張柏銘 秦立得 王淑婷 劉迎春 孫曉亮 李雪萍 王玉東 王曉茵 趙思俊 曹旭敏 劉坤 王述柏 宋翠平

收稿日期：2022-11-14

基金項(xiàng)目：山東省家禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（SDAIT-11-14）

作者簡(jiǎn)介：張柏銘（2000-），男，山東煙臺(tái)人，本科生，主要從事動(dòng)物產(chǎn)品安全監(jiān)測(cè)研究，（電話）18853559551（電子信箱）1820623270@qq.com；共同第一作者，秦立得（1989-），男，山東泰安人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物產(chǎn)品安全監(jiān)測(cè)研究，（電話）15712710612（電子信箱）825149813@qq.com；通信作者，宋翠平（1971-），女，山東濰坊人，正高級(jí)獸醫(yī)師，博士，主要從事動(dòng)物產(chǎn)品安全監(jiān)測(cè)研究，（電話）13963915205（電子信箱）1575369253@qq.com。

摘要：建立了同時(shí)檢測(cè)有機(jī)肥中磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類3類55種抗菌藥物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）。將有機(jī)肥研磨、過(guò)篩制成試驗(yàn)樣品后，使用HLB固相萃取柱凈化，上樣后依次用去離子水、5%乙腈水溶液淋洗，甲醇/乙酸乙酯溶液（體積比7∶3，含5%氨水）洗脫，氮吹吹干，0.1%甲酸水/乙腈（體積比=9∶1）復(fù)溶；在多反應(yīng)檢測(cè)模式下進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，4批有機(jī)肥中55種藥物在1.0～100 μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2>0.990 0），該方法的檢出限為2.0～7.5 μg/kg，定量限為5.0～25.0 μg/kg，各種藥物的回收率為60.2%～118.7%，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）為0.5%～15.0%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=20）為4.3%～24.1%。該方法簡(jiǎn)單可靠，凈化效果好，適用于有機(jī)肥中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)脂類藥物的同時(shí)檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：有機(jī)肥；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）；快速檢測(cè)；抗菌藥物

中圖分類號(hào)：S859.84???????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）05-0175-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.031??????????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Simultaneous and rapid detection of 55 antibacterial drugs in organic fertilizer using

UPLC-MS/MS

ZHANG Bai-ming1，QIN Li-de1，2 ，WANG Shu-ting1，LIU Ying-chun3，SUN Xiao-liang1，LI Xue-ping4，WANG Yu-dong1，

WANG Xiao-yin1， ZHAO Si-jun1，CAO Xu-min1，LIU Kun1，WANG Shu-bai5， SONG Cui-ping1

（1. China Animal Health and Epidemiology Center， Qingdao? 266032， Shandong，China；2. College of Veterinary Medicine， Shanxi Agricultural University，Jinzhong? 030031， Shanxi，China；3. Qingdao Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Qingdao? 266032， Shandong，China；

4.Qingdao Jiulian Group Co.，Ltd，Qingdao? 266611， Shandong，China；5. College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University， Qingdao? 266032， Shandong，China）

Abstract： An ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method was established for the simultaneous detection of 55 types of antibacterial drugs， including sulfonamides， macrolides， and quinolones， in organic fertilizer.After grinding and sieving the organic fertilizer into experimental samples， they were purified using HLB solid-phase extraction column. After loading， the samples were sequentially washed with deionized water and 5% acetonitrile aqueous solution， eluted with methanol/ethyl acetate solution （volume ratio 7∶3， containing 5% ammonia）， blown dry with nitrogen， and re-dissolved in 0.1% formic acid water/acetonitrile （volume ratio 9∶1）；measurement was carried out in a multi reaction detection mode， with the external standard method for quantification. The results showed that among the four batches of organic fertilizers， 55 drugs had a good linear relationship （R2>0.990） within the range of 1.0～100 μg/kg，the detection limit of this method was 2.0～7.5 μg/kg，the quantitative limit was 5.0～25.0 μg/kg，the recovery rates of various drugs were 60.2%～118.7%，the relative standard deviation within the batch （n=5） was 0.5%～15.0%， and the relative standard deviation between batches （n=20） was 4.3%～24.1%. This method was simple and reliable， with a good purification effect， and was suitable for the simultaneous detection of sulfonamide， quinolone， and macrocyclic lipid drugs in organic fertilizer.

