趙麗平 張雯雯 陳瓊 孫偉 張文謙 馬曉雯

摘要：以息半夏的塊莖為原料，乙醇為超聲波輔助提取溶劑，考察乙醇體積分數(shù)、超聲時間、料液比、超聲溫度等單因素對總生物堿提取率的影響，設計正交試驗優(yōu)化提取工藝，并測試總生物堿的體外抗氧化和降血糖活性。結(jié)果表明，最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)65%、提取時間60 min、料液比1∶45、超聲溫度65 ℃，總生物堿的提取率達0.502%；總生物堿對DPPH、ABTS自由基的清除率分別達89.90%和43.60%，對α-葡萄糖苷酶的抑制率達86.40%。該工藝簡單可行，總生物堿表現(xiàn)出良好的體外抗氧化和降血糖生物活性。

關鍵詞：息半夏；總生物堿；正交試驗；抗氧化；降血糖

中圖分類號：R284.2???????? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）05-0151-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.027??????????? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Optimization of extraction process of total alkaloids from Pinellia ternata and their biological activity analysis

ZHAO Li-ping，ZHANG Wen-wen，CHEN Qiong，SUN Wei，ZHANG Wen-qian，MA Xiao-wen

（School of Pharmaceutical Engineering， Xinyang Agriculture and Forestry University， Xinyang? 464000， Henan， China）

Abstract： Taking the tuber of Pinellia ternata as raw material and ethanol as ultrasonic-assisted extraction solvent， the influence of single factors such as ethanol volume fraction， ultrasonic time， material-liquid ratio and ultrasonic temperature on total alkaloids extraction rate was investigated. The orthogonal test was designed to optimize the extraction process， and the in vitro antioxidant and hypoglycemic activities of total alkaloids were tested. The results showed that the optimal extraction condition was ethanol volume fraction of 65%， extraction time of 60 min， the material-liquid ratio of 1∶45， ultrasonic temperature of 65 ℃， and the extraction rate of total alkaloids was 0.502%； the clearance of DPPH and ABTS radicals reached 89.90% and 43.60%， respectively， and the inhibition of α-glucosidase reached 86.40%. The process was simple and feasible， and the total alkaloids showed good in vitro antioxidant and hypoglycemic biological activities.

Key words： Pinellia ternata； total alkaloids； orthogonal test； antioxidant； hypoglycemic action

收稿日期：2022-08-29

基金項目：河南省科技攻關項目（212102310343）；河南省創(chuàng)新示范專項（201111310900）；校級高水平科研孵化器建設基金資助項目（FCL202008）；校級優(yōu)秀基層組織建設項目（YXJCJXZZ202003）

作者簡介：趙麗平（1979-），女，河南許昌人，副教授，碩士，主要從事分析化學研究，（電話）13083769226（電子信箱）zhaoliping200908@163.com；通信作者，張文謙（1992-），女，河南信陽人，講師，博士，主要從事中藥化學方面研究，（電話）18568296520（電子信箱）836353231@qq.com。

趙麗平，張雯雯，陳 瓊，等. 息半夏總生物堿的提取工藝優(yōu)化及其生物活性分析［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2024，63（5）：151-155，161．

半夏為天南星科半夏（Pinellia ternata）的干燥塊莖，味辛、性溫。河南省信陽息縣盛產(chǎn)半夏，其特點“個大、色白、粉量足、療效好”，稱為息半夏［1，2］。息半夏中含有生物堿、有機酸、多糖、揮發(fā)性油等多種有效成分，且生物堿是主要的活性成分之一［3，4］。生物堿具有降血糖、降脂、抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抑制慢性髓性白血病細胞等作用［4-7］。目前生物堿提取方法有很多，溶劑提取法因操作簡單、成本低等優(yōu)點而較為常用［8］，主要有水提取法［9］、醇類溶劑提取法［10］、親脂性有機溶劑提取法［11］、超聲波輔助提取法［12］等。

本試驗以息半夏為原材料，采用乙醇作為溶劑超聲波輔助提取，設置單因素試驗，正交試驗優(yōu)化提取工藝，再經(jīng)酸水-堿化-親脂性有機溶劑萃取提取物，以除去總生物堿中的脂溶性雜質(zhì)，并考察了息半夏總生物堿的抗氧化性和降血糖活性，以期為息半夏的開發(fā)利用提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

