丹冬淳 陳征 胡鐘勝 錢建財 張莉 趙紅朝 黃五星

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.10.010

摘要：土壤鎘污染嚴重威脅植物生長和人體健康，煙草是全球廣泛種植的經濟作物，也是鎘的積累者。為探究褪黑素對鎘脅迫下煙草幼苗生長和生理特性的影響，以烤煙品種K326為試驗材料，采用水培試驗，通過葉面噴施 200 μmol/L 褪黑素處理，探究10 μmol/L鎘脅迫下褪黑素對煙草幼苗生長指標和生理特性的影響。結果表明，10 μmol/L 鎘脅迫下煙草幼苗的生長發(fā)育受到抑制，褪黑素能有效緩解鎘脅迫。與對照相比，鎘處理組的煙苗根長、最大葉面積以及根、莖、葉的生物量均顯著下降（P<0.05）；褪黑素的施用改善了鎘的抑制，與鎘處理相比，鎘+褪黑素處理的根長、最大葉面積以及根、葉的生物量分別顯著增加了91.0%、12.3%、33.3%、13.8%。煙草幼苗的光合特性受到鎘的脅迫，褪黑素的施用降低了鎘對凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率的脅迫，同時也改善了鎘對煙草幼苗葉綠素、類胡蘿卜素的合成及葉綠素熒光的抑制，增加了煙苗體內抗氧化酶活性、滲透調節(jié)物質含量，降低了丙二醛含量，并且提高了生長素、赤霉素、1-氨基環(huán)丙烷羧酸含量，降低脫落酸含量。綜上所述，外源噴施褪黑素可以有效緩解Cd脅迫，促進根系生長，增強光合作用，調節(jié)生理代謝過程，提高煙草對鎘的耐受能力，為緩解鎘對煙草幼苗的脅迫提供栽培技術及理論基礎。

關鍵詞：煙草；褪黑素；Cd脅迫；抗氧化；光合作用；熒光參數(shù)；激素

中圖分類號：X173；S572.01? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）10-0075-08

收稿日期：2023-08-05

基金項目：河南省重點研發(fā)與推廣專項（編號：202102310026）；江蘇中煙工業(yè)有限責任公司科技項目（編號：2021410001300050）。

作者簡介：丹冬淳（1999—），男，河南濟源人，碩士研究生，主要從事煙草品質生態(tài)研究。E-mail：812849459@qq.com。

通信作者：黃五星，博士，副教授，主要從事煙草品質生態(tài)與質量評價研究。E-mail：wxhuang@henau.edu.cn。

煙草是我國重要的經濟作物之一，易富集鎘（Cd）等重金屬，進而對其產質量造成不良影響［1］。Cd富集導致不良影響的主要原因之一是其進入煙株體內后誘導細胞葉綠體和線粒體代謝產生過量活性氧（ROS），攻擊DNA、RNA、蛋白質和細胞膜脂系統(tǒng)，最終造成細胞膜損傷和電解質滲漏［2］。Cd富集引發(fā)的脅迫信號會激活植物抗氧化防御體系，各種抗氧化酶［超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）］活性水平在脅迫狀態(tài)下會顯著增加，清除過量超氧陰離子和H2O2，維持細胞氧化還原的平衡狀態(tài)［3］。同時，Cd脅迫還會導致煙株內源激素平衡受到破壞［4］。

褪黑素（N-乙?；?5-甲氧基色胺）是一種生物活性小分子?？茖W家在1958年從奶牛的松果體中首次分離得到褪黑素［5］。20世紀90年代人們陸續(xù)從藻類、細菌中發(fā)現(xiàn)褪黑素的存在，打破了褪黑素的物種研究局限性［6-7］。1995年Dubbels等通過放射免疫分析法在植物提取物中首次發(fā)現(xiàn)了植物內源褪黑素含量的品種差異［8］，開啟了植物褪黑素的研究進程。

