陳曉玉　譚奕舟　莫智杰　胡靜　李軍　李常挺　白慧麗　王樂平　馬春霞　尹楊燕　彭昊　廖玉英

摘要：為了解廣西地區(qū)規(guī)模化水禽養(yǎng)殖場鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）的流行血清型、耐藥情況及遺傳關(guān)系，從廣西南寧、貴港等地規(guī)?；蒺B(yǎng)殖場中臨床上疑似感染RA的病死鴨、鵝體內(nèi)得到5株分離菌，對分離菌進行鑒定，檢測其毒力基因，通過多重PCR檢測方法鑒定血清型，并對其進行耐藥性分析。經(jīng)試驗得到鑒定結(jié)果，RA分離菌株在血瓊脂培養(yǎng)基上呈平滑圓潤、露滴樣，圓形隆起的灰白色菌落；革蘭氏染色呈陰性短桿菌；5株分離菌經(jīng)16S rRNA 鑒定均為RA，將其命名為2022NNRA01～2022NNRA05；其中，血清鑒定2022NNRA01為血清1型，其余均為血清2型。藥敏試驗結(jié)果顯示，5株RA對青霉素、氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢噻呋、大觀霉素、氟苯尼考、磺氨甲[XCZ1.tif，JZ]唑敏感，對其他抗菌藥物呈不同程度的耐藥。其中，對安普霉素、慶大霉素、卡那霉素氨基糖苷類藥物，四環(huán)素類藥物多西環(huán)素和利福霉素類藥物利福平的耐藥率為100%。本試驗經(jīng)分離鑒定成功得到5株RA，且其耐藥性分析結(jié)果可為廣西地區(qū)RA疾病的疫苗免疫預(yù)防選擇以及藥物治療提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鴨疫里默氏桿菌；分離鑒定；血清型；毒力因子；耐藥性；廣西

中圖分類號：S852.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）09-0213-06

鴨疫里默氏桿菌病又稱鴨傳染性漿膜炎，是一種由鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的敗血癥急性病，病鴨易患纖維性心包炎、腦膜炎、肝周炎和肺泡炎［1］。該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，主要侵害1～8周齡的雛鴨，除此之外還可感染鵝、火雞等家禽，且感染后發(fā)病率和死亡率極高，是一種對水禽業(yè)造成嚴(yán)重危害的細(xì)菌傳染?。?］。

目前，RA病菌主要研究集中于鴨源，但近年來隨著養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展，RA的流行情況在鵝群中也有上升趨勢［2-4］。水禽養(yǎng)殖業(yè)在廣西養(yǎng)殖業(yè)中所占比例不可忽視，廣西地區(qū)常見的水禽病有RA、大腸桿菌病、禽流感、病毒性肝炎等，其中RA的發(fā)病率在逐漸上升，影響了廣西地區(qū)的鴨鵝養(yǎng)殖業(yè)乃至整個水禽業(yè)的經(jīng)濟效益，且大部分的調(diào)查研究均停留在臨床病例報告，未系統(tǒng)地進行分子流行病學(xué)研究［5］，目前廣西地區(qū)鴨疫里默氏桿菌病例的流行情況報道甚少，特別是鵝源RA病株；為填補該地區(qū)RA病流行病學(xué)數(shù)據(jù)的欠缺，完善我國RA病整體防控方案，本研究對廣西地區(qū)部分水禽養(yǎng)殖場流行的RA分離菌進行分離鑒定，并采用血清1型、2型和11型RA多重PCR鑒定方法［6］鑒定分離菌的血清型，對其耐藥性及遺傳關(guān)系進行研究，為當(dāng)?shù)亻_展針對性的疫苗免疫及臨床用藥選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料樣本

病料樣品來源于2021—2022年廣西壯族自治區(qū)南寧市、貴港市規(guī)?；蒺B(yǎng)殖場。病禽咳嗽、體型瘦小、精神狀態(tài)差、不愿走動、毛色無光澤，解剖病死鴨鵝有較嚴(yán)重的包肝、包心；采集病死鴨鵝的腦、肝和心等組織，收集的組織樣本共28份（表1），于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑與儀器

本試驗所用試劑與儀器的主要信息見表2、表3。

1.1.3 引物合成

多重PCR鑒定鴨疫里默氏桿菌血清型引物參考專利［6］合成，引物信息見表4；鴨疫里默氏桿菌毒力基因鑒定引物信息見表5，均由金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與培養(yǎng)

無菌環(huán)境中，采集病死鴨鵝的腦、內(nèi)臟組織，將其接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，再將其放置于厭氧罐中， 37 ℃恒溫培養(yǎng) 24～36 h，觀察培養(yǎng)病原菌的形態(tài)特征，挑取符合要求的單菌落進行培養(yǎng)。

