戴國禮 劉娜 秦墾 張波 尹躍 米佳 何昕孺

收稿日期：2023-05-22

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（32060360）；寧夏重點研發(fā)計劃項目（2020BBF02006；2021BEF02005）

作者簡介：戴國禮（1984-），男，青海格爾木人，副研究員，主要從事林木遺傳育種研究，（電話）13995203004（電子信箱）dgl2006swfc@163.com；通信作者，何昕孺（1988-），女，寧夏鹽池人，助理研究員，主要從事枸杞育種與栽培研究，（電子信箱）hhexinru@163.com。

摘要：以采集的121份野生枸杞（Lycium barbarum L.）種質(zhì)為材料，用9對SSR引物進行擴增，采用GeneALEX、Power Marker軟件進行多態(tài)性分析，利用NTSYS、STRUC-TURE軟件進行遺傳多樣性分析、聚類分析和主成分分析。結(jié)果表明，9對SSR引物共檢測到108個等位基因，等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）、Shannons信息指數(shù)分別為12個、4.620個、0.678、0.651、0.629、1.568；聚類結(jié)果顯示121份野生枸杞種質(zhì)可劃分為5個亞群，群體遺傳結(jié)構(gòu)表明當K=5時，121個種質(zhì)劃分為5個亞群，來自寧夏的NXGY-02、NXGY-03 2個種質(zhì)與來自內(nèi)蒙古的6個種質(zhì)之間的遺傳距離最遠，親緣關(guān)系較遠，來自青海省、新疆、甘肅省及內(nèi)蒙古的其余野生枸杞種質(zhì)之間存在廣泛的基因交流現(xiàn)象；寧夏、內(nèi)蒙古的野生枸杞種質(zhì)具有獨立起源進化的可能，而新疆、甘肅省、青海省的種質(zhì)與寧夏種質(zhì)親緣關(guān)系較近，很可能屬于同一起源。

關(guān)鍵詞：野生枸杞（Lycium barbarum L.）；種質(zhì)；SSR熒光標記；遺傳結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S326???????? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）05-0207-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.036??????????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Genetic structure analysis of 121 wild goji berry germplasms based on

SSR fluorescence markers

DAI Guo-li，LIU Na，QIN Ken，ZHANG Bo ， YIN Yue， MI Ja， HE Xin-ru

（Institute of Goji Berry Science， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Yinchuan? 740002，China）

Abstract： 121 wild goji berry（Lycium barbarum L.） germplasms were collected as materials， 9 pairs of SSR primers were used of amplification， and polymorphism was analyzed using GeneALEX and Power Marker software. Genetic diversity analysis， cluster analysis， and principal component analysis were performed using NTSYS and STRUC-TURE software.The results showed that a total of 108 alleles were detected using 9 pairs of SSR primers. The number of alleles （Na）， effective alleles （Ne）， observed heterozygosity （Ho）， expected heterozygosity （He）， polymorphic information content （PIC）， and Shannons information index were 12， 4.620， 0.678， 0.651， 0.629， and 1.568， respectively；the clustering results showed that 121 wild goji berry germplasms could be divided into 5 subgroups. The genetic structure of the population showed that when K=5， 121 germplasms could be divided into 5 subgroups. The genetic distance between NXGY-02 and NXGY-03 germplasms from Ningxia and 6 germplasms from Inner Mongolia was the farthest， and the genetic relationship was relatively distant，there was extensive gene exchange among other wild goji berry germplasms from Qinghai Province， Xinjiang， Gansu Province， and Inner Mongolia；the wild goji berry germplasms in Ningxia and Inner Mongolia had the possibility of independent origin and evolution， while the germplasms in Xinjiang， Gansu， and Qinghai provinces were closely related to the germplasms in Ningxia and were likely to belong to the same origin.

Key words： wild goji berrie （Lycium barbarum L.）； germplasms； SSR fluorescence markers； genetic structure

戴國禮，劉 娜，秦 墾，等. 基于SSR熒光標記的121份野生枸杞種質(zhì)遺傳結(jié)構(gòu)解析［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，63（5）：207-214.