褪黑素在最初的功能研究中是作為一種高效的抗氧化劑，減輕細胞受到的過量自由基氧化損傷。隨著不斷研究，人們發(fā)現(xiàn)褪黑素在哺乳動物、魚類、鳥類、爬行動物和兩棲動物中具備多種生物學功能［5，9］，例如，能夠調節(jié)晝夜節(jié)律、睡眠、情緒、食物攝入、體溫、視網膜生理、性行為、季節(jié)性繁殖和免疫系統(tǒng)［10］。多項研究證實，褪黑素可以作為一種生長調節(jié)劑參與植物種子萌發(fā)、生長、開花、生根、光合作用、成熟/衰老和細胞保護反應等多項生物學進程的調控［11］。此外，適宜濃度的褪黑素可以清除過量自由基，有效改善植物氧化損傷［12-13］，保護植物免受如病原菌侵染、鹽堿脅迫、極端溫度、輻射和重金屬污染等多種生物和非生物脅迫［14-20］，同時它可以通過增加細胞內的酶和非酶類抗氧化劑水平來清除ROS，從而維持細胞體內的氧化還原平衡［14］。另外有研究表明，外源褪黑素可以保護葉綠體結構和光合器官，增強PS Ⅱ光化學活性，提高葉片光合效率，從而緩解Cd脅迫對烤煙幼苗生長的抑制，提高煙苗對Cd脅迫的適應能力［21］。

目前，已有許多關于煙草Cd脅迫的研究，但有關褪黑素在煙草幼苗緩解Cd脅迫方面的研究及其對內源激素的影響罕見報道。因此本試驗采用水培的方法，研究噴施褪黑素對Cd脅迫下煙草幼苗幼苗生長和生理特性的影響，旨在為生產上褪黑素的應用及重金屬防控提供理論依據(jù)和參考。

1? 材料與方法

1.1? 試驗設計

試驗于2023年3月30日在河南農業(yè)大學煙草品質生態(tài)與質量評價實驗室進行。以烤煙品種K326為試驗材料（中國農業(yè)科學院煙草研究所提供），將種子在次氯酸鈉溶液（10%）中浸泡30 min，之后用去離子水沖洗5次以確保表面無菌。種子在暗室中發(fā)芽，至出現(xiàn)2張真葉后轉移到盛有蛭石和泥炭（體積比1 ∶1）滅菌基質的塑料盆中，在溫室中繼續(xù)培養(yǎng)，生長室晝夜溫度為25 ℃/18 ℃，相對濕度70%，光—暗周期為14 h—10 h。

當煙苗生長到4張真葉時，將長勢一致的煙苗移入水培盒中，用霍格蘭營養(yǎng)液對煙苗每周換水3次。緩苗1周后同時加入Cd處理和褪黑素（MT）處理，鎘處理濃度為10 μmol/L，以氯化鎘作為鎘源（CdCl2·2.5H2O，純度≥99.0%，購自北京百靈威科技有限公司）。處理分別設置為對照（CK，不添加Cd和MT）、Cd處理（連續(xù)Cd脅迫7 d）、MT+Cd處理（連續(xù)Cd脅迫7 d同時每天均勻噴施200 μmol/L褪黑素10 mL于葉片正反面），褪黑素試劑購自北京索萊寶公司，分析純標準。為防止強光降解褪黑素，噴施時間為19：00，每天噴施1次，持續(xù)7 d后，自下而上剪取煙株第4張葉進行各項指標測定。地下部樣品取樣前置于EDTA-Na2（20 mmol/L）溶液中浸泡15 min，然后用去離子水潤洗后吸干表面水分，將樣品分別收集于事先標記好的錫紙中，迅速置于液氮，冷凍5 min后放入-80 ℃超低溫冰箱保存，用于鎘含量的測定。