1.2.2 形態(tài)鑒定

挑取純化后的單個待檢菌落，按革蘭氏染色操作說明書進行染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察，鑒定其形態(tài)特征。

1.2.3 16S rRNA分子生物學(xué)鑒定

取純化的細(xì)菌培養(yǎng)液12 000 r/min 離心1 min，去上清液后提取RA病菌的基因組DNA。通用引物序列（表4）進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系50 μL（表6），PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s退火，72 ℃ 30 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，擴增結(jié)果大小為1 450 bp。

將陽性產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序后得到測序結(jié)果，在NCBI［BLAST：Basic Local Alignment Search Tool （nih.gov）］上進行比對分析，根據(jù)序列間同源性差異，采用MEGAX軟件構(gòu)建遺傳進化樹，分析并確定分離菌株的類別。

1.2.4 血清型鑒定

參照文獻(xiàn)［6］，通過多重PCR檢測方法鑒定血清型，特異性擴增RA血清1型、2型和11型引物，所用引物信息見表4，實現(xiàn)對RA血清1型、2型和11型的鑒定。PCR反應(yīng)體系見表6。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5min；95 ℃ 30 s，57.9 ℃ 30 s退火，72 ℃ 60 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min［6］。

1.2.5 毒力基因檢測

參照試劑盒說明書提取RA病菌的基因組DNA，PCR擴增RA毒力基因OmpA、CAMP、wza、AS87_04050、Fur、SIP、TbdR1和luxE，所用引物信息見表5。

1.2.6 細(xì)菌藥敏試驗

采用K-B紙片法對5株菌株進行抗生素藥物的敏感試驗。無菌操作下，將RA均勻涂布于血瓊脂平板上，貼上藥敏紙片；置于厭氧罐中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑。根據(jù)抑菌圈直徑判斷RA對各種藥物的敏感度，參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會抗微生物藥物敏感試驗標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離培養(yǎng)

由圖1可知，從多個規(guī)模水禽養(yǎng)殖場病死鴨、鵝組織樣本上分離得到5株菌株；5株菌株均在鮮血瓊脂平板上形成平滑圓潤、露滴樣的圓形隆起灰白色菌落。

2.2 鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)鑒定

由圖2可知，對5株分離的RA進行革蘭氏染色，鏡檢為陰性，單個或成雙排列，形態(tài)多為短桿狀，少數(shù)呈橢圓形狀。

2.2.2 16S rRNA分子生物學(xué)鑒定

由圖3可知，5株分離的RA菌株P(guān)CR擴增后，獲得大小約1 450 bp目的條帶，得到5株RA的基因序列，與NCBI上20株RA參考株進行比對，相似性≥98%。由圖4可知，2022NNRA01、2022NNRA02、2022NNRA04、2022NNRA05處于同一分支，親緣性較高，而2022NNRA03和云南分離株RA-1親緣關(guān)系較近。

2.3 血清型鑒定

經(jīng)特異性多重PCR方法鑒定5株鴨疫里默氏桿菌分離株得到結(jié)果，由圖5可知，電泳圖樣本中有1 114 bp特異性鑒定條帶和269 bp條帶， 則為血清1型RA；有1 114 bp特異性鑒定條帶和671 bp條帶，則為血清2型RA；有1 114 bp特異性鑒定條帶和510 bp條帶，則為血清11型RA［6］。

血清鑒定結(jié)果表明，2022NNRA01為血清1型，2022NNRA02、2022NNRA03、2022NNRA04、2022NNRA05為血清11型。其中，血清1型占比20%，血清11型占比80%。

2.4 毒力基因檢測

由圖6可知，5株分離菌經(jīng)過PCR擴增毒力基因特異性片段，2022NNRA01～2022NNRA05均含毒力基因OmpA（663 bp）、wza（939 bp）、luxE（999 bp），5株分離菌均未擴增出AS87_04050毒力基因條帶，2022NNRA02、2022NNRA03、2022NNRA04未擴增出CAMP、Fur、SIP、TbdR1毒力基因條帶。

2.5 藥敏試驗

由表7可知，本試驗分離得到的5株RA對青霉素、氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢噻呋、大觀霉素、氟苯尼考和磺氨甲[XCZ1.tif；%120%120，JZ]唑8種抗菌藥物敏感，對其他7種抗菌藥物呈不同程度的耐藥。其中，對安普霉素、慶大霉素、卡那霉素氨基糖苷類藥物，環(huán)丙沙星、恩諾沙星喹諾酮類藥物，四環(huán)素類藥物多西環(huán)素和利福霉素類藥物利福平均表現(xiàn)出高度耐藥。

