周亞茹 肖凱 張愛冬 吳雪霞

doi：10.7606/j.issn.1004-1389.2024.07.011

https：//doi.org/10.7606/j.issn.1004-1389.2024.07.011

收稿日期：2023-06-16? 修回日期：2023-08-04

基金項目：國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術體系項目（CARS-25）。

第一作者：周亞茹，女，碩士研究生，研究方向為分子遺傳育種。E-mail：yaruzhou153@163.com

通信作者：吳雪霞，女，博士，研究員，研究方向為分子遺傳育種。E-mail：wuxuexiarose@sohu.com

摘? 要? WRKY轉錄因子在各種生理過程和逆境反應中發(fā)揮重要作用，為了探究茄子轉錄因子 SmeWRKY53抗逆性，對 SmeWRKY53的啟動子元件進行預測分析，運用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測 SmeWRKY53在不同非生物脅迫中表達量的變化，通過遺傳轉化在茄子中過表達 SmeWRKY53，并對過表達茄子苗期耐鹽性進行鑒定。啟動子元件預測分析結果顯示，該基因啟動子序列不僅有啟動子基本轉錄元件，還含有TC-rich repeats、CGTCA-motif、TGACG-motif等與脅迫相關的抗逆元件。實時熒光定量（qRT-PCR）結果顯示 SmeWRKY53能夠響應高溫、低溫、干旱以及鹽脅迫處理，且在鹽脅迫條件下可以被顯著誘導。在茄子中過表達 SmeWRKY53可以提高植株的耐鹽能力。生理指標檢測表明，鹽脅迫條件下，過表達植株體內(nèi)丙二醛（MDA）含量積累顯著低于對照。同時過表達植株細胞內(nèi)脯氨酸、可溶性蛋白的含量和抗氧化酶［過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶活（POD）］的活性顯著高于對照植株。對鹽脅迫相關基因（ SmeSOS1、 SmeCIPK3 和 SmeNHX1）的表達檢測發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫處理顯著誘導了相關基因（ SmeSOS1、 SmeCIPK3 和 SmeNHX1）的表達，且過表達植株中的表達顯著高于對照。這些結果表明茄子 SmeWRKY53能正調(diào)控提高茄子對鹽脅迫的耐受性，對后續(xù)研究 SmeWRKY53基因在茄子耐鹽脅迫中的分子機制提供了理論依據(jù)。

關鍵詞? 茄子；轉錄因子； SmeWRKY53；非生物脅迫；耐鹽性

茄子為茄科茄屬一年生植物，起源于亞洲東南熱帶地區(qū)［1］，是世界范圍內(nèi)廣泛種植的重要的經(jīng)濟蔬菜［2］。在低溫、高溫、干旱和鹽脅迫等逆境條件下，茄子的生長和產(chǎn)量會受到嚴重的損害。茄子作為喜溫型蔬菜，35? ℃以上高溫時茄子生長發(fā)育的各個階段都會受到高溫脅迫影響［3］。低溫脅迫下茄子產(chǎn)量和品質(zhì)會受到嚴重的影響［4］。干旱也是影響茄子發(fā)育的一個重要原因，在干旱條件下茄子植株發(fā)育不良，易形成短柱花使果實發(fā)育受阻，果形小而且沒有光澤［5］。

鹽脅迫是世界范圍內(nèi)最有害的非生物脅迫之一，通過影響細胞生長和代謝過程來損害植物的生產(chǎn)力，對種子萌發(fā)、幼苗生長和作物產(chǎn)量造成不可逆的損害［6］，嚴重限制了植物生長。設施栽培條件下的連作以及化肥肥料的過度使用使得土壤鹽漬化情況越來越嚴重，對農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)造成重大損失［7］。挖掘耐鹽基因是提高植株耐鹽性，選育耐鹽品種的有效手段。