枸杞（Lycium barbarum L.）是茄科（Solanceae）枸杞屬（Lycium）的落葉喬木，廣泛分布于寧夏、甘肅省、青海省、內(nèi)蒙古及新疆等地，枸杞的果實、葉和根可作為藥用及食用，是一種具有很高經(jīng)濟價值和藥用價值的植物［1-3］。枸杞具有防風固沙、開發(fā)鹽堿地的功能，因此枸杞也具有很高的生態(tài)價值［4-6］。種質(zhì)資源不僅是育種的前提，更是種質(zhì)創(chuàng)新的物質(zhì)基礎(chǔ)，經(jīng)過長時間的自然選擇，野生種質(zhì)資源發(fā)生豐富的遺傳變異，因此，開展枸杞野生種質(zhì)資源遺傳多樣性研究不僅有助于了解枸杞的遺傳多樣性水平、遺傳結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系，還對保護和利用野生種質(zhì)資源具有重要意義，同時可為后續(xù)枸杞的育種工作提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)［7， 8］。

目前，常用的分子標記方法有簡單重復(fù)序列標記（Simple sequnece repeats，SSR）［9］、簡單序列間重復(fù)（Intra-Simple sequnece repeats，ISSR）［10］、限制性片段長度多態(tài)性標記（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）［11］及擴增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）［12］等方法。其中SSR標記具有多態(tài)性高、位點豐富、重復(fù)性好、操作簡便及不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點［13-15］。隨著分子標記技術(shù)的快速發(fā)展，SSR分子標記技術(shù)已經(jīng)成為一項重要的研究技術(shù)，并且廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性［16］、遺傳結(jié)構(gòu)［17］、指紋圖譜構(gòu)建［18］、基因型研究［19］及親緣關(guān)系鑒定［20］等方面。

石志剛等［21］利用nrDNA ITS序列對18份寧夏枸杞資源開展了遺傳多樣性研究；李彥龍等［22］利用AFLP分子標記技術(shù)對15份枸杞種質(zhì)進行親緣關(guān)系分析及聚類分析；安魏等［23］利用SRAP分子標記技術(shù)對29份枸杞種質(zhì)材料進行親緣關(guān)系研究和聚類分析；鮑紅春等［16］利用ISSR分析標記技術(shù)對10份枸杞種質(zhì)材料進行遺傳多樣性分析。近年來，枸杞遺傳多樣性的研究中種質(zhì)數(shù)量均較少，多為栽培品種，且種質(zhì)分布范圍較集中。本研究中采用SSR分子標記對來自5個省份共121份野生枸杞種質(zhì)資源進行相關(guān)研究，旨在探究其遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系，為后續(xù)的核心種質(zhì)構(gòu)建及分子輔助育種工作等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗共收集野生枸杞種質(zhì)材料121份，其中56份材料來自寧夏，29份材料來自青海省，24份材料來自內(nèi)蒙古，6份材料來自甘肅省，6份材料來自新疆。每個種質(zhì)采集無病蟲害的新鮮嫰葉5～10片，放入寫有編號的管中并保存于液氮中，轉(zhuǎn)運至實驗室后放置于-80 ℃的冰箱中保存，用于DNA的提取。具體種質(zhì)編號及分布見表1。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用高效植物基因組DNA提取試劑盒［DP305，天根生化科技（北京）有限公司］從野生枸杞葉片中提取基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，Nanodrop 2000型紫外分光光度計［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］檢測DNA濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，將DNA質(zhì)量濃度稀釋至50 ng/μL，置于-20 ℃的冰箱中保存，用于后續(xù)PCR試驗。

1.2.2 SSR引物及PCR擴增 采用尹躍等［24］開發(fā)設(shè)計的9對高多態(tài)性SSR引物（表2），在上游引物5′端添加18 bp的M13通用引物序列（TGTAAAACGACGGCCAGT），3′端保持不變，F(xiàn)AM和HEX 2種熒光基團修飾通用引物，所有引物均由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

PCR擴增體系（10 μL）：50 ng/μL DNA模板????? 1 μL，10×Buffer 1.5 μL，10 μmol/L dNTP 1.2 μL，???? 5 μmol/L上游引物0.1 μL，5 μmol/L下游引物0.4 μL，5 μmol/L M13熒光引物0.4 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，去離子水5.3 μL。

