李坤 洪秀杰 王欣悅 齊鵬宇 霍佳慧 于欣卉 商梓琳 畢少杰 王彥杰

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.10.017

摘要：為豐富可用于水稻育秧基質(zhì)防治由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）所引起的水稻立枯病的生防菌資源，從大豆根際土壤中分離得到1株對(duì)尖孢鐮刀菌有拮抗作用的細(xì)菌，對(duì)該菌株分泌的胞外酶與促生能力進(jìn)行了測(cè)定，并進(jìn)行菌種鑒定。同時(shí)，初步研究了該菌株的抑菌譜、對(duì)水稻幼苗的促生作用以及對(duì)水稻立枯病的防治效果。研究結(jié)果表明，菌株TC-52為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），其對(duì)尖孢鐮刀菌抑菌率達(dá)到72.7%，其分泌的上清液和揮發(fā)性氣體都能抑制尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)，并具有廣譜抑菌活性；該菌株能夠分泌蛋白酶、纖維素酶與幾丁質(zhì)酶并具有固氮、產(chǎn)鐵載體與吲哚-3-乙酸（IAA）能力，其IAA產(chǎn)量達(dá)到21.70 μg/mL，耐受最低pH值達(dá)到4.0。與無(wú)菌水浸種處理相比，1.0×106 CFU/mL的菌懸液浸種，水稻胚根的生長(zhǎng)量可提高19%；相較于未添加生防菌的育秧基質(zhì)，在菌濃度為1.0×109 CFU/mL的育秧基質(zhì)中種植水稻，主根長(zhǎng)度增長(zhǎng)了25%，側(cè)根數(shù)增加了29%，對(duì)水稻立枯病的防治效果>75%?？梢?，菌株TC-52在水稻育秧基質(zhì)中具有促生與防病作用，有一定的開發(fā)和應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：水稻立枯??；尖孢鐮刀菌；貝萊斯芽孢桿菌；生物防治

中圖分類號(hào)：S182；S435.111? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）10-0129-08

收稿日期：2023-11-20

基金項(xiàng)目：黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：201910223008）；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)“揭榜掛帥”項(xiàng)目（編號(hào)：JB20220001）；資源化利用木糖渣等生產(chǎn)系列肥料的研發(fā)（編號(hào)：2021066）。

作者簡(jiǎn)介：李? 坤（1997—），男，山東煙臺(tái)人，碩士研究生，從事農(nóng)用微生物的篩選與應(yīng)用研究。E-mail：1137021417@qq.com。

通信作者：王彥杰，博士，教授，從事農(nóng)業(yè)廢棄物資源化研究。E-mail：wangyanjie1972@163.com。

自水稻旱育秧技術(shù)推廣以來(lái)，立枯病已成為水稻育苗期間的常見病害，每年發(fā)病率為10%～23%，嚴(yán)重者死苗率高達(dá)70%［1］。此外，由于氣溫波動(dòng)和管理不善等因素，黑龍江省的水稻立枯病發(fā)病情況十分嚴(yán)重［2］。在實(shí)際工作中，插秧機(jī)會(huì)導(dǎo)致許多空穴，嚴(yán)重影響水稻的質(zhì)量和產(chǎn)量。

水稻立枯病常分為生理性立枯病和病理性立枯病。生理性立枯病又稱水稻青枯病，是秧苗在不良環(huán)境下的吸水與蒸騰能力失調(diào)所致，會(huì)造成水稻葉片的嚴(yán)重失水，使得水稻葉片呈青灰色，根毛稀少［3］；病理性立枯病常分為3種不同的類型，即芽腐、基腐和黃枯，一般由鐮刀菌屬（Fusarium）、絲核菌屬（Rhizoctonia）、根霉菌屬（Rhizopus）、蠕孢菌屬（Helminthosporium）等病原菌侵染造成。尖孢鐮刀菌是黑龍江省水稻秧苗枯病的主要致病菌，占致病菌總量的48%左右［4］。