1.2? 測定項目與方法

1.2.1? 生物量測定

用刻度尺測量各處理煙苗的根長、最大葉長和最大葉寬，最大葉面積=最大葉長×最大葉寬×0.634 5［22］。使用電子天平測定煙苗樣品的鮮質量。將煙草樣品放入烘箱，先在 105 ℃ 殺青30 min，而后在70 ℃環(huán)境的烘箱中將樣品烘干至恒重［23］。使用電子天平分別測定根部、莖部和葉部的干質量。

1.2.2? 光合特性指標和葉綠素含量測定

使用便攜式光合測定儀（Li-6400，美國LI-COR公司）于09：00—11：00測定各處理葉片的凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）；葉綠素含量的測定參照Wang等的方法［24］。

1.2.3? Cd含量測定

將烘干后的樣品粉碎過60目篩，稱取樣品0.4 g（精確至0.000 1 g）置于微波消解管（CEM-Mars，USA）中，并加入6 mL硝酸和2 mL H2O2進行消解，隨后使用ICP-OES（Vista-MPX，USA）測定消解后樣品溶液中的鎘含量。

1.2.4? 抗氧化酶活性、丙二醛（MDA）和滲透調節(jié)物質含量測定

超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性和脯氨酸（Pro）含量采用北京北京索萊寶科技有限公司生產的檢測試劑盒測定。MDA含量和可溶性糖含量采用蘇州科銘生物技術有限公司生產的檢測試劑盒測定。

1.2.5? 葉綠素熒光參數(shù)測定

采用Li-6800便攜式光合測定儀測定煙草葉綠素熒光參數(shù)，測定前煙草在黑暗條件下適應24 h，測定光系統(tǒng)Ⅱ的光化學效率（Fv/Fm），在實際培養(yǎng)光強下適應1 h，待熒光信號穩(wěn)定后測定煙草葉片能量捕獲效率（Fv′/Fm′）、光化學淬滅系數(shù)（qP）、非光化學淬滅系數(shù)（NPQ）、電子傳遞速率（ETR）和光系統(tǒng)Ⅱ效率（ΦPSⅡ）。

1.2.6? 植物激素含量測定

利用LC-ESI-MS/MS系統(tǒng)（HPLC，Shimadzu UFLC SHIMADZU CBM30A system；MS，Applied Biosystems 6500 Triple Quadrupole），檢測煙草葉片中植物激素絕對含量。在各處理組中隨機取9株煙苗，3株煙苗混合為1個重復進行取樣，共3個重復進行測序。借助粉碎機將煙草葉片組織粉碎至粉末狀態(tài)，稱取50 mg加入適量內標，用甲醇/水/甲酸溶液（15 ∶4 ∶1，1 mL）提取樣本，然后用80%甲醇（100 μL）復溶提取液并進行LC-MS/MS分析。依次配制0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200、500 ng/mL濃度的標準品溶液，獲取各濃度標準品的對應定量信號的質譜峰強度。

1.3? 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 19.0和Origin 9.0進行統(tǒng)計分析和圖表制作，多重比較選用Duncans法，在0.05顯著水平上比較差異。

2? 結果與分析

2.1? 外源褪黑素對Cd脅迫下煙草幼苗生物量的影響

植物干物質積累量（生物量）是反映其生長狀況最直觀的指標。由表1可知，與CK相比，Cd脅迫處理煙苗根長、最大葉面積、根生物量、莖生物量和葉生物量均顯著降低（P<0.05）。與Cd處理相比，Cd+MT 處理煙苗的根長顯著增加了91.0%，最大葉面積顯著增加了12.3%，根生物量顯著增加了33.3%，葉生物量增加了13.8%，而莖生物量保持不變。表明Cd脅迫下，200 μmol/L外源褪黑素能促進Cd脅迫下煙苗生長。

