賈藝凡 趙延存 李朝輝 孫偉波 劉鳳權

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.10.018

摘要：梨黑斑病是梨樹的主要真菌病害之一，可引起葉片早落，降低梨果產(chǎn)量及品質(zhì)，造成巨大經(jīng)濟損失。本研究從各地區(qū)梨園采集病葉病果后進行病原菌分離，基于形態(tài)學觀察和多基因串聯(lián)進化樹構建對分離的病原菌進行鑒定，并進行室內(nèi)藥劑敏感性試驗。結(jié)果表明，從昆明、碭山、成都、貴陽等地采集的樣品中分離鑒定到梨黑斑病菌41株，將其分為4個種，分別為喬木鏈格孢（Alternaria arborescens，3株）、梨黑斑鏈格孢（A. gaisen，1株）、棉鏈格孢（A. gossypina，1株）、鏈格孢（A. alternata，36株）。選取3種鏈格孢進行致病力分析，在翠玉梨葉片、庫爾勒香梨果實上均表現(xiàn)致病性，但致病力存在差異。4種殺菌劑室內(nèi)藥劑敏感性測定結(jié)果表明，3種梨黑斑病菌對咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯均有較好的敏感性，抑制中濃度（EC50值）為0.051 8～10.114 7 mg/L；喬木鏈格孢9-15菌株對嘧菌酯敏感性較好，EC50值為1.533 0 mg/L；喬木鏈格孢8-34、9-53，黑斑鏈格孢9-1，棉鏈格孢8-46對嘧菌酯敏感性較差。明確了3種可引起梨黑斑病的鏈格孢屬真菌特性及其對不同藥劑的敏感性，為后續(xù)藥劑防治提供技術支撐。

關鍵詞：梨黑斑病；鏈格孢；病原菌鑒定；致病力分析；敏感性

中圖分類號：S436.612；S182；S482.2? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）10-0137-08

收稿日期：2023-05-15

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系資助項目（編號：CARS-28）；江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)梨產(chǎn)業(yè)技術體系項目（編號：JATS［2023］049）。

作者簡介：賈藝凡（1990—），女，河北石家莊人，碩士，助理研究員，主要從事果樹病害研究。E-mail：yifanjia123@163.com。

通信作者：劉鳳權，博士，研究員，主要從事植物病害防控研究。E-mail：fqliu20011@sina.com。

我國是世界上最大的梨生產(chǎn)國，根據(jù)聯(lián)合國糧食及國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)，2019年中國梨栽培面積達94.07萬hm2，產(chǎn)量1 731.4萬t（2020年已達1 781.5萬t），占世界梨產(chǎn)量的71.45%。梨黑斑病對于梨樹危害重大，主要侵染果實、葉片和新梢，嚴重時導致葉片皺縮變形焦枯，果實龜裂，葉和果實提前脫落、新梢枯死，在世界各梨產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，給梨產(chǎn)業(yè)造成重大經(jīng)濟損失［1-4］。梨黑斑病于1933年在日本首次由Tanaka報道；1935年，我國首次發(fā)現(xiàn)梨黑斑?。?-6］。梨黑斑病是由鏈格孢（Alternaria sp.）類真菌引起，目前，梨果實上鏈格孢已發(fā)現(xiàn)9個種，我國共發(fā)現(xiàn)其中6個種，即梨黑斑鏈格孢（A. gaisen K.Nagan）、鏈格孢［A. alternata （Fr.） Keissler］、極細鏈格孢（A. tenuissima）、侵染鏈格孢（A. infectoria）、鴨梨侵染鏈格孢（A. yaliinficiens R.G. Roberts）、紫萼鏈格孢（A. ventricosa R.G.Roberts）［7-10］。其中，A. alternata、A. tenuissima和A. infectoria主要生長在植物的枯死部分或衰弱部位上，A. yaliinficiens和 A. ventricosa是由美國生物學家Roberts在2003年和2007年從中國進口的鴨梨樹中分離并鑒別出來的2個新種［11-12］。

引起梨黑斑病的鏈格孢在我國分布較為廣泛，種類多樣，危害嚴重，目前主要依賴化學藥劑進行防治，且存在盲目過量施用現(xiàn)象。本研究比較分析來源不同的3種梨黑斑病菌的遺傳特征、菌落菌體形態(tài)、致病性及對4種殺菌劑的敏感性，旨在為我國梨黑斑病菌的分類、病害監(jiān)測及科學選藥提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 樣品采集及分離純化