當(dāng)前，為了預(yù)防和控制水稻立枯病，在水稻生產(chǎn)中通常采用化學(xué)藥劑進(jìn)行拌種、浸種、包衣或者對(duì)苗床進(jìn)行消毒處理。然而，長(zhǎng)期以來(lái)過度依賴使用化學(xué)農(nóng)藥必然會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)也對(duì)農(nóng)田環(huán)境造成嚴(yán)重破壞，最終導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量下降，甚至對(duì)食品安全形成威脅［5-6］。因此，這種做法不利于實(shí)現(xiàn)水稻立枯病的可持續(xù)防治。與之相反，生物防治具有環(huán)境友好、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，正漸漸地成為水稻立枯病防治的發(fā)展趨勢(shì)。微生物菌劑也有望成為理想的可替代或部分替代化學(xué)農(nóng)藥的產(chǎn)品之一。

目前有報(bào)道指出采用浸種或拌種的方式施用微生物菌劑，在防病方面取得了顯著的效果。例如，李敏等利用哈茨木霉分生孢子粉和多菌靈按照6 ∶4的比例拌種水稻，水稻立枯病防治效果達(dá)到了82%［7］；Limtong等利用附生酵母菌浸泡水稻種子，對(duì)水稻苗期出現(xiàn)的爛苗現(xiàn)象的防治效果達(dá)到100%［8］。另一部分報(bào)道則采用噴施的方式施用微生物菌劑，也達(dá)到了較好的防病效果。例如，李鑫杰等利用寡雄腐霉可濕性粉劑的6 000倍液分別于水稻秧苗的立針期和2葉期噴施，使得防病效果達(dá)到90%［9］；曹陽(yáng)利用水稻內(nèi)生菌枯草芽孢桿菌于2葉期噴施處理，使得防病效果達(dá)到74%［3］。當(dāng)前報(bào)道較少采用拌土的方式施用微生物菌劑，可能是由于采用拌土的方式將微生物菌劑加入到水稻育秧基質(zhì)會(huì)降低對(duì)水稻立枯病的防治效果，于文清等利用土地類芽孢桿菌來(lái)防治水稻立枯病，菌液浸種結(jié)合拌土處理，對(duì)立枯病防效達(dá)到了80%，浸種方式所產(chǎn)生的防治效果為74%，而拌土方式對(duì)水稻立枯病的防治效果僅有55%［10］。這可能是水稻育秧基質(zhì)呈酸性，不利于生防菌株的定殖所造成，故而對(duì)病原菌的抑菌效果有所下降。

本研究欲篩選可以直接加入到水稻育秧基質(zhì)中并對(duì)水稻立枯病有生防作用的菌株。以尖孢鐮刀菌為指示菌，通過采制性培養(yǎng)，從大豆根際土壤中篩選出對(duì)尖孢鐮刀菌具有較好拮抗效果的菌株，并對(duì)其促生效果進(jìn)行研究。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定及16S rRNA序列分析對(duì)其進(jìn)行菌株鑒定，通過水稻催芽、盆栽試驗(yàn)，對(duì)該菌株水稻立枯病的防治和促生效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期提供具有在育秧基質(zhì)中發(fā)揮防治水稻立枯病潛力的菌株資源。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

1.1.1? 土樣及病原菌

供試土壤樣品采集于黑龍江省安達(dá)市科技園區(qū)（地理位置46°24′N，125°21′E），屬于北溫帶大陸性半干旱季風(fēng)氣候，海拔147～148 m，年平均日照時(shí)數(shù)為2 659 h，年平均氣溫為3.2 ℃，年際間氣溫差異不大。在常年種植大豆的田地中，用鐵鍬沿著大豆根部的生長(zhǎng)方向盡量將植物根際完整取出，采用抖根法采集根際土壤，將附在根際上的土用毛刷全部刷下，裝入密封袋中做好標(biāo)記，于4 ℃冰盒保存。所有操作均用無(wú)菌工具進(jìn)行，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物分離和篩選。

供試病原菌：尖刀鐮孢菌（F. oxysporum）、立枯絲核菌（R. solani）、層出鐮刀菌（F. proliferatum）、串珠鐮刀菌（F. moniliforme）、禾谷鐮刀菌（F. graminearum）、大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）、小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）。

1.1.2? 供試培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（pH值為5.0）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）（pH值為5.0）、幾丁質(zhì)酶檢測(cè)培養(yǎng)基［11］、蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基［12］、纖維素酶檢測(cè)培養(yǎng)基［12］、Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基［13］、PKO無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基［14］、蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基［14］、鉀細(xì)菌篩選培養(yǎng)基［15］、CAS產(chǎn)鐵載體檢測(cè)培養(yǎng)基［16］。