R301旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器（上海一科儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水真空泵（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；JA5003電子天平（上海方瑞儀器有限公司）；R301恒溫水浴鍋（上海一科儀器有限公司）；CR-040S春霖超聲波清洗機（深圳市春霖超聲波科技有限公司）；YLB-2000數(shù)顯電熱鼓風干燥箱（廣州科域新材料技術有限公司）；FW-400A傾斜式高速萬能粉碎機（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；722可見分光光度計（上海奧譜勒儀器有限公司）。

息半夏（河南息半夏藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)信陽農(nóng)林學院陳瓊教授鑒定為天南星科植物半夏的干燥塊莖）；麻黃堿（0.468 mg/mL，信陽市食品藥品檢驗所提供）；36%HCl、過硫酸鉀（分析純，武漢市中天化工有限責任公司）；99.5%甲醇、無水乙醇、維生素C（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；溴麝香草酚藍（分析純，國藥化學試劑有限公司）；鄰苯二甲酸氫鉀（分析純，天津市巴斯夫化工有限公司）；1，1-2二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，分析純，福州飛凈生物科技有限公司）；2，2′-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，分析純，合肥博美生物科技有限公司）；α-葡萄糖苷酶 （超級純，酶活力≥5 U/mg，合肥巴斯夫生物科技有限公司）；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG，純度≥99.0%，上海明豐生物科技有限公司）；阿卡波糖（分析純，成都迪維樂普科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 息半夏生物堿的提取 參照文獻［13-15］的方法，有所改動。粉碎干燥的息半夏塊莖過40目篩，稱取2.0 g息半夏粉末，加入50 mL體積分數(shù)為80%的乙醇溶液，在提取溫度30 ℃、超聲功率240 W的條件下超聲提取40 min，將提取液抽濾，得到總生物堿粗提取液-I；精密量取10 mL總生物堿粗提取液，用酸溶堿沉法除去脂溶性等雜質(zhì)，加入等體積的2%HCl溶液，靜置30 min，將不溶物濾除，加5%NaOH溶液至pH為11～12，加入三氯甲烷于分液漏斗中萃取3次，萃取液蒸發(fā)濃縮，得息半夏生物堿樣品液-II。

1.2.2 單因素試驗 稱取2.0 g息半夏粉末（過40目篩），保持超聲功率為240 W不變條件下，在乙醇體積分數(shù)為75%、超聲時間為60 min、料液比為1∶25、超聲溫度45 ℃的基礎上，以息半夏總生物堿得率為評價指標，進行單因素試驗，考察不同乙醇體積分數(shù)、超聲時間、料液比、超聲溫度對總生物堿得率的影響［16，17］。

1.2.3 正交試驗設計 乙醇作為溶劑，以息半夏總生物堿的提取率為評價指標，以乙醇體積分數(shù)（A）、超聲時間（B）、料液比（C）、超聲溫度（D）作為單因素影響因素，通過SPSS軟件中的L9（34）表設計正交試驗［18］，見表1。

1.2.4 標準曲線的制作 參照文獻［19］酸性染料比色法。分別精密量取濃度為0.468 mg/mL的生物堿對照品溶液0.1、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于帶塞試管中，加甲醇溶液至2 mL，加入0.125 mg/mL的溴麝香草酚藍溶液10 mL（pH 5.9的PBS緩沖溶液為溶劑），振蕩30 s后加入10 mL氯仿?lián)u勻、靜置，取氯仿層，用脫脂棉過濾，在416 nm波長下測吸光度。以對照品溶液的濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，得標準線性回歸方程A = 0.090 4C + 0.105 6，R2 = 0.999 3。結(jié)果表明，總生物堿質(zhì)量濃度在3.9～39 mg/L時線性關系良好。

1.2.5 總生物堿得率的計算 將息半夏總生物堿提取液在416 nm下測吸光度，根據(jù)回歸方程，計算總生物堿提取液的濃度，按式（1）計算生物堿得率。

[W=c×D×Vm×100%]??? ? ?????????（1）

式中，W表示總生物堿得率；c表示根據(jù)吸光度計算出的溶液質(zhì)量濃度（mg/mL）；D表示溶液稀釋倍數(shù)；V表示供試品溶液體積（mL）；m表示樣品質(zhì)量（mg）。