2018—2020年，從陜西銅川、江蘇南京、云南昆明、安徽碭山、四川成都、貴州貴陽等10個省份的33個梨園采集100余份病葉與病果，用組織分離法進行樣品分離。用已滅菌手術刀在發(fā)病部位與健康部位交界處切取一小部分組織，每個樣品取3塊，放入75%乙醇中浸泡30 s進行消毒，再用無菌水清洗2次。將清洗后的組織用無菌濾紙按壓至干爽狀態(tài)，將該組織置于新鮮的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，待長出真菌后，從邊緣打孔，將菌絲塊轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基中，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗倒置培養(yǎng)6～9 d。

1.2? 病原菌鑒定

1.2.1? 病原菌形態(tài)學觀察

將菌株純培養(yǎng)后，采用5 mm打孔器在菌落邊緣打出菌塊，放置于PDA培養(yǎng)基平板中，每個處理3個重復，將其倒置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)7 d后，觀察菌落形態(tài)、顏色等特征。利用光學顯微鏡對分生孢子梗和分生孢子形態(tài)特征進行觀察，并對其進行攝影記錄。

1.2.2? 病原菌分子鑒定

1.2.2.1? 病原菌基因組DNA提取

使用T5 Direct PCR Kit（南京擎科生物科技有限公司）提取菌株的DNA，具體操作如下：利用無菌牙簽從菌落邊緣挑取少量菌絲，放入裝有50 μL Lysis Buffer A溶液的離心管內(nèi)，95 ℃加熱10 min（較難裂解的樣品可適當增加裂解時間），12 000 r/min離心1 min，取上清液1～3 μL為模板進行PCR擴增（雜質(zhì)含量較高時，可取適量上清液與等體積的Dilution Buffer B混勻后，取1～3 μL為模板進行PCR擴增）。

1.2.2.2? 病原菌基因組擴增和測序

采用分子鑒定法對得到的菌落進行鑒定。利用特異性引物分別采用聚合酶鏈式反應（PCR）擴增病原菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)核苷酸序列ITS以及翻譯延伸因子TEF1、鏈格孢過敏原基因Alta1、內(nèi)聚半乳糖醛酸酶基因endoPG、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH序列。序列擴增引物見表1。PCR 擴增選用20 μL 體系，包括無菌水8.5 μL，2×Hieff PCR Master Mix 10 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，模板 0.5 μL。PCR 擴增程序：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃補充延伸5 min，ITS、TEF1、Alta1、endoPG、GAPDH擴增的退火溫度分別為52、52、59、54、59 ℃，反應30 s，30個循環(huán)。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳，其中緩沖劑選擇TBE，在140 V下上樣5 μL電泳檢測。將PCR擴增產(chǎn)物送至南京擎科生物科技有限公司進行序列測定，將獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blastn比對（表2）。

1.2.2.3? 多基因系統(tǒng)進化分析

將對比后的基因序列與參考文獻中報道的引物對應的序列，在MAGA 7.0軟件中進行多基因?qū)Ρ确治?，使用最大似然法進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3? 病原菌致病性測定

1.3.1? 葉片刺傷接種

2021年，通過葉片針刺接種測定各菌株的致病性。挑選大小均勻的翠玉梨葉片，噴灑75%乙醇進行表面消毒后，用無菌水漂洗處理，之后用無菌牙簽刺傷葉片，在傷口上接種供試菌株菌餅，設置PDA培養(yǎng)基為空白對照，將葉片放在白色無菌搪瓷盤中，并將無菌脫脂棉浸沾無菌水覆于葉柄上，每個黑斑病菌株設置3個重復，并用保鮮膜封閉保濕。將搪瓷盤放置在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5 d后觀察記錄發(fā)病情況。

1.3.2? 果實有傷接種

2021年，通過果實針刺接種測定各菌株的致病性。選取大小一致的庫爾勒香梨果實，用水將香梨洗凈，再使用75%乙醇噴灑到梨果表面達到消毒的效果，最后用無菌水清洗果面。用無菌牙簽刺傷果面，將菌餅接種于傷口處，每個黑斑病菌株設置3個重復，將接種后的香梨放入無菌保鮮盒中密封，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6 d 后觀察并記錄發(fā)病情況。