1.1.3? 供試水稻種子

水稻品種為農(nóng)豐1702，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院水稻課題組提供。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 拮抗菌株的分離與純化

采用土壤稀釋涂布法進(jìn)行分離，將所取土樣稱取10 g，配成10-4、10-5、10-6、10-7倍稀釋液，分別取100 μL涂布到LB固體培養(yǎng)基平板上，每個(gè)濃度梯度重復(fù)3次，于32 ℃避光培養(yǎng)24 h，挑取形態(tài)不同的細(xì)菌菌落于LB固體培養(yǎng)基上劃線純化，連續(xù)純化3次后，將所得的細(xì)菌單菌落，劃線至LB固體斜面培養(yǎng)基上，放入4 ℃冰箱保藏備用。

1.2.2? 拮抗菌株的初篩

將在斜面保藏的拮抗菌株于LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線活化后，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，于32 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)20 h，制成發(fā)酵培養(yǎng)液，并放置于4 ℃條件下貯存，用于對(duì)峙培養(yǎng)。在無(wú)菌工作臺(tái)中，用打孔器在已活化好的尖孢鐮刀菌平板上取5 mm菌餅接于PDA平板中央，接種后在距離病原菌菌餅2.5 cm處呈“十”字形滴加3 μL分離菌株發(fā)酵液，以接種等量LB液體培養(yǎng)基的處理作對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。30 ℃培養(yǎng)7 d后，通過測(cè)量比較抑菌圈大小，計(jì)算抑菌率。抑菌率（V）計(jì)算公式如下：

V=（DCK-Dd）/DCK×100%。

其中：Dd為處理平板上病原菌菌落直徑，cm；DCK為對(duì)照平板上病原菌菌落直徑，cm。

1.2.3? 拮抗菌株的復(fù)篩

拮抗菌株上清液的抑菌效果測(cè)定：在無(wú)菌工作臺(tái)中，用打孔器在已活化好的尖孢鐮刀菌平板上取5 mm菌餅接于PDA平板中央，培養(yǎng)3 d后，在距離病原菌菌餅2.5 cm處呈“十”字形放置牛津杯，將拮抗菌株發(fā)酵培養(yǎng)液 10 000 r/min 離心10 min，取上清液經(jīng)過0.22 μL濾膜過濾，得到無(wú)菌上清液，取無(wú)菌上清液50 μL加入牛津杯中，以向牛津杯中加入等量LB液體培養(yǎng)基的處理作對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。

拮抗菌株揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌效果測(cè)定：采用平板倒扣法［17］，在無(wú)菌工作臺(tái)中，吸取拮抗菌株發(fā)酵培養(yǎng)液10 μL均勻涂布于LB平板上，用打孔器在已活化好的尖孢鐮刀菌平板上取5 mm菌餅接于PDA平板中央，并將接種病原菌的PDA平板倒扣于含發(fā)酵培養(yǎng)液的LB平板上，密封。以在LB平板上涂布了等量的LB培養(yǎng)基為對(duì)照，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，計(jì)算抑菌率。

1.2.4? 拮抗菌株幾丁質(zhì)酶、蛋白酶與纖維素酶活性測(cè)定

將保藏的拮抗菌株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上并于32 ℃生長(zhǎng)活化24 h后，用無(wú)菌接種環(huán)挑取單菌落分別點(diǎn)接于幾丁質(zhì)酶、蛋白酶與纖維素酶檢測(cè)培養(yǎng)基上，每個(gè)處理重復(fù)3次，于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，其中纖維素檢測(cè)培養(yǎng)基需用1 mg/mL的剛果紅溶液將整個(gè)培養(yǎng)皿浸沒染色30 min，再用1 mol/L的氯化鈉溶液洗滌，觀察3個(gè)檢測(cè)培養(yǎng)基的透明圈。根據(jù)HC值判斷酶活性大小，酶活性與HC值呈正相關(guān)，HC值計(jì)算公式如下：