Key words： organic fertilizer； UPLC-MS/MS； rapid detection； antibacterial drugs

張柏銘，秦立得，王淑婷，等. UPLC-MS/MS法同時(shí)快速檢測(cè)有機(jī)肥中55種抗菌藥物［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，63（5）：175-181．

中國(guó)每年生產(chǎn)肉蛋奶1.5億t，伴隨產(chǎn)生畜禽糞污約31億t［1］。畜禽糞污是制造有機(jī)肥的重要原料，農(nóng)田施用有機(jī)肥可改善土壤肥力，對(duì)形成種植業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)良性循環(huán)具有重要意義。中國(guó)動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)節(jié)大量使用抗菌藥物，2019年用量為3.7萬(wàn)t，30%～90%抗菌藥物代謝至體外并最終進(jìn)入糞污［2］。常用的有機(jī)肥制作方法難以高效降解畜禽糞污中的抗菌藥物，導(dǎo)致有機(jī)肥中普遍檢測(cè)出抗菌藥物殘留［3-5］?？咕幬镫S肥料進(jìn)入環(huán)境，可增加細(xì)菌耐藥性選擇壓力，促進(jìn)抗菌藥物抗性基因積累，導(dǎo)致致病菌耐藥性增強(qiáng)，影響公共衛(wèi)生安全［6-8］。

有機(jī)肥成分復(fù)雜，基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大，目前已有檢測(cè)其中喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類等多類藥殘留的方法［9-13］。但在樣品檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，這些方法存在耗材成本較高、基質(zhì)干擾嚴(yán)重、方法不穩(wěn)定、檢測(cè)藥物種類較少等缺點(diǎn)。本試驗(yàn)采用乙腈與EDTA-Mcllvaine緩沖液作為提取液，HLB固相萃取柱對(duì)有機(jī)肥樣品進(jìn)行前處理，運(yùn)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）進(jìn)行檢測(cè)，建立能同時(shí)檢測(cè)有機(jī)肥中喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類等畜禽養(yǎng)殖環(huán)節(jié)常用抗菌藥物殘留的方法，該方法靈敏度高、準(zhǔn)確度高，適用于大批量樣品的檢測(cè)，可為監(jiān)測(cè)畜禽糞污中抗菌藥物含量并評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Aglient 6470型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀［配備分析軟件，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司］，5804R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)［艾本德（上海）國(guó)際貿(mào)易有限公司］，Milli-Q型超純水儀［密理博儀器（上海）有限公司］，CP225D型電子天平［賽多利斯斯泰帝（上海）貿(mào)易有限公司］，UMV-2型多功能振蕩器（日照億嵐儀器設(shè)備有限公司），KQ-500DE型超聲波儀（昆山市超聲儀器公司）。

1.2 主要試劑

色譜純級(jí)乙腈、甲醇、甲酸，分析純級(jí)乙酸、氨水等試劑均購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類3類55種藥物標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司和德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）等試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；去離子水為實(shí)驗(yàn)室自制。HLB 固相萃取柱（3 mL，60 mg）購(gòu)自美國(guó)沃特世公司；0.22 μm濾膜等耗材購(gòu)自天津市津騰科技有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取磺胺二甲基異嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg，用甲醇充分溶解后定容至25 mL，配制成濃度為 100 μg/mL的磺胺二甲基異嘧啶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用同樣的方法分別配制其余54種藥物儲(chǔ)備液，-20 ℃冷凍保存。從上述55種藥物儲(chǔ)備液中分別吸取250 μL溶液至25 mL容量瓶中，用甲醇定容并混勻，配制成各種藥物濃度為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取 有機(jī)肥經(jīng)研磨，過(guò)1.7 mm試樣篩，制成試驗(yàn)樣品。將不含55種藥物的有機(jī)肥作為空白樣品。準(zhǔn)確稱取樣品（2.00±0.02） g于50 mL離心管中，加入5 mL EDTA-Mcllvaine（pH=4.0）緩沖液，振蕩混合均勻；加入20 mL乙腈/乙酸（體積比為9∶1），混合均勻后，超聲波處理15 min，振蕩15 min，8 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

1.4.2 樣品凈化 取2.5 mL上清液，置于45 ℃水浴氮吹儀中緩慢濃縮至液體體積小于0.5 mL，加入??? 5 mL EDTA-Mcllvaine緩沖液復(fù)溶，振蕩1 min。HLB固相萃取柱用 3 mL甲醇、3 mL去離子水活化，將前一步復(fù)溶液全部過(guò)柱，依次用3 mL去離子水、? 3 mL 5%乙腈水溶液淋洗。用3 mL甲醇/乙酸乙酯溶液（體積比7∶3，含5%氨水）洗脫固相萃取柱，收集洗脫液，45 ℃水浴氮吹儀吹干。加入1 mL 0.1% 甲酸水/乙腈（體積比為9∶1）復(fù)溶液溶解殘?jiān)?，渦旋20 s，超聲波處理2 min，渦旋20 s，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后裝瓶上機(jī)檢測(cè)。

1.5 測(cè)定條件

1.5.1 液相色譜條件 色譜柱為BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫35 ℃，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為 0.1%甲酸溶液，流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣體積為5.0 μL，梯度洗脫條件如表1所示。