在大多數(shù)真核植物中，轉錄因子家族（WRKY、MADS-box和MYB）激活獨特的細胞水平的非生物和生物脅迫響應策略，被認為是防御和發(fā)育過程的關鍵決定因素［8］。據(jù)報道，一些轉錄因子在植物對鹽脅迫的響應中發(fā)揮核心作用。在馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)過表達NAC轉錄因子 StNAC053提高擬南芥耐鹽耐旱性［9］。秋葵中在鹽脅迫下轉錄因子 AeNAC83基因顯著上調(diào)，在擬南芥中過表達 AeNAC83基因發(fā)現(xiàn)，過表達的擬南芥植株耐鹽性有很大的提高［10］。番茄中轉錄因子 SlWRKY3的表達受外界鹽脅迫誘導，且過表達番茄轉基因株系具有更高的耐鹽性［11］。蕎麥中的 FtMYB9在擬南芥中異源過表達會大大增強擬南芥耐鹽性［12］。另外已有研究發(fā)現(xiàn)轉錄因子 SmERF1在茄子鹽脅迫中起正向調(diào)節(jié)作用，通過對 SmERF1的沉默顯著增強了植物對鹽脅迫的敏感性并下調(diào)了鹽脅迫防御相關標記基因［13］。

在本研究中，鹽脅迫處理可以顯著誘導轉錄因子 SmeWRK53的表達。通過基因過表達對 SmeWRKY53的功能進行驗證，通過表型觀測、生理指標和相關基因表達檢測結果表明過表達 SmeWRKY53增強了植株的耐鹽能力，該基因可以正向調(diào)控茄子耐鹽性。

1? 材料與方法

1.1? 植物材料

供試茄子品種‘卜麗卡由上海市農(nóng)科院設施園藝所提供。

1.2? 試驗方法

1.2.1? SmeWRKY53基因啟動子序列的獲得以及順式作用元件分析? 利用茄子基因數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http：//eggplant.kazusa.or.jp/）下載茄子基因組，提取 SmeWRKY53基因5端上游2 000 bp序列作為啟動子序列，然后在PlantCARE數(shù)據(jù)庫中（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行順式作用元件預測分析。

1.2.2? 茄子幼苗非生物脅迫處理? 挑選飽滿均勻的‘卜麗卡茄子種子播入發(fā)芽盒中，28? ℃暗處理催芽，待露白后轉入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為溫度26 ℃，光照度4 000 lx，光照時間12 h，相對濕度為65%。待長出真葉后移栽至轉入營養(yǎng)缽中，培養(yǎng)條件同上。植株長至4～5片真葉時進行低溫、高溫、干旱脅迫和鹽脅迫處理。

低溫脅迫處理時，培養(yǎng)條件為溫度4 ℃，光照度4 000 lx，光照時間12 h，相對濕度為65%；高溫脅迫處理時，培養(yǎng)條件為溫度45 ℃，光照度? 4 000 lx，光照時間12 h，相對濕度為65%；干旱脅迫處理時，用含15%的PEG6000的營養(yǎng)液澆灌幼苗，培養(yǎng)條件為溫度26 ℃，光照度4 000 lx，光照時間12 h，相對濕度為65%；鹽脅迫處理時，營養(yǎng)液中NaCl的濃度為150 mmol/L，培養(yǎng)條件為溫度26 ℃，光照度4 000 lx，光照時間12 h，相對濕度為65%。

不同脅迫處理均于處理后0 h、0.5 h、1 h、? 2 h、3 h、6 h、12 h和24 h取苗子葉片進行檢測。

1.2.3? 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）? 樣品總RNA的提取以及cDNA第一條鏈的合成植物RNA提取試劑盒和cDNA反轉錄試劑盒（均購于艾克瑞生物工程有限公司），操作按說明書進行。以cDNA為模板， EF1α作為內(nèi)參，使用2×Taq SYBR Green qPCR Premix（購自諾唯贊生物科技股份有限公司）檢測 SmeWRKY53在茄子葉片中的表達量。在 qPCR 儀（BIO-RAD CFX96）設置反應程序 ：95 ℃ 30 s ；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)；95 ℃ 15 s ；60 ℃ 60 s ；? 95 ℃ 15 s。各樣品 3 次重復，2-△△Ct采用文獻［14］公式計算基因相對表達水平。所用引物如表1? 所示。

1.2.4? 轉基因茄子（SmeWRKY53-OE）的獲得? 以茄子葉片cDNA為模板，PCR擴增? SmeWRKY53? CDS序列，將擴增產(chǎn)物連接至pCambia2301，并轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。重組質(zhì)粒驗證后轉化根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞。通過農(nóng)桿菌侵染下胚軸，獲得 SmeWRKY53過表達T0代植株。