HC=D/d×100%。

其中：D為胞外酶檢測(cè)培養(yǎng)基上透明圈直徑，cm；d為胞外酶檢測(cè)培養(yǎng)基上菌落直徑，cm。

1.2.5? 拮抗菌株的促生性研究

參照余涵霞等的方法［13］，通過菌株能否在無(wú)氮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)判斷菌株有無(wú)固氮能力。參照代志等的方法［14］，通過菌株在PKO無(wú)機(jī)磷和蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基上有無(wú)透明圈判斷菌株有無(wú)溶磷活性。參照吳紅艷等的方法［15］，通過菌株解鉀培養(yǎng)基上有無(wú)透明圈判斷菌株有無(wú)解鉀活性。參照李冬瑩的方法［16］，通過菌株CAS產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基上有無(wú)透明圈判斷菌株有無(wú)產(chǎn)鐵載體能力。參照張昊鑫等的方法［18］判斷菌株是否能分泌吲哚乙酸（IAA）。參照Glickmann等的方法［19］對(duì)菌株產(chǎn)IAA能力進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.2.6? 拮抗菌株的生物學(xué)相關(guān)特性測(cè)定

1.2.6.1? 生長(zhǎng)pH值范圍測(cè)定

將LB液體培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)整為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，取1 mL發(fā)酵液接種于不同pH值的LB液體培養(yǎng)基中，32 ℃、150 r/min培養(yǎng)30 h后取樣，測(cè)定樣本的D600 nm，每組重復(fù)3次。

1.2.6.2? 形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

將篩選出的拮抗菌株在LB培養(yǎng)基上劃線接種，32 ℃培養(yǎng)24 h，觀察篩選出的拮抗細(xì)菌單個(gè)菌落的形態(tài)、大小、顏色、干濕、光滑或粗糙等。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》的方法，對(duì)拮抗細(xì)菌進(jìn)行硫化氫試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氫酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、Voges-Proskauer試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、酪素水解試驗(yàn)，并進(jìn)行革蘭氏染色［20-21］。

1.2.6.3? 分子生物學(xué)鑒定

拮抗菌株DNA的提?。禾羧尉渚杲臃N于LB液體培養(yǎng)基中，于32 ℃、150 r/min 培養(yǎng)18 h后得到發(fā)酵培養(yǎng)液，按照天根生化細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒要求進(jìn)行拮抗菌株DNA的提取。

16S rRNA序列分析：采用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，送至進(jìn)行序列分析，結(jié)果在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)后，選取相似性較高的菌株序列，利用MEGA 11.0軟件中的Neighbor-Joining（重復(fù)抽樣1 000次）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.7? 拮抗菌株抑菌譜系測(cè)定

采用濾紙片法對(duì)拮抗細(xì)菌進(jìn)行篩選［22］。在無(wú)菌工作臺(tái)中，用打孔器在已活化好的尖孢鐮刀菌平板上取5 mm菌餅接于PDA平板中央，在距離病原菌2.5 cm處呈“十”字形放置無(wú)菌濾紙片并滴加3 μL拮抗菌株發(fā)酵液，并且以接種LB液體培養(yǎng)基的處理為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.8? 拮抗菌株對(duì)水稻幼苗的促生性研究

1.2.8.1? 水稻種子的消毒處理

在小燒杯中加入純水，將種子浸沒并保持30 min。剔除空秕粒后，用75%的乙醇表面消毒5 min，1% NaClO浸泡5 min，再用無(wú)菌水清洗3～5次，裝入燒杯中加入無(wú)菌水浸沒水稻種子。

1.2.8.2? 菌懸液的制備方法

將拮抗菌株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上，32 ℃活化16 h后，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，于32 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，制成發(fā)酵培養(yǎng)液。將所制成的發(fā)酵培養(yǎng)液8 000 r/min離心5 min后，棄去上清液，向菌體中加入無(wú)菌蒸餾水，重復(fù)該操作3次，制成菌懸液。