3 討論

本研究分離得到的5株RA中，1株分離自病死鵝，RA是當(dāng)前危害養(yǎng)鵝業(yè)的重要傳染病之一，雛鵝感染后發(fā)病率極高，病死率在10%～40%，最高可達(dá)90%［7］，10周齡時仍能感染發(fā)病，種鵝和成年鵝不易感染。本研究收集不同水禽養(yǎng)殖場發(fā)病鴨、鵝的病料，發(fā)病雛鵝生活環(huán)境較差，雛鵝群在舍內(nèi)平地圈養(yǎng)，保溫設(shè)施少、通風(fēng)差、氨氣重，雛鵝群于約15日齡出現(xiàn)發(fā)病死亡的嚴(yán)重情況，養(yǎng)鵝場應(yīng)當(dāng)密切關(guān)注并重視RA病菌的預(yù)防，改善鵝場的飼養(yǎng)條件，加強鵝場通風(fēng)和保濕，在鵝的免疫計劃中也應(yīng)考慮到對RA病菌的免疫。

5株菌均從病樣的腦部分離得到，有研究發(fā)現(xiàn)病禽感染鴨疫里默氏桿菌后，腦組織神經(jīng)細(xì)胞變大，這與腦部神經(jīng)細(xì)胞受損有關(guān)［8］。通過分析分離菌的遺傳進化關(guān)系發(fā)現(xiàn)， 分離自南寧地區(qū)的4株鴨疫里默氏桿菌之間的親緣關(guān)系最近，貴港分離株2022NNRA03和同處于西南地區(qū)的云南分離株RA-1親緣關(guān)系較近，說明病菌的流行可能和種鴨種鵝的貿(mào)易、運輸有關(guān)，因此該病的檢疫工作應(yīng)引起重視；2022NNRA01與2022NNRA05親緣關(guān)系較近，但分別來自于鴨源和鵝源，可能存在鴨、鵝混合感染的情況，因此鵝養(yǎng)殖地要遠(yuǎn)離鴨舍、雞舍，避免雞、鴨、鵝混養(yǎng)。長期以來在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，針對RA病菌是采用疫苗免疫預(yù)防、藥物治療相結(jié)合的方法進行防控，而效果并不理想。一方面，RA病菌在自然界血清型眾多，至少擁有21個血清型，且不同血清型間無交叉免疫保護作用［9］；另一方面，當(dāng)前市面上銷售的滅活疫苗并未覆蓋所有血清型，這使得疫苗的免疫作用受到限制。

目前，鴨疫里氏桿菌在全國范圍內(nèi)流行，其中廣東地區(qū)RA以1型為優(yōu)勢血清型，2、3、4、8、10、15也均有流行［10-12］；貴州省養(yǎng)鴨業(yè)的重點養(yǎng)殖基地三穗地區(qū)以2型為主要流行血清型，11型也有流行［13-14］；福建省血清型為2型和11型所占比例最高［15］。血清1、2、10、11型在廣西桂林地區(qū)均有流行，以1型最為多發(fā)，百色市分離菌株血清型全為1型［16-17］。本研究采用血清1型、2型和11型RA病菌多重PCR鑒定［6］，5株分離株以血清11型所占比例最高。該方法實現(xiàn)對RA病菌血清1型、2型和11型的精確、簡便、穩(wěn)定、高特異和高靈敏性檢測，和常規(guī)鑒定方法不同，此檢測方法降低了勞動成本，成本相對較低，前景好。分析以往廣西地區(qū)所報道的RA病菌的流行情況，血清型11型可能在南寧的流行趨勢相較往年有所上升，該調(diào)查有助于了解該地區(qū)RA的優(yōu)勢血清型，為進一步選擇相應(yīng)的疫苗提供依據(jù)。

