摘 要：雙著絲粒染色體（ dicentric chromosome， dic） 半自動(dòng)化分析估算生物劑量已在國(guó)際上推廣應(yīng)用10 余年，技術(shù)成熟度高，且國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)（ IAEA） 出版的技術(shù)報(bào)告和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織發(fā)布的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)已推薦該方法估算劑量。但國(guó)內(nèi)尚未有相關(guān)技術(shù)規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)。專家組結(jié)合國(guó)內(nèi)30 余年基于dic 人工和半自動(dòng)化分析估算生物劑量的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，從dic 半自動(dòng)化分析原理、主要技術(shù)內(nèi)容、影響因素分析和實(shí)用舉例等方面給出dic 半自動(dòng)化分析估算生物劑量的技術(shù)共識(shí)，其主要技術(shù)內(nèi)容與現(xiàn)有GB/ T 28236 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相比，具有明顯提升生物劑量估算效率，降低對(duì)專業(yè)人員技術(shù)熟練程度要求，更有利于推廣應(yīng)用等優(yōu)勢(shì)。而且dic 半自動(dòng)化分析與人工分析一樣，可用于急性均勻、局部、遷延性照射和延遲采樣等不同輻射暴露場(chǎng)景下的受照劑量估算與重建。dic 半自動(dòng)化分析估算生物劑量的推廣應(yīng)用，可解決目前國(guó)內(nèi)生物劑量估算很難滿足發(fā)生大規(guī)模核與輻射事故受照人員眾多時(shí)的醫(yī)學(xué)應(yīng)急響應(yīng)臨床分類診斷需要的“ 瓶頸” ，為進(jìn)一步制定相關(guān)國(guó)家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：電離輻射;雙著絲粒染色體;半自動(dòng)化分析;生物劑量估算;專家共識(shí)

中圖分類號(hào)：R144. 1;TL73 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

在發(fā)生核與輻射事故時(shí)快速、高通量開展分類診斷和及時(shí)治療對(duì)減輕患者放射損傷甚至挽救患者生命至關(guān)重要，而生物劑量估算在及時(shí)發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)外照射急性放射損傷和臨床早期分類診斷過程中起著不可或缺的重要作用[1] 。外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變特別是雙著絲粒染色體（dicentricchromosome，dic）指標(biāo)作為國(guó)際學(xué)界公認(rèn)的輻射生物劑量估算的“金標(biāo)準(zhǔn)”，已廣泛應(yīng)用于包括1986年前蘇聯(lián)切爾諾貝利核電站事故、2011 年日本福島核電站事故以及國(guó)內(nèi)外一系列輻射事故受照人員的生物劑量估算，為這些受照者的診斷和治療提供了準(zhǔn)確的生物劑量資料[2] 。

國(guó)際上國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)（IAEA）于2011 年出版的技術(shù)報(bào)告[3] 和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO） 發(fā)布的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[4] 已推薦利用dic 半自動(dòng)化分析估算劑量。目前國(guó)內(nèi)生物劑量的估算仍然主要采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB / T 28236—2011《染色體畸變估算生物劑量方法》[5] 推薦的方法估算劑量，需要進(jìn)行全人工分析。該方法需要人工在顯微鏡下分析計(jì)數(shù)dic和著絲粒環(huán)（ring， r），并以每細(xì)胞dic+r 數(shù)估算生物劑量，不但費(fèi)時(shí)費(fèi)力、效率低，而且還需要經(jīng)驗(yàn)豐富的染色體畸變分析專業(yè)技術(shù)人員。一名有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員人工分析150 個(gè)細(xì)胞的染色體畸變至少需要3 h，而利用高通量染色體自動(dòng)化掃描系統(tǒng)自動(dòng)化檢測(cè)dic 只需要20 min，再進(jìn)行人工復(fù)核便可很容易識(shí)別出真陽(yáng)性dic 并剔除假陽(yáng)性dic（平均2 min），從而較為快速準(zhǔn)確地估算劑量[6] 。在此背景下，dic 半自動(dòng)化分析不但可以大大提高生物劑量估算的效率，還更有利于推廣應(yīng)用，凸顯優(yōu)勢(shì)。