1.2.8.3? 不同菌濃度對(duì)水稻種子發(fā)芽的影響

在無(wú)菌工作臺(tái)中，將培養(yǎng)皿底部鋪上2層無(wú)菌濾紙，每個(gè)培養(yǎng)皿中裝30粒水稻種子，分別設(shè)置4個(gè)處理：CK（5 mL無(wú)菌蒸餾水浸潤(rùn)）；T1（5 mL 1.0×106 CFU/mL菌懸液浸潤(rùn)）；T2（5 mL 1.0×107 CFU/mL菌懸液浸潤(rùn)）；T3（5 mL 1.0×108 CFU/mL菌懸液浸潤(rùn)），每組進(jìn)行重復(fù)6次，并放置在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗處理。催芽期間逐日記載發(fā)芽粒數(shù)，以籽粒幼根達(dá)籽粒長(zhǎng)，幼芽至少達(dá)籽粒長(zhǎng)的1/2為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，于第5天計(jì)算發(fā)芽勢(shì)，第7天計(jì)算測(cè)定胚芽長(zhǎng)度與胚根長(zhǎng)度，第10天計(jì)算發(fā)芽率，并計(jì)算發(fā)芽指數(shù)（GI）。試驗(yàn)進(jìn)行過程中，及時(shí)向培養(yǎng)皿中補(bǔ)充蒸餾水使濾紙始終保持濕潤(rùn)狀態(tài)，計(jì)算公式如下：

X=M1/M×100%；

Y=M2/M×100%；

GI=∑（DG/Dt）。

式中：X為發(fā)芽勢(shì)；Y為發(fā)芽率；GI為發(fā)芽指數(shù)；M1為第5天正常發(fā)芽籽粒數(shù)；M2為第10天正常發(fā)芽籽粒數(shù)；M為組試籽粒數(shù)；Dt為對(duì)應(yīng)DG的發(fā)芽天數(shù)；DG為發(fā)芽試驗(yàn)終期內(nèi)每天的發(fā)芽數(shù)。

1.2.8.4? 不同菌濃度對(duì)水稻幼苗期生長(zhǎng)的影響

本試驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)處理：CK（1 L育秧基質(zhì)+10 mL無(wú)菌蒸餾水）；T1（1 L育秧基質(zhì)+10 mL 1.0×108 CFU/mL 菌懸液）；T2（1 L育秧基質(zhì)+10 mL 1.0×109 CFU/mL菌懸液）；T3（1 L育秧基質(zhì)+10 mL 1.0×1010 CFU/mL菌懸液），試驗(yàn)在105 mm×105 mm×58 mm方盤中進(jìn)行，每盤播種100粒經(jīng)消毒后的水稻種子，每個(gè)處理重復(fù)3次，方盤放置于 25 ℃、光—暗周期為14 h—10 h的溫室中生長(zhǎng)，21 d 后，對(duì)水稻幼苗的株出苗率、莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)以及側(cè)根數(shù)進(jìn)行考察。

1.2.9? 拮抗菌株盆栽防效測(cè)定

本試驗(yàn)共設(shè)置5個(gè)處理：CK1（1 L育秧基質(zhì)+10 mL無(wú)菌蒸餾水）；CK2（1 L育秧基質(zhì)+10 mL無(wú)菌蒸餾水+10 mL濃度為1.0×105個(gè)/mL的尖孢鐮刀菌分生孢子懸浮液）；T1（1 L育秧基質(zhì)+10 mL稀釋600倍的霉靈+10 mL濃度為1.0×105個(gè)/mL的尖孢鐮刀菌分生孢子懸浮液）；T2（1 L育秧基質(zhì)+10 mL 1.0×108 CFU/mL 菌懸液+10 mL濃度為1.0×105個(gè)/mL的尖孢鐮刀菌分生孢子懸浮液）；T3（1 L育秧基質(zhì)+10 mL 1.0×109 CFU/mL菌懸液+10 mL濃度為1.0×105個(gè)/mL的尖孢鐮刀菌分生孢子懸浮液）。試驗(yàn)在105 mm×105 mm×58 mm方盤中進(jìn)行，每盤播種100粒經(jīng)消毒后的水稻種子，并噴施10 mL濃度為1.0×105個(gè)/mL的尖孢鐮刀菌分生孢子懸浮液，每個(gè)處理重復(fù)3次，方盤放置于25 ℃、光—暗周期為14 h—10 h溫室中生長(zhǎng)，6 d后調(diào)查出苗率，15 d后計(jì)算發(fā)病率與防治效果。

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100%；

防治效果=（對(duì)照發(fā)病率-處理發(fā)病率）/對(duì)照發(fā)病率×100%。

1.2.10? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010、SPSS 25、Origin 2018、MEGA 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 拮抗菌株的分離與篩選