1.2.5? 過表達茄子鹽脅迫處理以及生理指標檢測? 將轉基因（T1）和野生型茄子種子平鋪于發(fā)芽盒，操作同“1.2.2”。待苗子長至4～5片真葉分別挑選生長狀態(tài)一致的轉基因及野生型植株，提取其RNA并反轉錄為第一鏈cDNA進行實時熒光定量PCR驗證 SmeWRKY53的表達量。對陽性轉基因植株和WT植株進行鹽脅迫處理，使用200 mmol/L? NaCl連續(xù)灌溉兩周，分別于處理后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和14 d取樣，每個時間點將所取樣品進行混樣檢測生理指標，每次試驗3次重復。丙二醛（MDA）含量、蛋白含量、脯氨酸含量及過氧化物酶（CAT）和過氧化氫酶（POD）活性測定試劑盒均于蘇州科銘生物技術有限公司購買，檢測方法參考試劑盒說明書。

2? 結果與分析

2.1? SmeWRKY53基因啟動子序列元件分析

利用PlantCARE在線數(shù)據(jù)庫對 SmeWRKY53基因啟動子元件進行預測，結果顯示（表2）， SmeWRKY53啟動子除有啟動子基本轉錄元件TATA-box外，還有一個防御和應激反應的順式作用元件TC-rich repeats以及6個參與茉莉酸反應的順式作用元件， SmeWRKY53啟動子中順式作用元件如圖1所示。

2.2? 轉錄因子SmeWRKY53在非生物脅迫下的表達模式分析

通過RT-qPCR分別檢測 SmeWRKY53在高溫、低溫、鹽脅迫以及干旱脅迫下的表達動態(tài)。結果表明（圖2），低溫脅迫處理后， SmeWRKY53的表達量在前3 h變化不明顯，到6 h時顯著升高，6 h之后 SmeWRKY53表達量逐漸下降；高溫脅迫處理后， SmeWRKY53的表達量前6 h變化不明顯，在12 h時表達量最高，隨后 SmeWRKY53的表達量逐漸下降；干旱脅迫處理后， SmeWRKY53的表達量無明顯變化；鹽脅迫處理后，1 h可檢測到 SmeWRKY53表達量的顯著升高，在1 h后 SmeWRKY53的表達量明顯下降。以上結果表明 SmeWRKY53在茄子中能夠響應低溫、高溫、干旱以及鹽脅迫，推測其可能在茄子遭受非生物脅迫時發(fā)揮轉錄調(diào)控作用。

2.3? ?SmeWRKY53過表達茄子植株的鑒定

通過克隆質(zhì)粒上的片段來驗證陽性植株（圖3）并且通過實時定量PCR（qRT-PCR）來驗證陽性植株的 SmeWRKY53的表達量（圖4）。共得到 SmeWRKY53過表達陽性植株22棵（OE1-OE18）。

2.4? 過表達SmeWRKY53植株鹽脅迫下表型分析

對SmeWRKY53過表達植株進行鹽脅迫處理，使用濃度為200 mmol/L的NaCl溶液連續(xù)灌溉兩周，觀察植株表型。由圖5可知，鹽脅迫處理下均會對過表達和野生型植株造成傷害，野生型‘卜麗卡在鹽脅迫處理后48 h葉片變黃，過表達植株在處理14 d后變黃，與處理0 h相比，野生型植株在14 d鹽脅迫后生長明顯受到限制，而過表達植株在處理14 d后有明顯的成長。

2.5? 鹽脅迫處理SmeWRKY53過表達植株的理化指標分析

通過對鹽脅迫處理后野生型茄子植株和 SmeWRKY53過表達植株的MDA含量、可溶性蛋白含量、過氧化氫酶（CAT）活性、過氧化物酶（POD）活性以及脯氨酸（Pro）含量進行檢測。結果表明，在0 h時過表達植株與野生型的MDA含量無明顯差異，鹽脅迫處理后，MDA的含量總體呈升高趨勢（圖6-A），且野生型植株的MDA含量顯著高于過表達植株。

可溶性蛋白含量測定結果（圖6-B）顯示，未處理時過表達植株的可溶性蛋白顯著高于野生型植株，鹽脅迫處理后過表達植株的可溶性蛋白含量在0～48 h內(nèi)呈降低的趨勢，在48 h～14 d顯著升高。野生型植株的可溶性蛋白含量在0～? 6 h內(nèi)呈上升的趨勢，在12 h～14 d顯著下降。