PCR反應(yīng)在Gene Amp PCR System 9600（Perkin Elmer，USA）儀上進行，擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25個循環(huán)；95℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個循環(huán)；最后60 ℃ 30 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)過ABI3730XL DNA（Applied Biosystems，USA）檢測，采用LIZ-500作為分子量內(nèi)標。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Gene Mapper 4.0軟件對ABI3730XL收集的原始數(shù)據(jù)進行分析，獲得不同樣品擴增片段的長度；采用Data Formatter軟件將擴增片段轉(zhuǎn)化為Power Marker V3.25、NTSYS-pc 2.20和STRUC-TURE 2.3.4輸入格式。由Power Marker 3.25計算等位基因數(shù)（Number of alleles，Na）、觀察雜合度（Observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（Expected heterozygosity，He）、多態(tài)信息含量（Polymorphism information content，PIC）等遺傳多樣性參數(shù)。用NTSYS-pc 2.20軟件計算種質(zhì)間的遺傳距離，采用UPGMA法進行聚類分析，繪制系統(tǒng)聚類樹。用STRUC-TURE 2.3.4軟件對野生枸杞種質(zhì)進行群體結(jié)構(gòu)分析，設(shè)置群組數(shù)（K）為1～10，每個參數(shù)運行10次，每次運行的Buru-intime設(shè)置為10 000，重復(fù)次數(shù)為10 000。用STRUC-TURE HRVESTER在線軟件對群體種質(zhì)資源遺傳結(jié)構(gòu)進行可視化分析，用個體歸屬各組群的比例與群組數(shù)（K）來研究供試野生枸杞種質(zhì)間是否存在基因交流。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標記多態(tài)性分析

利用9對SSR標記在121個種質(zhì)中共檢測到108個等位基因，每個標記所檢測到的等位基因數(shù)（Na）為2～23個，平均每個標記檢測到等位基因數(shù)為12個，其中標記LBSSR0363檢測到的等位基因數(shù)最多，高達23個，標記LBSSR0027檢測到的等位基因數(shù)最少，僅有2個（表3）；有效等位基因數(shù)（Ne）的變化范圍為1.008～9.065個，平均每個標記檢測到的有效等位基因數(shù)為4.620個；Shannons信息指數(shù)的變化范圍在0.027～2.496，其中標記LBSSR0363的Shannons信息指數(shù)最高，為2.496，標記LBSSR0027的Shannons信息指數(shù)最低，為0.027；9對SSR標記的觀測雜合度（Ho）的變化范圍在0.008～0.967，平均值為0.678；9對SSR引物的期望雜合度（He）的變化范圍在0.008～0.890，平均值為0.651；F檢驗值的變化范圍在-0.245～0.785，平均值為0.022；基因多樣性（GD）的變化范圍在0～0.890，平均值為0.650；多態(tài)性信息含量（PIC）的變化范圍在0～0.880，平均值為0.629，9對SSR引物中，SSR標記LBSSR0001、LBSSR0254、LBSSR0289、LBSSR0309、LBSSR0363、LBSSR0423及LBSSR0511的多態(tài)性較高，標記LBSSR0027的多態(tài)性較低，標記LBSSR0539的多態(tài)性適中（0.250

2.2 主成分分析

為進一步了解121份野生枸杞種質(zhì)的遺傳進化過程及其相似性程度，利用GeneALEX 6.51b2軟件計算各群體間的Neis遺傳距離，基于計算得到的遺傳距離利用R語言中ade4包進行主成分分析。主成分分析結(jié)果（圖1）表明，第一主成分占121份野生枸杞種質(zhì)總遺傳變異的22.81%，第二主成分占總遺傳變異的16.40%，第三主成分占總遺傳變異的10.33%，3個主成分的特征值為49.54%。主成分坐標圖中各群體的樣點位置和距離表示各種質(zhì)間親緣關(guān)系的遠近，121份野生枸杞種質(zhì)組成的5個群組分布相對較集中，說明參試野生枸杞種質(zhì)總體的親緣關(guān)系較近。群組A與其他群組種質(zhì)間均存在一定的親緣關(guān)系，群組A與群組B、D、E之間的親緣關(guān)系較近，群組C與群組A可明顯地區(qū)分為2個來源較遠的群組。