2.2? 外源褪黑素對Cd脅迫下煙草幼苗光合參數(shù)的影響

對各處理幼苗的光合特性進行測定，具體如圖1所示。與CK相比，Cd脅迫處理煙苗葉片的凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率均顯著降低，胞間CO2濃度顯著升高。與Cd處理相比，Cd+MT處理的煙苗葉片的凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率均顯著增加，胞間CO2濃度顯著降低。表明Cd脅迫下，200 μmol/L外源褪黑素對Cd脅迫下煙苗光合作用具有顯著的保護作用。

2.3? 外源褪黑素對Cd脅迫下煙草Cd含量的影響

對不同處理下煙草幼苗體內Cd含量進行測定，具體如圖2所示。與CK相比，Cd脅迫顯著提高了煙草幼苗體內Cd含量，分別是CK的123.4倍（根部）、70.2倍（葉部）。而與Cd處理相比，Cd+MT處理的煙苗根部和葉片的Cd含量顯著降低，降幅分別為39.4%和15.7%。說明Cd脅迫下，200 μmol/L 外源褪黑素處理能夠顯著抑制煙草幼苗對鎘的吸收。

2.4? 外源褪黑素對Cd脅迫下煙草幼苗抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶活性是反映植物抗氧化能力的重要指標。由圖3可知，與CK相比，Cd脅迫顯著增強了煙草幼苗葉片及根中SOD、POD和CAT的活性，葉部增幅分別為296.4%、148.6%、181.3%，根部增幅分別為393.5%、120.9%、159.4%。與Cd處理相比，Cd+MT處理進一步提高了SOD、POD和CAT酶活性，葉部增幅分別為124.1%、101.1%、38.7%，根部增幅分別為112.6%、127.5%、35.5%，均達顯著水平。結果表明，200 μmol/L外源褪黑素處理能夠顯著提高Cd脅迫下煙草體內抗氧化酶活性。

2.5? 外源褪黑素對Cd脅迫下煙草幼苗MDA活性的影響

MDA是衡量氧化脅迫程度的常用指標之一，其含量的高低一定程度上可以反映植物在逆境脅迫下膜脂過氧化的程度。由圖4可知，煙苗根的MDA含量明顯低于葉片。與CK相比，Cd脅迫處理煙苗葉片及根中MDA含量顯著提高，增幅分別為81.7%和66.7%。而與Cd處理相比，Cd+MT處理的煙苗葉片及根中MDA含量顯著降低，降幅分別為33.1%和21.9%。說明Cd脅迫下200 μmol/L外源褪黑素處理可以通過降低過氧化物含量來減輕氧化損傷，緩解煙草Cd脅迫。

2.6? 外源褪黑素對Cd脅迫下煙草幼苗滲透調節(jié)物質含量的影響

脯氨酸和可溶性蛋白是植物的主要滲透調節(jié)物質。由圖5可知，與CK相比，Cd脅迫處理的煙苗葉片及根中脯氨酸和可溶性蛋白含量均顯著增加，脯氨酸含量的增幅分別為93.6%（葉部）、91.4%（根部），可溶性蛋白含量的增幅分別為67.0%（葉部）、85.2%（根部）。與Cd處理相比，施

用200 μmol/L MT處理的幼苗葉片及根中脯氨酸含量分別顯著提高19.5%、20.8%，可溶性蛋白含量分別顯著提高29.1%、3.8%。說明200 μmol/L外源褪黑素處理可以通過增加煙草幼苗體內滲透調節(jié)物質含量，緩解煙草Cd脅迫。

2.7? 外源褪黑素對Cd脅迫下煙草幼苗光合色素含量的影響

對不同處理下煙草幼苗葉片的葉綠素含量進行測定，具體如圖6所示。與CK相比，Cd脅迫處理煙草幼苗葉片葉綠素含量顯著降低33.7%（葉綠

素a含量下降24.2%，葉綠素b含量下降43.0%），類胡蘿卜素含量顯著降低89.7%。與Cd處理相比，Cd+MT處理的幼苗葉片葉綠素含量顯著提高了39.0%（葉綠素a含量提高31.1%，葉綠素b含量提高49.3%），類胡蘿卜素含量顯著提高557.1%。說明200 μmol/L外源褪黑素處理能夠顯著提高煙草幼苗葉片光合色素含量，緩解煙草Cd脅迫。