對CAT和POD活性檢測發(fā)現(xiàn)（圖6-C、圖6-D），未處理時野生型和過表達植株的CAT和POD活性無顯著差異，鹽脅迫處理后0～48 h內(nèi)過表達植株CAT活性逐漸升高，在14 d時顯著下降，野生植株的CAT酶活總體呈下降趨勢，并且在6 h～14 d內(nèi)過表達植株的CAT活性都顯著高于野生型；POD活性在野生型植株中呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在過表達植株中POD活性呈上升趨勢，在14 d時活性達到最高。脯氨酸含量檢測結果顯示（圖6-E），過表達植株脯氨酸含量在0 h～12 h逐漸上升，在12 h～48 h有所下降，48 h～14 d呈上升趨勢，在14 d時達到最大值。野生型植株的脯氨酸含量呈先下降后上升的趨勢，在14 d達到峰值。野生型植株的脯氨酸含量在處理期間均顯著低于過表達植株。

2.6? 鹽脅迫相關基因表達量檢測

選取茄子中3個鹽脅迫相關基因 SmeSOS1、 SmeCIPK3和 SmeNHX1，分別檢測其在野生型和過表達植株中鹽脅迫前后的表達量變化。如圖7所示，鹽脅迫處理前，過表達植株中 SmeSOS1、 SmeCIPK3和 SmeNHX1的表達量顯著高于野生型植株。對鹽脅迫處理14 d后的表達分析發(fā)現(xiàn)，野生型植株中 SmeSOS1、 SmeCIPK3和 SmeNHX1的表達量均有明顯升高。過表達植株中 SmeSOS1、 SmeCIPK3和 SmeNHX1的表達量顯著升高，且顯著高于同時期野生型植株。以上結果表明，過表達 SmeWRKY53可以誘導鹽脅迫相關基因的表達。

3? 討 論

WRKY基因家族是高等植物中最大的轉錄因子家族之一。在植物應對生物和非生物脅迫的一些過程中發(fā)揮重要作用［15］。許多研究表明WRKY家族可調(diào)控植物在鹽脅迫下的抗逆性，Bo等［16］發(fā)現(xiàn)水稻中過表達玉米? WRKY114基因降低了水稻耐鹽性。Liang等［17］從菊花中分離并誘導得到轉錄因子 DgWRKY5，通過過表達 DgWRKY5證明過表達菊花的耐鹽性比野生型菊花強。在本研究中，首先對轉錄因子 SmeWRKY53的啟動子進行分析，發(fā)現(xiàn)啟動子序列有一個參與防御和應激反應的順式作用元件TC-rich repeats和多個MeJA反應性的順式作用調(diào)控元件。MeJA作為一種參與植物逆境脅迫反應的激素，可以通過調(diào)節(jié)無機滲透離子或有機滲透劑來抑制有毒離子的吸收，從而對抗?jié)B透脅迫的不利影響［18］。本研究通過使用鹽脅迫處理發(fā)現(xiàn) SmeWRKY53被顯著誘導，表明 SmeWRKY53可能在茄子鹽脅迫反應中發(fā)揮作用。通過過表達 SmeWRKY53可以減緩鹽脅迫下茄子植株的不良反應，證明? SmeWRKY53可能在茄子鹽脅迫反應中的正向調(diào)控作用。

鹽脅迫反應的早期信號包括過量的Na+、細胞內(nèi)鈣離子水平的變化，以及活性氧物質(zhì)（ROS）的積累［19］。有報道表明，轉錄因子? SlMYB102、 PpCAS1和 FcWRKY40可以顯著降低葉片或根中的Na+含量，增加K+/Na+的比率，從而維持這些組織中的離子動態(tài)平衡，提高植物的耐鹽性。植物通常利用Na+轉運蛋白如 SOS1、 NHX1和 HKT1來消除多余的Na+，并在細胞質(zhì)中保持最合適的Na+/K+比率［23］。CBL-CIPK復合體可作用于離子轉運蛋白參與調(diào)節(jié)逆境脅迫下的離子穩(wěn)態(tài)［24］，已有研究表明茄子中CBL1可與CIPK3相互作用響應鹽脅迫［25］。本研究對離子轉運相關基因進行表達分析，發(fā)現(xiàn)過表達植株中 SmeSOS1、和 SmeNHX1表達量顯著高于野生型，并且在鹽脅迫處理后，過表達植株中 SmeSOS1、 SmeCIPK3和 SmeNHX1受到更強烈的誘導表達。