采用稀釋涂布平板法在pH值為5.0的LB固體培養(yǎng)基上共篩選出102株菌，分離出5株對(duì)尖孢鐮刀菌有較好拮抗效果的菌株（圖1），其中TC-52菌株對(duì)尖孢鐮刀菌抑菌率達(dá)（72.7±1.4）%。后又對(duì)上述5種菌進(jìn)行復(fù)篩，TC-52菌株的抑菌效果最好，其上清液抑菌直徑達(dá)到（27.29±1.57） mm，揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌率達(dá)（33.7±2.0）%。

2.2? 拮抗菌株抑菌胞外酶活性測(cè)定

菌株TC-52在纖維素酶檢測(cè)培養(yǎng)基（圖2-

A）、蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基（圖2-B）與幾丁質(zhì)酶檢測(cè)培養(yǎng)基（圖2-C）上均產(chǎn)生透明圈，其中蛋白酶的活性最強(qiáng)，HC值為3.13±0.04，纖維素酶與蛋白酶的活性較弱，HC值依次為1.61±0.06、1.14±0.03。

2.3? 拮抗菌株的促生性研究

菌株無(wú)法在PKO無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基和蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，初步判斷菌株不具備溶磷能力；菌株可以在解鉀培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，卻不產(chǎn)生透明圈，初步判斷菌株不具備解鉀能力；菌株在固氮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)（圖3-A），初步判斷菌株具有固氮能力；菌株在CAS產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并產(chǎn)生透明圈（圖3-B），可以初步判斷該菌株具有產(chǎn)鐵載體的能力。將菌株發(fā)酵液與比色液混合后暗孵育30 min，混合液呈現(xiàn)紅色（圖3-C），初步表明菌株能夠分泌IAA。對(duì)菌株產(chǎn)IAA能力進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.011 8x+0.011 9，決定系數(shù)r2為0.994 5，表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)和擬合函數(shù)吻合度較高，方程可用，確定菌株TC-52分泌IAA的量為21.70 μg/mL。

2.4? 拮抗菌株的生物學(xué)相關(guān)特性

2.4.1? 生長(zhǎng)pH值范圍測(cè)定

將菌株接種在不同pH值的培養(yǎng)基中，其生長(zhǎng)情況見圖4，菌株在最適pH值為5.0～8.0時(shí)沒有明顯差異，當(dāng)pH值＜5.0或＞8.0時(shí)，菌株的生長(zhǎng)受到明顯的抑制，當(dāng)pH值＜4.0或＞9.0時(shí)，菌株幾乎不能生長(zhǎng)，因此，可以推斷菌株可以適應(yīng)pH值為5.0左右的育秧基質(zhì)的環(huán)境。

2.4.2? 形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

在LB平板上，TC-52 菌落呈不規(guī)則圓形，邊緣透明，不整齊，中心不透明，整體呈現(xiàn)灰白色，呈革蘭氏陽(yáng)性，如圖5所示，菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.4.3? 分子生物學(xué)鑒定

測(cè)序獲得菌株TC-52的16S rRNA序列大小為1 060 bp，通過16S rRNA序列鑒定并與同源序列比對(duì)分析，對(duì)拮抗菌株的分類地位進(jìn)行確定，推斷菌株TC-52屬于貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis），且在已鑒定到種的該屬細(xì)菌中，

菌株TC-52與B. velezensis CR-502親緣關(guān)系最為接近，同源性最高（一致性99.14%），確定 TC-52 號(hào)菌株為貝萊斯芽孢桿菌（圖6）。

2.5 ?拮抗菌株抑菌譜系的鑒定

菌株TC-52對(duì)病原菌的抑制效果見表2，其中，菌株TC-52對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌效果最為明顯，抑菌率高達(dá)66.77%，對(duì)大豆疫霉菌的抑菌效果較差，僅有43.95%，對(duì)核盤菌幾乎沒有拮抗效果，對(duì)立枯絲核菌、 串珠鐮刀菌、層出鐮刀菌、小麥全蝕病菌抑菌率均在50%～70%之間。菌株TC-52具有較廣的抑菌譜系。

2.6? 拮抗菌株對(duì)水稻種子發(fā)芽的影響

將農(nóng)豐1702水稻種子經(jīng)消毒處理后浸潤(rùn)在不同濃度的TC-52菌懸液中，種子萌發(fā)情況見表3。相較于CK，不同濃度菌懸液對(duì)水稻種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)以及胚芽長(zhǎng)無(wú)明顯影響；但T1與T2處理卻能顯著促進(jìn)胚根的生長(zhǎng)，分別增加了19%與13%；而T3處理對(duì)水稻種子的胚根生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的抑制效果。由此可見，拮抗菌株浸種濃度不超過1.0×108 CFU/mL時(shí)對(duì)水稻種子無(wú)毒害作用。