病果分級標準：0級，無病斑；1級，病斑直徑≤1.0 cm；2級，病斑直徑1.1～2.0 cm；3級，病斑直徑2.1～3.0 cm；4級，病斑直徑3.1～4.0 cm；5級，病斑直徑≥4.1 cm［18］。

1.4? 梨黑斑病菌對4種常用殺菌劑的室內(nèi)敏感性測定

生長速率法是測定病原真菌對殺菌劑敏感性的常規(guī)方法之一，2021年測定各菌株對梨生產(chǎn)上4種常用殺菌劑的敏感性［19］。4種殺菌劑原藥分別用甲醇溶解，配制母液，然后按照以下各藥劑的終濃度分別添加到液態(tài)的PDA培養(yǎng)基中，快速混勻倒入無菌平皿中，制備各藥劑5個濃度梯度的PDA平皿，即嘧菌酯（10、20、40、80、160 μg/mL）、咪鮮胺（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μg/mL）、苯醚甲環(huán)唑（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μg/mL）、吡唑醚菌酯（0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μg/mL）。每種濃度重復3次，在PDA培養(yǎng)基中加入同等比例的甲醇作為空白對照。在梨黑斑病菌菌落邊緣打孔（直徑5 mm），將菌餅置于已制備好的PDA平板中心，而后放入25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)，6 d后以十字交叉法測量記錄菌落直徑，按照公式（1）計算抑制率。

抑制率=［（對照菌落直徑-0.5）-（處理菌落直徑-0.5）］/（對照菌落直徑-0.5）×100%。（1）

以藥劑濃度的對數(shù)值為自變量，抑制率對應的概率值為因變量，擬合每種殺菌劑對各菌株的毒力回歸方程，計算EC50值及相關系數(shù)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 病原菌的鑒定與基因序列分析

基于菌株的形態(tài)學和5個基因序列（ITS、endoPG、GAPDH、Alta1和TEF1）的特征，將2018—2020年從江蘇省、陜西省、云南省等梨產(chǎn)區(qū)采集的梨黑斑病病樣中分離純化獲得的41個菌株初步鑒定為鏈格孢菌，進一步將每個菌株的5個基因序列串聯(lián)起來，使用MAGA 7.0進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除鑒定到常規(guī)的鏈格孢（A. alternata）36株，還基于多基因串聯(lián)進化樹分析鑒定到喬木鏈格孢（A. arborescens）3株、梨黑斑鏈格孢（A. gaisen）1株、棉鏈格孢（A. gossypina）1株（圖1）。鏈格孢（A. alternata）多生長于植物的干枯和衰弱部位，在我國各梨產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生且已被系統(tǒng)研究，但關于梨黑斑鏈格孢、喬木鏈格孢和棉鏈格孢的研究相對較少，對其生物學特性、致病性及其對不同殺菌性的敏感性、發(fā)生流行的潛在風險缺乏認識［20］。

2.2? 病原菌的分布

從10個省份13個市采集的病害樣品中共分離

鑒定得到41株菌株，其中36株鏈格孢（A. alternata）菌株分別來源于江蘇南京7株、江蘇鎮(zhèn)江1株、陜西銅川4株、陜西咸陽1株、云南昆明1株、四川金川2株、四川成都1株、貴州貴陽1株、安徽碭山5株、山西長治5株、浙江杭州2株、河南商丘3株、河北邢臺3株；3個喬木鏈格孢菌株分別來源于云南昆明2株、安徽碭山1株；1個梨黑斑鏈格孢（A.gaisen）菌株來自四川成都；1個棉鏈格孢（A.gossypina）菌株來自貴州貴陽（表3）。

2.3? 病原菌形態(tài)學特征

2.3.1? 菌落形態(tài)