植物在響應鹽脅迫時，往往會在細胞中一些有機分子，如脯氨酸和可溶性蛋白等以維持較高的滲透壓［26］。積累脯氨酸是植物為抵御鹽脅迫而采取的一種保護措施［27］，脯氨酸在滲透調(diào)節(jié)、保護細胞大分子和清除羥基自由基等方面發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫處理后，在 SmeWRKY53過表達植株可以積累更多的脯氨酸來清除活性氧從而提高植株的耐鹽性，并且含有更多的可溶性蛋白以維持滲透壓的平衡。

非生物脅迫可引起脂質(zhì)過氧化，高濃度鹽會導致活性氧（ROS）積累，會損害植物的細胞膜，導致脂質(zhì)過氧化和其他的氧化損傷，進一步導致MDA和H2O2積累［28-29］。MDA的含量可以反映鹽脅迫對植物的傷害程度，本研究中， SmeWRKY53過表達植株中MDA的積累更少，植物的受傷害程度更低。對CAT活性檢測發(fā)現(xiàn)過表達植株中CAT活性更高，CAT可以將H2O2分解為水和氧氣，減少膜脂過氧化，增強植物的抗氧化性從而提高耐鹽性。

4? 結論

茄子中 SmeWRKY53受鹽脅迫的誘導。過表達 SmeWRKY53能增強清除ROS的能力，抑制細胞膜損傷和細胞死亡并且產(chǎn)生更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)提高對鹽脅迫的耐受性，減少鹽脅迫對植株的傷害。該研究不僅有助于了解茄子 SmeWRKY53基因在茄子耐鹽脅迫中的分子機制，而且也為分子育種提供了候選基因。

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Response of Eggplant Transcription Factor?? SmeWRKY53 to Salt Stress

ZHOU Yaru1，XIAO Kai2，ZHANG Aidong2 and WU Xuexia1，2

（1.College of Fisheries and Life Sciences，Shanghai Ocean University，Pudong New Area，Shanghai? 201306，China;

2.Institute of Horticulture，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)engxian District，Shanghai? 201403，China）

Abstract? WRKY transcription factor plays an important role in various physiological processes and stress responses.To explore the stress resistance of eggplant transcription factor?? SmeWRKY53，the promoter elements of?? SmeWRKY53 were predicted and analyzed.Real-time fluorescent quantitative PCR （RT-qPCR） was used to detect the expression changes of?? SmeWRKY53 under different abiotic stresses.? SmeWRKY53 was overexpressed in eggplant through genetic transformation，and the salt tolerance of the overexpressed eggplant at seedling stage was identified.The results of promoter element prediction analysis showed that the promoter sequence of this gene not only contains basic transcriptional elements of promoters，but also contains stress-related elements such as TC-rich repeats，CGTCA-motif and TGACG-motif.Quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR） results showed that?? SmeWRKY53 could respond to high temperature，low temperature，drought and salt stress in eggplant，and could be significantly induced under salt stress.Physiological tests showed that the accumulation of?? malondialdehyde （MDA） in overexpressed plants was significantly lower than that in control under salt stress.Meanwhile，overexpression of?? SmeWRKY53 increased the contents of proline and soluble protein and the activities of antioxidant enzymes （Catalase （CAT） and Peroxidase activity （POD）） to improve the salt tolerance of plants.The expression of salt stress-related genes （SmeSOS1，SmeCIPK3 and SmeNHX1） was detected，and the expression levels of salt stress-related genes （SmeSOS1， SmeCIPK3 and SmeNHX1） in overexpressed plants were significantly increased after salt stress treatment compared with the wild type.These results suggest that eggplant?? SmeWRKY53，as a positive regulator，can improve the tolerance of eggplant to salt stress.

Key words? Eggplant; Transcription factor；? SmeWRKY53; Abiotic stress; Salt tolerance

Received ??2023-06-16??? Returned? 2023-08-04

Foundation item? National Bulk Vegetable Industry Technology System Project （No.CARS-25）.

First author? ZHOU? Yaru，female，master student.Research area：molecular breeding.E-mail：yrzhou153@163.com

Corresponding?? author? WU Xuexia，female，Ph.D，research fellow.Research area：molecular breeding.? E-mail：wuxuexiarose@sohu.com

（責任編輯：潘學燕? Responsible editor：PAN Xueyan）