2.7? 拮抗菌株對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)的影響

在含有不同菌濃度的育秧基質(zhì)中種植農(nóng)豐1702水稻種子，幼苗生長(zhǎng)狀況見表4。相較于CK處理，T1、T2處理分別使得水稻幼苗根長(zhǎng)顯著增加了16%與25%，側(cè)根數(shù)分別顯著增加了20%與29%，其中，T2處理還會(huì)使得水稻幼苗的平均莖長(zhǎng)增加1 cm，而當(dāng)菌濃度增加至T3處理時(shí)，水稻出苗率顯著降低，水稻幼苗的生長(zhǎng)受到抑制。由此可見，適宜的菌懸液濃度可以顯著促進(jìn)水稻幼苗根與莖的生長(zhǎng)。

2.8? 盆栽防效測(cè)定

將尖孢鐮刀菌的分生孢子懸浮液分別噴灑到添加等量無(wú)菌水、霉靈與不同濃度的TC-52菌株的育秧基質(zhì)中，對(duì)其出苗率、發(fā)病率等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖7，相較于處理組CK1，處理組CK2的出苗率降低了9.67%。相較于處理組CK2，T1、T2、T3處理組出苗率分別提升了9.00%、4.34%與9.34%，發(fā)病率分別降低了64.66%、37.00%、65.33%，由此可見，噴施化學(xué)殺菌劑與菌懸液均可以一定程度防治水稻立枯病，改善因病原菌的侵染所導(dǎo)致的出苗率低的問題。相較于菌濃度較低的T2組，菌濃度較高的T3組在防治效果上更加明顯，且與施加化學(xué)殺菌劑的T1組防治效果均>75%，由此可見，一定濃度的TC-52菌株拌入水稻育秧基質(zhì)中對(duì)水稻立枯病有較好的防病效果。

3? 討論與結(jié)論

酸堿度合適的育苗基質(zhì)不僅有利于水稻生長(zhǎng)，同時(shí)有利于預(yù)防一些水稻病蟲害，水稻的最適生長(zhǎng)pH為5.0左右，因此，篩選可以在該pH環(huán)境中長(zhǎng)勢(shì)較好的生防菌株就變得尤為重要。李晉等發(fā)現(xiàn)了一株暹羅芽孢桿菌，其可耐受pH值為4.0，在酸性土壤中對(duì)西瓜枯萎病的防治效果達(dá)到67%［23］；Zhao等研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌CLP-6在pH值為5.5時(shí)釋放的揮發(fā)性有機(jī)化合物對(duì)煙草白性枯萎病的防治效果為78.91%［24］。本研究所篩選的菌株，根據(jù)菌體特征、16S rRNA序列分析及生理生化試驗(yàn)，鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，在水稻育秧基質(zhì)中的防效達(dá)到75.41%，這是對(duì)于耐酸水稻立枯病拮抗菌株的首次報(bào)道。該菌株既具芽孢桿菌（Bacillus）繁殖速度快、因可以產(chǎn)生內(nèi)生孢子而具有較強(qiáng)的抵御外界有害因子能力的特點(diǎn)［25］，又可以在pH值為5.0左右的環(huán)境中正常繁殖生長(zhǎng)，耐受pH值達(dá)到4.0。