目前自動(dòng)化檢測(cè)dic 的關(guān)鍵設(shè)備高通量染色體自動(dòng)掃描系統(tǒng)已在全國(guó)職業(yè)病防治和核工業(yè)系統(tǒng)普遍配置，為開展快速、高通量估算生物劑量提供了基本條件。但國(guó)內(nèi)尚未有相關(guān)技術(shù)規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合國(guó)內(nèi)和主要執(zhí)筆者單位30 余年基于dic人工和半自動(dòng)化分析估算生物劑量的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，提出一項(xiàng)明確的雙著絲粒染色體半自動(dòng)化分析估算生物劑量的專家共識(shí)，解決目前國(guó)內(nèi)生物劑量估算的“瓶頸”問題，滿足發(fā)生大規(guī)模核與輻射事故受照人員眾多時(shí)的醫(yī)學(xué)應(yīng)急響應(yīng)臨床分類診斷需要，為進(jìn)一步制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支撐，意義重大。

1 dic 半自動(dòng)化分析估算生物劑量的原理和適用范圍

早在20 世紀(jì)80 年代，國(guó)際上就開始嘗試開發(fā)染色體畸變自動(dòng)化分析系統(tǒng)。隨后，一些商業(yè)化的中期相掃描與核型分析軟件系統(tǒng)面市，并已經(jīng)在許多細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室中得到很好的應(yīng)用。其工作原理和主要流程：首先中期細(xì)胞掃描儀對(duì)染色體標(biāo)本進(jìn)行自動(dòng)化掃描;第二步將掃描檢測(cè)到的中期分裂相以數(shù)字化高分辨率中期相圖像格式自動(dòng)捕獲;然后，對(duì)中期分裂相圖像進(jìn)行詳細(xì)分析，以確定正常的染色體和候選的dic。所謂半自動(dòng)化分析，就是自動(dòng)化檢測(cè)到的候選dic 必須由有一定經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員確認(rèn)，但這比人工在顯微鏡下分析dic 簡(jiǎn)便、高效得多[2-3] 。系統(tǒng)檢測(cè)到并標(biāo)注的候選dic 很容易被區(qū)分確認(rèn)，如圖1a 顯示的是真陽(yáng)性dic，對(duì)于大多數(shù)假陽(yáng)性的dic（如人為因素、重疊染色體）也很容易被排除，見圖1b[7] 。最后以每細(xì)胞dic 數(shù)為指標(biāo)建立劑量-效應(yīng)曲線，實(shí)現(xiàn)了基于dic 自動(dòng)化分析的生物劑量估算半自動(dòng)化，可用于發(fā)生大規(guī)模核與輻射事故時(shí)的生物劑量估算和臨床分類診斷。

本共識(shí)給出了電離輻射誘發(fā)人外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變分析中的微量全血培養(yǎng)、標(biāo)本制備、dic 半自動(dòng)化分析，以及用其建立劑量-效應(yīng)曲線和估算生物劑量的方法等，適用于一次比較均勻的全身外照射核與輻射事故受照人員的生物劑量估算，也適用于一次比較均勻的全身外照射復(fù)合燒傷受照人員的生物劑量估算。不適用于長(zhǎng)期低劑量累積照射和內(nèi)照射的生物劑量估算。

2 dic 半自動(dòng)化分析估算生物劑量的主要技術(shù)共識(shí)

2. 1 主要儀器設(shè)備和試劑配制

2. 1. 1 常規(guī)儀器

包括用于接種細(xì)胞的超凈工作臺(tái)，用于培養(yǎng)細(xì)胞的恒溫培養(yǎng)箱，用于分離細(xì)胞的大容量普通水平式離心機(jī)，用于分析染色體畸變的光學(xué)顯微鏡（帶坐標(biāo)刻度），用于低滲細(xì)胞的水浴箱，用于儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)試劑具備-20 ℃ 和4 ℃ 條件的冰箱，用于靜脈血保存（18～24 ℃ ）的定制保存運(yùn)輸箱等。