1.2.6 驗證試驗 考察最佳提取工藝的準確性與穩(wěn)定性，在最佳工藝條件下，進行3次平行驗證試驗，并計算息半夏總生物堿的平均得率。

1.2.7 息半夏總生物堿提取物生物活性試驗 樣品的制備按照“1.2.1”中步驟，利用最優(yōu)提取條件提取息半夏總生物堿，得粗提液；將粗提液平均分成2份，一份為樣品液-I；另一份粗提液經(jīng)酸溶堿沉后得到樣品液-II；將樣品液-I和樣品液-II分別經(jīng)三氯甲烷萃取，真空濃縮，40 ℃干燥。得到不同質(zhì)量的總生物堿提取物樣品-I和樣品-II，再分別用95%乙醇配制成10、15、20、25、30 mg/mL質(zhì)量濃度的樣品溶液。

1）DPPH自由基清除試驗。參照文獻［19，20］的方法，稍作改動。分別取不同質(zhì)量濃度樣品溶液2 mL，加入0.2 mmol/L DPPH溶液4 mL，混勻，在25 ℃條件下避光靜置反應45 min后，在517 nm下測吸光度為A1；用無水乙醇代替2 mL樣品溶液作為空白組，測吸光度為A0。用同質(zhì)量濃度的維生素C溶液作為陽性對照。按式（2）計算不同質(zhì)量濃度的總生物堿溶液對DPPH自由基的清除率。

DPPH自由基清除率=[A0-A1A0×100%]??????? （2）

2）ABTS自由基清除試驗。精密量取7.2 mmol/L ABTS溶液27 mL與2.52 mmol/L過硫酸鉀溶液3 mL于錐形瓶中，避光靜置反應16 h，得到ABTS自由基溶液，用去離子水稀釋3倍至在734 nm下測得吸光度為0.701作為ABTS工作液。參照文獻［21，22］的方法稍作改動，取不同質(zhì)量濃度樣品溶液1 mL，分別加入3 mL ABTS工作液混合，室溫下反應8 min，在波長734 nm下測吸光度為A1；取1 mL去離子水代替樣品溶液作為空白組，測吸光度為A0。用同質(zhì)量濃度的維生素C溶液作為陽性對照。按式（3）計算不同質(zhì)量濃度的總生物堿溶液對ABTS自由基的清除率。

ABTS自由基清除率=[A0-A1A0×100%]? ??? ?（3）

3）α-葡萄糖苷酶抑制試驗。依據(jù)參考文獻［23-26］方法稍作修改，取不同質(zhì)量濃度樣品溶液各2 mL，分別加入2 mL PBS緩沖溶液與1 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液2 mL，混勻，于37 ℃水浴鍋中反應15 min，分別加入4 mmol/L PNPG溶液1 mL，37 ℃溫度下反應15 min后，加入0.3 mol/L Na2CO3溶液?? 5 mL終止反應，在波長405 nm下測吸光度為A1；用PBS緩沖溶液代替樣品溶液作為空白組，測吸光度為A0。用同質(zhì)量濃度的阿卡波糖溶液作為陽性對照。按式（4）計算不同質(zhì)量濃度的總生物堿溶液對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

α-葡萄糖苷酶抑制率=[A0-A1A0×100%]??? （4）

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對總生物堿得率的影響 由圖1可知，乙醇體積分數(shù)在55%～75%時，總生物堿得率呈增加趨勢；乙醇體積分數(shù)為75%時，總生物堿得率達最大，為0.245%，隨后呈下降趨勢。原因可能是隨著乙醇含量的增加，溶劑滲透作用增強，總生物堿逐漸溶出；當乙醇體積分數(shù)不斷增大時，溶液中脂溶性物質(zhì)溶出的量也增加，使總生物堿得率下降［27，28］。因此，選取乙醇體積分數(shù)為65%、75%、85%三個水平來考察總生物堿提取的最佳乙醇體積分數(shù)。

2.1.2 超聲時間對總生物堿得率的影響 由圖2可知，總生物堿得率隨超聲時間增加呈增加趨勢，時間為60 min時，得率最大，為0.284%，之后呈下降趨勢。原因可能是超聲時間過長，會伴隨著總生物堿其他化學反應的發(fā)生，破壞了生物堿的結(jié)構(gòu)，使總生物堿得率有所下降。因此，選取超聲時間為50、60、70 min三個水平來考察總生物堿提取的最佳時間。