1.5.2質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源，正離子掃描模式（ESI+），檢測(cè)方式為多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）；載氣溫度為250 ℃，載氣氣流為7 L/min，鞘氣溫度為325 ℃，鞘氣流速為11 L/min。55種藥物的質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

1.6 線性范圍和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

有機(jī)肥空白樣品經(jīng)過(guò)“1.4”前處理方法提取、凈化后，添加不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，配制成藥物濃度分別為 1.0、1.5、2.0、5.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液并上機(jī)分析。以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.7 回收率、檢出限和定量限

向2.00 g空白有機(jī)肥樣品中添加不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按“1.4”前處理對(duì)樣品進(jìn)行處理，上機(jī)檢測(cè)。綜合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，當(dāng)特征離子色譜峰信噪比S/N≥10時(shí)，對(duì)應(yīng)的樣品抗菌藥物濃度為定量限（LOQ）；S/N≥3時(shí)，對(duì)應(yīng)的樣品抗菌藥物濃度為檢出限（LOD）。

在4批有機(jī)肥樣品（每批樣品5個(gè)重復(fù)）中分別添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，使其成為藥物濃度為25 μg/kg的陽(yáng)性樣品，測(cè)定55種藥物的回收率，并計(jì)算批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.8 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用本試驗(yàn)建立的方法對(duì)山東省4家有機(jī)肥場(chǎng)采集的4份有機(jī)肥樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 提取方法優(yōu)化 參考相關(guān)文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)的提取方法［9-13］，對(duì)比甲醇、乙腈、乙酸乙酯、EDTA-Mcllvaine緩沖液等不同提取液的提取效果。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用甲醇、乙酸乙酯作為提取液時(shí)，會(huì)提取到大量雜質(zhì)并難以凈化；使用乙腈作為提取液時(shí)，提取到的雜質(zhì)較少，藥物回收率較高；使用EDTA-Mcllvaine緩沖液有助于喹諾酮類藥物的提取。因此，本研究采用乙腈-EDTA-Mcllvaine緩沖液作為提取液，并對(duì)比了乙腈與EDTA-Mcllvaine緩沖液不同混合比例的提取效果。結(jié)果表明，EDTA-Mcllvaine緩沖液與乙腈的體積比為1∶4時(shí)，提取效果最佳（圖1）。研究發(fā)現(xiàn)，在提取液中加入10%乙酸有助于提升提取效果，最優(yōu)的提取液配比為EDTA-Mcllvaine緩沖液∶乙腈（10%乙酸）=1∶4（體積比）。此外，超聲波處理有助于大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類藥物的提取［14］，本試驗(yàn)中提取體系超聲波處理時(shí)間為15 min。

2.1.2 凈化方法優(yōu)化 對(duì)淋洗液進(jìn)行優(yōu)化，比對(duì)5%甲醇水溶液、10%甲醇水溶液、5%乙腈水溶液、10%乙腈水溶液的淋洗效果。結(jié)果表明，10%乙腈水溶液、10%甲醇水溶液作為淋洗液時(shí)，降低了部分抗菌藥物的回收率；5%乙腈水溶液去除雜質(zhì)的效果較好，回收率較高。因此本研究選用5%乙腈水溶液作為淋洗液（圖2）。

1為5%甲醇水溶液；2為10%甲醇水溶液；3為5%乙腈水溶液；4為10%乙腈水溶液

2.1.3 洗脫液優(yōu)化 對(duì)固相萃取柱上保留的目標(biāo)藥物進(jìn)行洗脫，含氨水的甲醇能夠較好地洗脫目標(biāo)藥物，但洗脫的雜質(zhì)較多；乙酸乙酯洗脫的雜質(zhì)較少，但不能有效洗脫大部分藥物。試驗(yàn)對(duì)比了不同比例乙酸乙酯和甲醇混合洗脫液對(duì)目標(biāo)藥物的洗脫效果，并優(yōu)化了洗脫液中氨水的濃度。結(jié)果表明，70%甲醇/乙酸乙酯（體積比7∶3，含5%氨水）作為洗脫液時(shí)洗脫效果最佳（圖3）。

1為5%氨化甲醇溶液（體積比為5∶95）；2為50%甲醇/乙酸乙酯溶液（體積比為1∶1）；3為50%甲醇/乙酸乙酯溶液（體積比為1∶1，含2%氨水）；4為50%甲醇/乙酸乙酯溶液（體積比為1∶1，含5%氨水）；5為70%甲醇/乙酸乙酯溶液（體積比為7∶3）；6為70%甲醇/乙酸乙酯溶液（體積比為7∶3，含2%氨水）；7為70%甲醇/乙酸乙酯溶液（體積比為7∶3，含5%氨水）