2.8? 外源褪黑素對Cd脅迫下煙草幼苗葉綠素熒光參數(shù)的影響

PSⅡ熒光參數(shù)的變化能夠準確反映葉片的光合生理狀態(tài)。由表2可知，與CK相比，Cd脅迫處理煙苗葉片的Fv/Fm、Fv′/Fm′、qP、ETR和ΦPSⅡ分別降低7.8%、34.1%、22.1%、30.7%和24.6%，NPQ升高34.0%，差異均達顯著水平。與Cd處理相比，Cd+MT處理的煙苗葉片的Fv/Fm、Fv′/Fm′、qP、ETR和ΦPSⅡ分別顯著升高6.7%、39.9%、17.0%、37.5%和14.3%，NPQ顯著降低12.1%。說明 200 μmol/L 外源褪黑素可以減弱Cd對煙苗葉片熒光的不利影響。

2.9? 外源褪黑素對Cd脅迫下煙草幼苗激素含量的影響

植物激素對植物的生長發(fā)育產生顯著的調節(jié)作用。由圖7可知，與CK相比，Cd脅迫處理煙苗葉片的生長素（IAA）、赤霉素（GA）和1-氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）含量均顯著降低，脫落酸（ABA）含量顯著升高。IAA、GA和ACC含量的降幅分別為27.6%、16.4%和22.8%，ABA含量的增幅為40.4%。與Cd處理相比，Cd+MT處理的煙苗葉片的IAA、GA和ACC含量分別提高了17.1%、12.3%和15.9%，ABA含量降低了16.6%，均達顯著水平。說明200 μmol/L外源褪黑素處理對煙苗葉片的激素合成代謝有顯著影響。

3? 討論與結論

重金屬脅迫下植物生長的適應機制是作物逆境生物學研究的核心問題之一，提高作物應對重金屬脅迫的能力已成為我國耕地土壤鎘污染狀況隨工業(yè)化的快速發(fā)展日益嚴重背景下維持農業(yè)生產力的緊迫目標之一［25］。生物量是反映植物響應重金屬脅迫最直接的表現(xiàn)［26］。植物體內的重金屬含量是評價植物修復效果好壞的最直接指標［27］。本研究中，Cd脅迫導致煙草幼苗根長、最大葉面積以及根、莖、葉的生物量顯著降低，外源褪黑素處理有效緩解了Cd脅迫對煙草幼苗生長的抑制作用。研究表明，褪黑素參與植物體內多種代謝途徑，并具有良好的緩解植物鎘脅迫的能力［28-29］。呂怡穎等研究發(fā)現(xiàn)，施用外源褪黑素可以降低煙草幼苗對Cd的富集，減少對Cd的吸收和積累，降低煙苗體內各部位的Cd含量［27］。本研究中，與Cd處理相比，Cd+MT 處理的煙苗根部鎘含量顯著降低39.4%，葉部鎘含量顯著降低15.7%，與張盛楠等的研究結果［30］一致。

重金屬脅迫引起植株體內的ROS大量積累，氧化DNA、蛋白質、細胞膜脂等生物大分子，導致細胞代謝失衡紊亂，氧化還原失衡［26］，其中丙二醛是細胞膜脂過氧化的最終產物，可以用來反映細胞膜的受損程度［31］。本研究中，Cd脅迫后煙草幼苗體內MDA含量顯著升高，而與Cd處理相比，Cd+MT處理的煙苗體內MDA含量顯著降低，說明褪黑素能夠減少脂質過氧化產物的積累。褪黑素最初的功能是作為一種自由基清除劑清除體內過多的活性氧和活性氮，從而保護植物細胞免受氧化損傷［12］。以往研究表明，外源施用褪黑素能夠明顯減少小麥、芥菜、玉米、水稻和百日草植株體內的ROS水平和細胞膜脂過氧化程度，同時增強抗氧化防御系統(tǒng)［32-36］。本研究也發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫下煙苗體內SOD、POD、CAT活性增強，且外源褪黑素處理進一步顯著增強了這3個抗氧化酶的活性。另外，重金屬脅迫下植物體內脯氨酸和可溶性蛋白含量增加，從而保護細胞膜結果和調節(jié)細胞質的滲透平衡［37］，這與本研究結果一致，而外源褪黑素的施用則進一步促進了脯氨酸及可溶性蛋白含量的提高。