RA病菌的致病機理研究發(fā)展十分緩慢，本試驗中的5株分離菌均含毒力基因OmpA、wza、luxE，但均不含AS87_04050。膜蛋白是革蘭氏陰性菌外膜的重要組成部分，參與物質(zhì)跨膜運輸、傳導(dǎo)信號、合成能量物質(zhì)等生命過程［18］。本試驗證明，5株基因的表達(dá)情況影響RA的感染能力，從而影響宿主對入侵細(xì)菌的免疫情況。OmpA為外膜蛋白的主要蛋白，Hu等通過試驗評價RA病菌OmpA缺失株Th4ΔOmpA的毒力，結(jié)果顯示，Th4ΔOmpA的黏附、侵襲能力及對雛禽的致病性明顯減弱，證明OmpA參與RA的黏附過程，OmpA基因缺失株Th4ΔOmpA對10日齡櫻桃谷鴨致病力大幅度減少，是一種重要的毒力因子［19］。袁彪研究發(fā)現(xiàn)，wza基因與莢膜的形成有關(guān)，wza基因的缺失導(dǎo)致鴨疫里默氏桿菌生物膜形成能力增加以及表面疏水性升高，RA CH-1Δwza毒力約下降421倍［20］。岳嘉蘋研究發(fā)現(xiàn)，luxE基因缺失株Yb2ΔluxE對Vero細(xì)胞的黏附侵襲能力均較親本株顯著降低，進而導(dǎo)致細(xì)菌的入侵力減弱，該基因缺失后導(dǎo)致鴨疫里默氏桿菌脂蛋白?；毕?，致病力相較野生株Yb2顯著下降［21］。在本試驗5株分離株的檢測中，均未出現(xiàn)AS87_04050基因的目的條帶；AS87_04050基因與細(xì)菌脂多糖的合成和致病性有關(guān)，王小蘭通過轉(zhuǎn)座子插入誘變技術(shù)構(gòu)建AS87_04050基因缺失株RA2640，研究發(fā)現(xiàn)基因缺失株RA2640合成細(xì)菌脂多糖受阻，進而感染過程受阻，且毒力下降10萬倍以上［22］。

另外，由于在飼養(yǎng)和臨床治療中長期連續(xù)使用或不規(guī)范使用抗生素，導(dǎo)致RA的耐藥譜越來越廣。研究表明，不同地區(qū)分離的RA病菌對抗生素的敏感程度不同［23］。本研究調(diào)查采樣的養(yǎng)殖場常使用安普霉素、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、磺胺嘧啶等藥物，藥敏試驗結(jié)果顯示，5株RA分離菌多重耐藥，對臨床常見抗菌素均呈不同程度的耐藥性，其中，對上述常見抗生素的耐藥率為100%。因此，在臨床上選擇藥物治療時，應(yīng)當(dāng)先檢測病菌對抗生素敏感性，為廣西藥物RA疾病治療提供試驗依據(jù)，合理使用抗生素，盡最大可能避免藥物的不當(dāng)使用，控制鴨疫里默氏桿菌出現(xiàn)多重耐藥性的發(fā)展態(tài)勢。

4 結(jié)論

本研究從廣西壯族自治區(qū)部分地區(qū)的幾個規(guī)模水禽養(yǎng)殖場中多羽具有典型臨床癥狀的病死鴨、鵝腦組織上分離得到5株鴨疫里默氏桿菌，經(jīng)分離純化后通過菌落形態(tài)鑒定及分子生物學(xué)鑒定，確定5株分離菌均為鴨疫里默氏桿菌，說明該菌在廣西地區(qū)鴨群、鵝群中有流行的趨勢。其中，4株為血清11型，1株為血清1型。藥敏試驗結(jié)果表明，5株鴨疫里默氏桿菌均出現(xiàn)多重耐藥性，但對青霉素類藥物青霉素、氨芐西林、阿莫西林，頭孢菌素類藥物頭孢氨芐、頭孢噻呋和酰氨醇類藥物氟苯尼考及氨基糖苷類藥物大觀霉素敏感。本研究結(jié)果可為廣西地區(qū)RA疾病的疫苗免疫預(yù)防的選擇、藥物治療提供依據(jù)。

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收稿日期：2023-07-11

基金項目：廣西重點研發(fā)計劃（編號：AB21238003、AB21220005-4）；國家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：CARS-42）；廣西獸醫(yī)研究所基本科研業(yè)務(wù)費（編號：桂科專項22-6、桂科專項23-5）；廣西農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳科技項目（編號：Z202218、Z202219）；廣西南寧市良慶區(qū)重大科技專項（編號：202118）；廣西防城港市重點研發(fā)計劃（編號：AB21014016、AB20014028）；廣西桂林市重點研發(fā)計劃（編號：20220136-5）；廣西南寧市武鳴區(qū)重點研發(fā)計劃（編號：20210102）；廣西南寧市江南區(qū)重點研發(fā)計劃（編號：20220620-2）；廣西南寧市青秀區(qū)重點研發(fā)計劃（編號：2022004）。

作者簡介：陳曉玉（2000—），女，黑龍江賓縣人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)藥理病理研究。E-mail：cxy13766902977@163.com。

通信作者：彭 昊，博士，高級獸醫(yī)師，主要從事動物疫病防控與病原分子生物學(xué)研究，E-mail：hpeng2006@163.com；廖玉英，研究員，主要從事畜禽生態(tài)養(yǎng)殖研究，E-mail：315951610@qq.com。