尖孢鐮刀菌是常見的植物致病菌，其細(xì)胞壁成分主要由糖蛋白、幾丁質(zhì)與纖維素等物質(zhì)構(gòu)成［26］，真菌細(xì)胞壁在細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)、維持菌絲形態(tài)和適應(yīng)環(huán)境中起著重要作用，因此破壞了病原菌細(xì)胞壁的完整性，將會(huì)極大程度地抑制病原菌生長(zhǎng)，降低植物的發(fā)病率［27］。在本研究中，貝萊斯芽孢桿菌TC-52具有產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶以及幾丁質(zhì)酶3種抑菌胞外酶的能力，3種酶互相協(xié)作，通過分解真菌的細(xì)胞壁，進(jìn)而抑制病原菌的生長(zhǎng)，降低植物的發(fā)病率，這與Wang等的報(bào)道結(jié)果［28］一致，芽孢桿菌的抑菌特性還可以通過分泌抗生素來(lái)直接抑制病原菌的生長(zhǎng)［29-31］。本研究中，貝萊斯芽孢桿菌 TC-52 的上清液與揮發(fā)性抑菌活性物質(zhì)可以進(jìn)一步抑制尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)，使得對(duì)尖孢鐮刀菌抑菌率達(dá)到72.7%，同時(shí)該菌株對(duì)立枯絲核菌（R. solani）、層出鐮刀菌（F. proliferatum）等6種常見菌株均有明顯的抑制效果。但是該菌株是否產(chǎn)生其他抗生素以及揮發(fā)性抑菌物質(zhì)的具體成分尚不可知，需后續(xù)進(jìn)一步研究分析。

菌株的促生特性也是生防菌的機(jī)制之一［32］，菌株能利用植物根系分泌的色氨酸合成IAA，直接促進(jìn)植物細(xì)胞伸長(zhǎng)和細(xì)胞分裂，高雅新等發(fā)現(xiàn)，具有產(chǎn)IAA能力的哈茨木霉M95對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用［33］；王東亞等還發(fā)現(xiàn)，具有產(chǎn)IAA能力的菌株在浸染條件下可以顯著增加水稻種子的萌發(fā)率、根和芽長(zhǎng)及生物量［34］。本研究中貝萊斯芽孢桿菌TC-52具有產(chǎn)IAA能力，其IAA產(chǎn)量達(dá)到21.70 μg/mL，相較于浸潤(rùn)在無(wú)菌水中，將水稻種子浸潤(rùn)在1.0×106 CFU/mL菌懸液中，胚根的生長(zhǎng)增加了19%。菌株的促生性還表現(xiàn)在可以通過固氮、溶磷、解鉀等能力提高土壤速效、緩效養(yǎng)分含量，提高微生物的生物活性，進(jìn)一步促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，以增加對(duì)病原菌的抗性［35-36］，本研究中貝萊斯芽孢桿菌TC-52具有固氮能力，進(jìn)一步促進(jìn)了水稻的生長(zhǎng)，減少了病害的侵染，將貝萊斯芽孢桿菌TC-52拌入水稻育秧基質(zhì)中時(shí)，可以明顯促進(jìn)水稻幼苗根系的生長(zhǎng)，對(duì)主根長(zhǎng)度的增長(zhǎng)達(dá)到25%，對(duì)側(cè)根數(shù)的增長(zhǎng)達(dá)到29%。此外，貝萊斯芽孢桿菌 TC-52 具有產(chǎn)鐵載體能力，可以特異地螯合Fe3+，在低鐵環(huán)境中與病原菌競(jìng)爭(zhēng)鐵元素，抑制病原菌生長(zhǎng)，也可以將難溶的鐵轉(zhuǎn)化為易溶的鐵供植物吸收，促進(jìn)植物生長(zhǎng)［11，37-38］。

綜上所述，貝萊斯芽孢桿菌TC-52可以適應(yīng)酸性環(huán)境，對(duì)尖孢鐮刀菌有較好的抑制效果，拌入水稻育秧基質(zhì)中可以明顯改善水稻立枯病的發(fā)病情況，同時(shí)對(duì)水稻幼苗的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，表現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景，但關(guān)于該菌株代謝產(chǎn)物的分離純化、大田應(yīng)用效果等方面還需進(jìn)一步的研究。

本研究從大豆根際土壤中篩選得到了1株對(duì)尖孢鐮刀菌具有明顯拮抗作用的菌株TC-52，根據(jù)菌體特征、16S rRNA序列分析及生理生化試驗(yàn)，初步鑒定該菌株為貝萊斯芽孢桿菌，該菌株可以通過分泌纖維素酶、蛋白酶以及幾丁質(zhì)酶3種抑菌胞外酶以及揮發(fā)性抑菌活性物質(zhì)來(lái)抑制尖孢鐮刀菌以及其他病原菌的生長(zhǎng)，具有較廣的抑菌譜，同時(shí)該菌株具有固氮、產(chǎn)鐵載體與產(chǎn)IAA能力，有較好的防病效果和一定的促生能力。

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