將3株喬木鏈格孢（8-34、9-15、9-53）、 1株梨黑斑鏈格孢（9-1）、 1株棉鏈格孢（8-46）在PDA固體培養(yǎng)基平皿上培養(yǎng)7 d后發(fā)現(xiàn)，各菌株菌落形態(tài)差異明顯（圖2），其中8-34、9-1 和8-46菌株的菌絲為綠色，9-15和9-53菌株的菌絲為深灰色，均可以產(chǎn)生黑色素；9-15和9-53菌落邊緣呈白色且比較平整，8-34、9-1和8-46菌落邊緣呈灰色波浪狀；9-1和8-46菌落伴有大量白色絨毛狀氣生菌絲；9-15菌株生長最快，8-34菌株生長最慢。

2.3.2? 病原菌在PDA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢表型

從圖3可以看出，3種鏈格孢在PDA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢表型存在一定差異，其中喬木鏈格孢菌株8-34、9-15不產(chǎn)孢；喬木鏈格孢9-53、黑斑鏈格孢9-1、棉鏈格孢8-46均可產(chǎn)生分生孢子，分生孢子著生在氣生菌絲上。喬木鏈格孢9-53產(chǎn)生分生孢子鏈，是在1根分生孢子梗上形成多個樹狀分枝，鏈長 1～11個孢子；梨黑斑鏈格孢9-1形成分生孢子短鏈，這些短鏈能多次分枝且形成在1根分生孢子梗上，鏈長1～4個孢子；棉鏈格孢8-46形成不分枝的分生孢子長鏈，鏈長3～11個孢子。

2.3.3? 分生孢子形態(tài)觀察

3種鏈格孢分生孢子形態(tài)觀察結(jié)果（圖4）顯示，喬木鏈格孢分生孢子橫隔數(shù)為1～4個，縱隔數(shù)為0～1個，主要呈卵形，梨黑斑鏈格孢分生孢子橫隔數(shù)1～4，縱隔數(shù)0～2，主要呈闊倒棒狀或倒梨形，棉鏈格孢分生孢子橫隔數(shù)2～3，縱隔數(shù)1～2，主要呈梨形。

2.4? 病原菌的致病力分析

2.4.1? 病原菌對梨葉的致病力分析

將喬木鏈格孢菌株8-34、9-15、9-53，梨黑斑鏈格孢9-1，棉鏈格孢8-46離體接種于翠玉梨葉片上。從圖5可以看出，病斑為褐色或黑褐色，形態(tài)為圓形斑點，周圍具淡黃色暈圈，拓展后呈近圓形，有時也呈不規(guī)則狀，中間灰褐色，邊緣黑褐色，呈黑斑病的典型癥狀。接種5 d后，喬木鏈格孢8-34致病力最強，病斑直徑為1.06 cm；梨黑斑鏈格孢9-1次之，病斑直徑為0.99 cm。

2.4.2? 病原菌對梨果的致病力分析

將鑒定出的菌株喬木鏈格孢8-34、9-15、9-53，梨黑斑鏈格孢9-1，棉鏈格孢8-46離體接種于庫爾勒香梨果實上，培養(yǎng)6 d后發(fā)現(xiàn)，果面出現(xiàn)淺褐色或黑褐色圓形病斑，病斑略凹陷，果肉軟腐，對照果實未發(fā)病。根據(jù)病情指數(shù)得到的病果分級標準，喬木鏈格孢 8-34病斑直徑為2.1 cm，屬于3級病斑，致病力最強；其他菌株病斑直徑為1.4～1.6 cm，屬于2級病斑，致病力較弱。由于果實病斑為曲面且不規(guī)則，因此為了表示更為準確，柱形圖使用病斑面積（圖6）。

2.5? 梨黑斑病菌對4種常用殺菌劑的敏感性測定結(jié)果

選取生產(chǎn)上4種常用殺菌劑嘧菌酯、咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯，測定5株梨黑斑病菌對藥劑的敏感性（表4）。嘧菌酯對5株黑斑病菌的EC50值分別為332.175 4、1.533 0、127.427 5、24.777 9、140.739 3 μg/mL，其中昆明喬木鏈格孢菌株9-15對嘧菌酯最敏感，昆明喬木鏈格孢菌株8-34對嘧菌酯最不敏感；咪鮮胺對5株黑斑病菌的EC50值分別為0.216 7、0.051 8、1.001 0、0.294 4、0.773 8 μg/mL，其中昆明喬木鏈格孢菌株9-15對咪鮮胺最敏感，碭山喬木鏈格孢菌株9-53對咪鮮胺最不敏感；苯醚甲環(huán)唑?qū)?株黑斑病菌的EC50值分別為0.221 4、0.093 0、0.899 9、0.328 8、0.768 6 μg/mL，其中昆明喬木鏈格孢菌株9-15對苯醚甲環(huán)唑最敏感，碭山喬木鏈格孢菌株9-53對苯醚甲環(huán)唑最不敏感；吡唑醚菌酯對5株黑斑病菌的EC50值分別為0.778 1、0.131 3、10.114 7、0.612 2、1.823 2 μg/mL，其中昆明喬木鏈格孢菌株9-15對吡唑醚菌酯最敏感，碭山喬木鏈格孢菌株9-53對吡唑醚菌酯最不敏感。