2.1.3 料液比對總生物堿得率的影響 由圖3可知，總生物堿得率隨溶劑體積的增大而增大，料液比為1∶35時，得率最高，為0.397 9%，之后總生物堿得率隨溶劑體積的增大而有所減小。原因可能是溶劑量的增加，息半夏溶解更充分，使總生物堿更易溶出，所以得率增大；然而，當增加過多的溶劑，一是稀釋總生物堿提取液，二是脂溶性成分大量溶出，使總生物堿得率下降［29］。因此，選取料液比為1∶25、1∶35、1∶45三個水平來考察總生物堿提取的最佳料液比。

2.1.4 超聲溫度對總生物堿得率的影響 由圖4可知，總生物堿得率隨超聲溫度升高而增大，溫度達65 ℃時，得率最高，為0.401%，之后總生物堿得率隨溫度的升高而減小。原因可能是溫度的升高有利于總生物堿的溶出，但溫度過高時，總生物堿成分會發(fā)生化學結(jié)構(gòu)的變化，所以得率下降。因此，選取超聲提取溫度為45、55、65 ℃三個水平來考察總生物堿提取的最佳溫度。

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

以乙醇體積分數(shù)（A）、超聲時間（B）、料液比（C）、超聲溫度（D）為單因素，息半夏總生物堿得率為評價指標，設計四因素三水平的正交試驗結(jié)果如表2所示。

由表2中的R值可判斷，對息半夏總生物堿得率影響順序為D> B> C > A，即超聲溫度的影響最大，其次是超聲時間、料液比、乙醇體積分數(shù)。通過表中的K值可判斷出最佳的提取工藝條件是A1B2C3D3，即乙醇體積分數(shù)為65%，超聲時間為60 min，料液比為1∶45，超聲溫度為65 ℃。

在最佳工藝條件下提取息半夏總生物堿，重復3次，算其平均值。3次得率分別為0.502%、0.498%、0.506%，總生物堿的平均得率為0.502%，RSD為0.80%<1.5%，試驗結(jié)果優(yōu)于正交試驗的其他條件組合，表明該最佳工藝條件穩(wěn)定、可行。

2.3 總生物堿提取物的生物活性結(jié)果分析

2.3.1 DPPH、ABTS自由基清除試驗結(jié)果與分析 由圖5、圖6可知，DPPH和ABTS自由基的清除率隨樣品質(zhì)量濃度的增加而增大；分別對DPPH和ABTS自由基進行清除，經(jīng)過酸溶堿沉的總生物堿樣品-II比粗提樣品-I對自由基的清除率要大；樣品質(zhì)量濃度在30 mg/mL時，樣品-II對DPPH、ABTS自由基的清除率分別達89.90%和43.60%；樣品質(zhì)量濃度為10～30 mg/mL范圍內(nèi)，總生物堿對DPPH自由基的清除率要大于ABTS自由基，這可能與總生物堿結(jié)構(gòu)有關；兩種樣品對自由基的清除能力均小于維生素C，但仍表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。

2.3.2 降血糖活性試驗結(jié)果與分析 由圖7可知，α-葡萄糖苷酶的抑制率隨樣品質(zhì)量濃度的增加而增大；酸溶堿沉的樣品-II比粗提樣品-I對α-葡萄糖苷酶的抑制率要大；樣品質(zhì)量濃度在10 mg/mL時，樣品-II對α-葡萄糖苷酶的抑制率達86.40%；樣品質(zhì)量濃度在2～10 mg/mL范圍，總生物堿對α-葡萄糖苷酶的抑制作用小于阿卡波糖，但仍表現(xiàn)出良好的抑制作用。

3 小結(jié)

正常機體內(nèi)含有一定的自由基，當體內(nèi)的自由基過多時會導致細胞膜受損，產(chǎn)生氧化應激增加，導致抗氧劑能力下降，就會引起不同疾病，比如高血糖、高血脂、糖尿病等［30］。本試驗對息半夏總生物堿超聲波輔助提取，其活性試驗顯示，息半夏總生物堿對ABTS和DPPH自由基均有清除作用，且對DPPH自由基的清除能力顯著高于ABTS自由基；對α-葡萄糖苷酶活性也有抑制作用，質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，抑制率高達86.40%；同時經(jīng)酸溶堿沉的總生物堿抗氧化和降糖活性均高于粗樣品。試驗表明，經(jīng)酸溶堿沉的息半夏總生物堿具有明顯的抗氧化和降血糖生物活性。該試驗為天然的抗氧化及降血糖成分研究提供一定的理論基礎，同時也拓寬了信陽息半夏的開發(fā)和利用。

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