1A）。此外，如A549細胞CD133陽性率為（0.8467±0.23116）%，A549肺癌干細胞CD133陽性率為（82.3667±0.47258）%，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。無血清培養(yǎng)的細胞球CD133陽性率明顯高于A549肺癌細胞，證實A549肺癌干細胞誘導(dǎo)成功。

2.2 四逆湯含藥血清對A549肺癌干細胞增殖的影響 進一步通過CCK-8檢測了不同劑量四逆湯含藥血清干預(yù)A549肺癌干細胞24、48、72h后細胞增殖活性。如圖2所示，四逆湯作用于肺癌干細胞48、72h后肺癌干細胞的吸光度值顯著降低（P<0.05），細胞存活率降低。其中，10%四逆湯含藥血清組干預(yù)24、48、72h對肺癌干細胞的抑制率分別為2.64、22.72、18.06、20%四逆湯含藥血清組干預(yù)24、48、72h對肺癌干細胞的抑制率分別為11.18、30.93、26.81%。以上結(jié)果表明，四逆湯能顯著抑制肺癌干細胞增殖。

2.3 四逆湯含藥血清對A549肺癌干細胞凋亡的影響 不同劑量四逆湯含藥血清干預(yù)A549肺癌干細胞72h后通過流式細胞儀檢測了細胞凋亡。結(jié)果見圖3，其中對照組細胞凋亡率為（5.81±2.68）%，10%四逆湯含藥血清組細胞凋亡率為（14.88±0.37）%，20%四逆湯含藥血清組細胞凋亡率為（20.46±0.05）%。與對照組相比，10%四逆湯含藥血清組和20%四逆湯含藥血清組細胞凋亡率均顯著上升（P<0.05）。以上結(jié)果表明，四逆湯含藥血清明顯促進了A549肺癌干細胞的凋亡。

2.4 四逆湯含藥血清對A549肺癌干細胞增殖相關(guān)基因PCNA、Ki67 mRNA的影響 通過qPCR檢測了各組細胞PCNA、Ki67 mRNA水平，結(jié)果見圖4。與對照組相比，10%四逆湯含藥血清組和20%四逆湯含藥血清組細胞PCNA、Ki67 mRNA水平均顯著下降（P<0.05）。

2.5 四逆湯含藥血清對A549肺癌干細胞凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2 mRNA的影響 通過qPCR檢測了各組細胞Bax、Bcl-2 mRNA水平，結(jié)果見圖5。與對照組相比，10%四逆湯含藥血清組和20%四逆湯含藥血清組細胞Bax mRNA水平均顯著上升（P<0.05）而Bcl-2 mRNA水平均顯著下降（P<0.05）。

3 討論

肺癌發(fā)生率逐年上升，隨著醫(yī)學技術(shù)的不斷發(fā)展，放化療、手術(shù)切術(shù)、靶向治療等治療技術(shù)也日益成熟，然肺癌的死亡率居高不下，轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)率高仍是肺癌治療的難點。肺癌干細胞被認為是肺癌轉(zhuǎn)移、耐藥及復(fù)發(fā)的元兇，數(shù)量很少的肺癌干細胞即可分化產(chǎn)生大量特異性的腫瘤細胞并構(gòu)成高度異質(zhì)性的腫瘤組織［10-14］，即使手術(shù)切除了大部分腫瘤組織，殘留的少量肺癌AD8RFI+T44ECvIxt4wAQR3YVOoSyl8IFFAlM5bS5d4A=干細胞仍會繼續(xù)分化。針對肺癌干細胞的治療是提高肺癌治療成功率的關(guān)鍵。

中醫(yī)學對干細胞的認識主要參雜在精氣學說、五行學說、藏象學說等理論中。精氣作為宇宙萬物的本原，是人體化生精氣的基本物質(zhì)與原動力，是人體進行各項生命活動的基礎(chǔ)，《素問.金匱真言論》中記載：“夫精者，身之本也”，《靈樞.本神》也認為“生之來者，謂之精”，而《素問.上古天真論》云：“腎者主水，受五臟六腑之精而藏之”，《難經(jīng)》述：“十二經(jīng)脈者，皆系于生氣之源，所謂生氣之源者，謂十二經(jīng)脈之根本，謂腎間動氣也。此五臟六腑之本，十二經(jīng)脈之根”。干細胞的特性與先天之精存在一定的相似性，故而認為干細胞是細胞層次上的先天之精，因此，可將正常人體干細胞認為腎中之精氣。正常狀態(tài)下，腎中精氣維持著人體各項生命活動的正常運行，而當腎中精氣虧虛，陰陽失衡，正常干細胞受到抑制，或突變?yōu)楫惓８杉毎?，而異常細胞過度增生，便導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生和演變。因此，我們認為腎中精氣虧虛與腫瘤干細胞的產(chǎn)生可能有密切的關(guān)系，尤其是腎陽虧虛，是腫瘤晚期的主要病理機制。扶助腎中陽氣可能是通過抑制腫瘤干細胞的增殖、分化從而達到抗腫瘤的目的［15］。

四逆湯由附子、干姜、甘草組成。方中附子大辛大熱，溫壯元陽，破散陰寒，回陽救逆，為君藥；干姜，入心、脾、肺經(jīng)，溫中散寒，助陽通脈，為臣藥；炙甘草益氣補中，以治虛寒之本，緩和干姜、附子峻烈之性，調(diào)和藥性，使藥力持久，故為佐使藥。臨床上運用四逆湯溫補腎陽之效，治療晚期肺癌陽虛寒凝證效果顯著；大量臨床研究也表明四逆湯能改善肺癌患者臨床癥狀、提高免疫力、降低腫瘤標記物水平［16-17］；也有大量學者研究顯示四逆湯能促進惡性腫瘤細胞凋亡。

而本研究結(jié)果顯示，普通A549肺癌干細胞在無血清培養(yǎng)條件下，大部分細胞凋亡，而只有其中的干細胞可在無血清培養(yǎng)條件下成球貼壁生長，這些存活的細胞進一步培養(yǎng)成球后檢測CD133標記物明顯高于普通A459肺癌細胞，從而進一步確定了成球細胞的干性。而經(jīng)四逆湯含藥血清干預(yù)的肺癌干細胞增殖力明顯減弱、凋亡率明顯增加。此外，四逆湯含藥血清可顯著降低A549肺癌干細胞PCNA、Ki67和Bcl-2 mRNA水平，顯著升高肺癌干細胞Bax mRNA水平。因此可證實四逆湯可以抑制A549肺癌干細胞的增殖、促進其凋亡，從而達到抑癌的目的。此研究結(jié)果為中醫(yī)臨床“扶陽抑癌”理論提供了科學依據(jù)。

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