結(jié)果表明，昆明喬木鏈格孢菌株9-15對4種殺菌劑都最敏感，昆明喬木鏈格孢菌株8-34、碭山喬木鏈格孢菌株9-53、成都梨黑斑鏈格孢9-1及貴陽棉鏈格孢8-46對嘧菌酯敏感性較差，對咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯敏感性較好。

3? 討論與結(jié)論

梨黑斑病是我國梨樹的主要真菌病害之一，由鏈格孢屬真菌引起，可侵染危害梨樹葉片、果實和新梢，發(fā)病嚴重時影響梨果的品質(zhì)和產(chǎn)量，導致巨大經(jīng)濟損失。目前，梨黑斑病仍是生產(chǎn)上亟待解決的問題。

鏈格孢屬在早期分類系統(tǒng)中屬于半知菌類，在新的分類系統(tǒng)中屬于真菌界子囊菌門座囊菌綱格孢腔菌目格孢腔菌科。初期鏈格孢屬真菌的分類鑒定主要依據(jù)形態(tài)學特征、寄主專一性、分子標記，但這些分類標準存在一些不足。鏈格孢屬的形態(tài)特征隨著營養(yǎng)、溫度、光照、pH值等條件的不同，會發(fā)生變化，因此，不能通過形態(tài)特征來準確鑒定鏈格孢菌的種類［21］。寄主專一性也不能作為分類標準，是因為鏈格孢通常是多種復合侵染，難以判斷寄主范圍和專一性。單個的分子標記在現(xiàn)代分子生物學中應用比較廣泛，可以區(qū)分遺傳距離較遠的鏈格孢種，但無法區(qū)分親緣關系較近的種。2013年，Lawrence等應用gpd、Alt a1、ACT、ATP、CAL等5個核酸蛋白質(zhì)編碼位點，將鏈格孢屬劃分為8個組群［14］。多基因聯(lián)合構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹的精準度高于基于單基因構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，目前在分類研究中被普遍應用［22-23］。本研究通過對5株鏈格孢菌多基因聯(lián)合構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，明確1株屬梨黑斑鏈格孢、3株屬喬木鏈格孢、1株屬棉鏈格孢。采用這分屬3個種的5個菌株接種翠玉梨葉片和庫爾勒香梨果實，結(jié)果均表現(xiàn)致病性。對翠玉葉片，8-34 菌株致病力強，9-1致病力中等，其他菌株致病力較弱；對香梨果實，8-34菌株致病力最強，與葉片致病性測定結(jié)果一致。

在明確致病類型和分類地位的基礎上，測定5株代表性菌株對生產(chǎn)上常用的4種殺菌劑的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來源于昆明的喬木鏈格孢菌株9-15對4種殺菌劑都最敏感，來源于昆明的喬木鏈格孢菌株8-34、碭山的喬木鏈格孢菌株9-53、成都的梨黑斑鏈格孢菌株9-1及貴陽的棉鏈格孢菌株 8-46 對嘧菌酯敏感性較差，對咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯敏感性較好。來自不同地區(qū)分屬于3個種的5株梨黑斑病菌對苯醚甲環(huán)唑均有較好敏感性，EC50值為0.093 0～0.899 9 mg/L，與付余波等的報道［24］一致。各菌株對不同藥劑的敏感性差異可能與菌株的遺傳背景和當?shù)氐臍v史用藥有關。該研究結(jié)果可為梨黑板病菌的分離鑒定和藥劑的科學選擇提供試驗依據(jù)，對4個梨產(chǎn)區(qū)黑斑病的防治具有一定的指導意義。

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