2.3 聚類分析

通過 NTSYS軟件中Find相似系數(shù)計算程序，得到121份野生枸杞種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)，為0.734～1.000，平均遺傳相似系數(shù)為0.847?；谶z傳相似距離矩陣，運用非加權(quán)平均法（UPGMA）得出種質(zhì)間的聚類樹（圖2）。聚類結(jié)果表明，121份野生枸杞種質(zhì)可劃分為5個亞群。第一亞群僅包含來自寧夏的NXGY-02、NXGY-03 2個種質(zhì)，說明這2個種質(zhì)與其他種質(zhì)之間的親緣關(guān)系較遠。第二亞群共包含16個種質(zhì)，其中寧夏的種質(zhì)4個，內(nèi)蒙古的種質(zhì)9個，青海省的種質(zhì)1個，新疆的種質(zhì)2個。第三亞群共包含8個種質(zhì)，其中寧夏的種質(zhì)5個，內(nèi)蒙古的種質(zhì)3個。第四亞群共包含89個種質(zhì)，第四亞群又可劃分為2個小的組群，第一組群包含31個種質(zhì)，其中第一分支包含來自寧夏的16個種質(zhì)，第二分支包含15個種質(zhì)，包含寧夏的6個種質(zhì)，甘肅省的1個種質(zhì)，青海省的8個種質(zhì)；第二組群包含58個種質(zhì)，其中23個種質(zhì)來自寧夏，20個種質(zhì)來自青海省，5個種質(zhì)來自甘肅省，6個種質(zhì)來自內(nèi)蒙古、4個種質(zhì)來自新疆。第五亞群僅包含來自內(nèi)蒙古的6個種質(zhì)。由以上結(jié)果可知，來自寧夏的NXGY-02、NXGY-03??? 2個種質(zhì)與來自內(nèi)蒙古的6個種質(zhì)之間的遺傳距離最遠，親緣關(guān)系較遠；來自青海省、新疆、甘肅省及內(nèi)蒙古的其余種質(zhì)之間存在廣泛的基因交流現(xiàn)象。

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

對121個野生枸杞種質(zhì)進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果（圖3）顯示，在K=3時，似然值最大，說明可將121個野生枸杞種質(zhì)分為3個群組（圖4），結(jié)合實際采樣情況及聚類分析結(jié)果，采用K= 5時的遺傳結(jié)構(gòu)進行分析。當K=5時，將121個種質(zhì)劃分為5個亞群（圖5、表4）。121個種質(zhì)中分布于第三亞群的數(shù)量最多，共包含43個種質(zhì)，36個種質(zhì)分布于第二亞群，17個種質(zhì)分布于第四亞群，16個種質(zhì)分布于第一亞群，分布于第五亞群的種質(zhì)數(shù)量最少，僅有9個種質(zhì)。來自寧夏的56個種質(zhì)分布于5個亞群，其中分布于第二亞群的種質(zhì)數(shù)量最多，有26個種質(zhì)，分布于第一亞群的種質(zhì)數(shù)量最少，僅有4個種質(zhì)，共有3個種質(zhì)分布于第四亞群，9個種質(zhì)分布于第五亞群，14個種質(zhì)分布于第三亞群。來自甘肅省的6個種質(zhì)中，僅有1個種質(zhì)分布于第二亞群，其余5個種質(zhì)分布于第三亞群。來自內(nèi)蒙古的24個種質(zhì)中，10個種質(zhì)分布于第一亞群，3個種質(zhì)分布于第三亞群，其余11個種質(zhì)分布于第四亞群。來自青海省的29個種質(zhì)中，8個種質(zhì)分布于第二亞群，18個種質(zhì)分布于第三亞群，3個種質(zhì)分布第四亞群。來自新疆的6個種質(zhì)中，2個種質(zhì)分布于第一亞群，1個種質(zhì)分布于第二亞群，3個種質(zhì)分布于第三亞群。