2.2 線性范圍和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線

以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，以離子峰面積為縱坐標(biāo)，制作基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。目標(biāo)藥物在1～100 μg/kg的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.990 0，如表3所示。

2.3 回收率、檢出限、定量限 、批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

由表4可知，該方法的檢出限為2.0～7.5 μg/kg，定量限為5.0～25.0 μg/kg；4批有機(jī)肥樣品中55種藥物的回收率為60.2%～118.7%；批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）為0.5%～15.0%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=20）為4.3%～24.1%。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

使用本檢測(cè)方法對(duì)山東省采集的4份有機(jī)肥進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，1份樣品中未檢測(cè)出55種藥物殘留，其余3份均有藥物殘留檢出，其中1份樣品中檢測(cè)出恩諾沙星殘留，殘留濃度為120.0 μg/kg；1份樣品中檢測(cè)出恩諾沙星、環(huán)丙沙星和替米考星藥物殘留，殘留濃度分別為173.4、16.3、51.6 μg/kg；1份樣品中檢測(cè)出恩諾沙星、環(huán)丙沙星和達(dá)氟沙星藥物殘留，殘留濃度分別為112.0、49.0、18.7 μg/kg。

3 小結(jié)

本研究?jī)?yōu)化了提取液、提取方法、淋洗液、洗脫液等前處理步驟，建立了能同時(shí)檢測(cè)有機(jī)肥中磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類3類55種抗菌藥物殘留的UPLC-MS/MS方法。與文獻(xiàn)報(bào)道方法和國(guó)標(biāo)方法相比，該方法的凈化效果較好，使用的耗材成本較低，檢測(cè)靈敏度和重復(fù)性滿足檢測(cè)需求，可實(shí)現(xiàn)對(duì)有機(jī)肥中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類3類55種抗菌藥物的快速檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 農(nóng)業(yè)部新聞辦公室.農(nóng)業(yè)部：加快推進(jìn)畜禽廢棄物資源化利用促進(jìn)畜牧業(yè)綠色發(fā)展［J］.吉林農(nóng)業(yè)，2017（14）：14-15.

［2］ 趙 琪，李 霆，姜子楠，等.2019年我國(guó)獸用抗菌藥物使用情況分析研究［J］.中國(guó)獸藥雜志，2022，56（1）：71-76.

［3］ 張俊亞，隋倩雯，魏源送.畜禽糞污處理處置中危險(xiǎn)生物因子賦存與控制研究進(jìn)展［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2021，40（11）：2342-2354.

［4］ 劉欣雨， 張建強(qiáng)， 黃 雯， 等. 中國(guó)土壤中抗生素賦存特征與影響因素研究進(jìn)展［J］. 土壤，2021， 53（4）： 672-681.

［5］ 楊 威，狄彩霞，李 季，等.我國(guó)有機(jī)肥原料及商品有機(jī)肥中四環(huán)素類抗生素的檢出率及含量［J］.植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2021，27（9）：1487-1495.

［6］ XIE W Y， SHEN Q， ZHAO F J. Antibiotics and antibiotic resistance from animal manures to soil：A review［J］. European journal of soil science， 2018， 69（1）： 181-195.

［7］ LI W C. Occurrence， sources， and fate of pharmaceuticals in aquatic environment and soil［J］. Environmental pollution， 2014， 187： 193-201.

［8］ 常 靜，李蘊(yùn)華，鳳 英，等.畜禽糞污源抗生素污染對(duì)土壤和作物的潛在風(fēng)險(xiǎn)及對(duì)策［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2020，41（6）：50-55.

［9］ GB/T 40462—2021， 有機(jī)肥料中19種獸藥殘留量的測(cè)定 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［S］.

［10］ GUO C， WANG M， XIAO H， et al. Development of a modified QuEChERS method for the determination of veterinary antibiotics in swine manure by liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］. Journal of chromatography B， 2016， 1027： 110-118.

［11］ 田 野.固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定有機(jī)肥中13種抗菌藥物殘留［J］.中國(guó)土壤與肥料，2017（2）：162-168.

［12］ 史 麗，李昌偉，趙 魯，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定有機(jī)肥中9種抗菌藥物藥物殘留［J］.中國(guó)土壤與肥料，2014（6）：111-115.

［13］ 冷遠(yuǎn)鵬，薛曉康，孫 華.固相萃取-高效液相色譜質(zhì)譜法測(cè)定有機(jī)肥中18種抗菌藥物殘留［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（11）：146-152.

［14］ DASENAKI M E， THOMAIDIS N S. Multi-residue determination of 115 veterinary drugs and pharmaceutical residues in milk powder，butter，fish tissue and eggs using liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Analytica chimica acta， 2015， 880： 103-121.