鎘脅迫會導致植物葉綠體受損，抑制葉綠素的合成，影響植物的光合作用［38］。本研究中Cd脅迫顯著降低煙苗的光合色素含量（葉綠素a含量下降24.2%，葉綠素b含量下降43.0%，類胡蘿卜素含量下降89.7%）、凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率，而胞間CO2濃度顯著升高，在甜高粱和蔞蒿中也有同樣的結果［39-40］。外源褪黑素處理顯著提高了煙苗的光合色素含量、凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率，顯著減少了胞間CO2濃度。結果表明，褪黑素可能通過誘導葉綠體基因的表達和增強相關酶的活性來增加葉綠素的合成。這種增加的葉綠素含量有助于提高光能吸收和光合作用效率，從而增強植物對Cd脅迫的適應能力。

葉綠素熒光和光合作用的關系十分密切，葉綠素熒光參數(shù)可以反映出逆境因子對植物光合作用機制以及光合生理狀況的損傷程度［4］。Yang等研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施褪黑素能夠顯著增加茶樹葉片的Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR、qP，顯著降低NPQ，從而有效提高葉片的光能利用率［41］。本研究結果顯示，Cd脅迫下施用外源褪黑素顯示出更高的Fv/Fm和ΦPSⅡ，這暗示褪黑素能夠維持光系統(tǒng)Ⅱ的功能穩(wěn)定性，減少Cd脅迫引起的光合作用損失。同時與Cd組相比，Cd+MT組的煙苗也表現(xiàn)出更高的ΦPSⅡ，這可能意味著褪黑素有助于保護和維持光系統(tǒng)Ⅱ的光能利用效率，在Cd脅迫下優(yōu)化光合作用過程。此外，Cd+MT組的煙苗相較于Cd組顯示出較低的NPQ，即葉片的非光化學耗散能力降低。這可能意味著褪黑素能夠減少葉片中的光能耗散，從而防止過量的能量積累，減輕光損傷的發(fā)生。

植物激素是指在植物體內合成的、通常從合成部位運往作用部位、對植物的生長發(fā)育產生顯著調節(jié)作用的微量有機物質，廣泛參與了逆境等多種生理活動的調節(jié)，其對植物生理活動的調節(jié)會涉及自身濃度的變化［42-44］。本研究中，Cd脅迫顯著降低了煙苗葉片的IAA、GA和ACC含量，顯著提高了ABA含量，而褪黑素處理顯著提高IAA、GA和ACC的含量，并顯著降低ABA含量。這與李冬等的研究結果［4］一致。

綜上所述，本研究結果表明，葉面噴施 200 μmol/L 褪黑素對Cd脅迫下的煙草幼苗生長和生理特性具有正向調節(jié)作用。褪黑素能通過提高SOD、POD、CAT這些抗氧化酶的活性并降低過氧化產物MDA的含量來增強煙苗的抗氧化能力，減輕煙苗在Cd脅迫下的氧化損傷，降低Cd脅迫下煙苗葉綠素降解，提高其光合性能并降低煙苗體內Cd含量，進而提高煙苗對Cd脅迫的耐受性，緩解煙草Cd脅迫。同時，褪黑素可能通過抑制ABA和提高IAA、GA和ACC水平來緩解Cd脅迫對植物的損傷，但仍需進一步的研究來明確其作用機制。

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