3 小結(jié)與討論

目前，SSR分子標記技術(shù)已成為科研學(xué)者開展遺傳多樣性相關(guān)研究的常用方法，已在楓香古樹［25］、板栗［26］、綠豆［27］和江南牡丹［28］中進行了遺傳多樣性研究。許多學(xué)者針對枸杞開展了遺傳多樣性研究，胡永超等［29］利用SSR分子標記技術(shù)對43份枸杞樣本進行遺傳多樣性研究，有效等位基因數(shù)平均值為2.018個，期望雜合度平均值為0.398，Shannons指數(shù)平均值為0.839；秦英之等［30］基于全長轉(zhuǎn)錄組開發(fā)了SSR標記，并對28個枸杞種質(zhì)進行了遺傳多樣性分析，23對引物共擴增得到240個等位基因，每個位點的等位基因數(shù)為4～17個，Shannons信息指數(shù)為1.177～2.487，期望雜合度和觀測雜合度分別為0.635～0.909和0.250～0.964，PIC為0.580～0.902；王紅梅等［31］對22份西北荒漠野生黑果枸杞樣本進行遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)平均有效等位基因數(shù)為1.331 4個，多樣性指數(shù)為0.210 6，Shannons信息指數(shù)為0.338 4；黃興發(fā)等［32］利用10對多態(tài)性引物對48份枸杞樣本進行遺傳多樣性研究，共檢測到186個等位基因，平均為19個；觀察雜合度為0.615，期望雜合度為0.834，多態(tài)信息含量平均值為0.817。本研究中廣泛收集分布于寧夏、甘肅省、青海省、新疆及內(nèi)蒙古的野生枸杞樣本121份，并利用9對SSR引物對收集的材料進行遺傳多樣性分析，共檢測到等位基因108個，平均每個標記檢測到的等位基因數(shù)為12個，平均有效等位基因數(shù)為4.620個，Shannons信息指數(shù)平均值為1.568，觀測雜合度平均值為0.678，期望雜合度平均值為0.651，多態(tài)信息含量平均值為0.629。本研究的遺傳多樣性結(jié)果明顯高于胡永超等［29］、王紅梅等［31］的研究結(jié)果，黃興發(fā)等［32］的研究結(jié)果中期望雜合度和多態(tài)性信息含量均高于本研究，但觀測雜合度低于本研究。由此可見，本研究中的9對SSR分子標記能夠反映出枸杞的遺傳多樣性。

遺傳距離聚類法與群體遺傳結(jié)構(gòu)分析法是2種不同運算模式的聚類方式，遺傳距離聚類法依據(jù)遺傳距離或遺傳相似性，而群體遺傳結(jié)構(gòu)分析法可將劃分不明的群體（單株）歸類到相應(yīng)的群體中，聚類更明確，結(jié)合遺傳距離聚類法與群體遺傳結(jié)構(gòu)分析法能更準確地確定種質(zhì)間的親緣關(guān)系［33］。本研究利用2種分析方法得到類似的聚類結(jié)果，即總體上，在遺傳距離聚類法中按照地理距離將121份種質(zhì)聚為5類，結(jié)果表明地理距離較近的群體基本聚在一起；在遺傳結(jié)構(gòu)的分析中，出現(xiàn)了聚類與地理種源不完全一致的現(xiàn)象，所以選擇K=5，將121個材料分為5個亞群更為合適，盡管各群體的遺傳組成是非均質(zhì)的，但各群體間的遺傳混合程度較低，說明地理和環(huán)境因子相較于地理距離對于枸杞群體間的遺傳分化有更大的作用，群體之間的遺傳混合通常與群體的地理分布相關(guān)。

枸杞種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性，為其遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新提供了廣泛的遺傳基礎(chǔ)；其遺傳變異主要來源于群體內(nèi)的個體，應(yīng)根據(jù)其遺傳結(jié)構(gòu)特征，在選擇遺傳多樣性高的群體基礎(chǔ)上，重點考慮群體內(nèi)優(yōu)良單株的選擇；在核心種質(zhì)及育種群體構(gòu)建時，建議在表型選擇的基礎(chǔ)上，將種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)特征及親緣關(guān)系作為理論參考。

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