2. 1. 2 自動(dòng)化儀器

可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化中期相尋找、高倍圖像采集和dic 自動(dòng)化分析的高通量染色體自動(dòng)化掃描系統(tǒng);用于收獲中期相細(xì)胞的自動(dòng)化細(xì)胞收獲儀;用于染色體標(biāo)本制備的自動(dòng)化制片/ 滴片機(jī);用于染色體標(biāo)本染色的自動(dòng)化染片機(jī)。

2. 1. 3 試劑配制

RPMI-1640 培養(yǎng)基、低滲液、固定液、磷酸鹽緩沖液和吉姆薩（Giemsa）染液的配制參照GBZ/ T248 標(biāo)準(zhǔn)[8] 推薦的方法，其中培養(yǎng)基可購(gòu)買有產(chǎn)品注冊(cè)號(hào)的市售產(chǎn)品。

2. 2 外周靜脈血的采集、保存和運(yùn)輸

擬合劑量-效應(yīng)曲線時(shí)，采血樣前須獲取志愿者的知情同意。2 ～ 4 名健康成年人，非放射工作者，男女各半，年齡在18～60 歲，無煙酒嗜好，半年內(nèi)無急慢性疾病史、無射線和化學(xué)毒物接觸史，近一個(gè)月內(nèi)無病毒感染史。用真空肝素鈉或肝素鋰采血管，每人抽取靜脈血20 mL，顛倒混勻，用于離體照射和劑量-效應(yīng)曲線的擬合。

估算生物劑量時(shí)，采集靜脈血約4 ～ 5 mL，肝素抗凝，顛倒混勻，靜脈血保存和運(yùn)輸最佳溫度是18～24 ℃ ，24 h 內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室為宜。

2. 3 照射條件和微量全血培養(yǎng)

2. 3. 1 離體照射條件

必須提供可靠、明確的照射樣品的物理劑量，在室溫下進(jìn)行照射。受照樣品應(yīng)與照射源保持一定的距離以達(dá)到均勻照射的目的。有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立包括不同射線類型（如X 射線、γ 射線、中子）、不同劑量率的劑量-效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線;對(duì)于低傳能線密度（linear energy transfer， LET） 輻射，劑量范圍選擇0. 1 ～ 5. 0 Gy，劑量率介于0. 2 ～ 1. 0Gy/ min 之間，選擇不少于8 個(gè)劑量點(diǎn);對(duì)于高LET輻射，劑量范圍選擇0. 01 ～ 3. 0 Gy，以不少于7 個(gè)劑量點(diǎn)為宜;照射后在（37±0. 5）℃ 恒溫水浴箱中孵育修復(fù)2 h。

2. 3. 2 微量全血培養(yǎng)

取照射后的靜脈血0. 3～0. 5 mL 加入到5 mL含植物血凝素和20%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)開始加入終濃度為0. 015 ～ 0. 03 μg/mL 秋水酰胺或秋水仙素，在培養(yǎng)容器上編號(hào)并注明培養(yǎng)開始時(shí)間和日期，輕輕搖勻，（37±0. 5）℃ 恒溫培養(yǎng)48～52 h 收獲細(xì)胞。當(dāng)初估劑量大于5 Gy時(shí)，可分批次培養(yǎng)，將培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至56～72 h，以克服因大劑量照射而誘發(fā)的細(xì)胞分裂周期阻滯、可供分析細(xì)胞數(shù)比較少的問題[9-10] 。

2. 4 染色體標(biāo)本的制備

2. 4. 1 人工制備

人工制備染色體標(biāo)本的質(zhì)量受專業(yè)人員技術(shù)熟練程度和實(shí)驗(yàn)室溫、濕度等的影響較大，有條件的實(shí)驗(yàn)室配備自動(dòng)化制片設(shè)備為宜，以確保制備出的染色體標(biāo)本的穩(wěn)定性和質(zhì)量。

2. 4. 1. 1 低滲

終止培養(yǎng)后用吸管輕輕抽去培養(yǎng)瓶中的上清液，每瓶加入8 mL 37 ℃ 預(yù)溫的0. 075 mol/ L KCl，將細(xì)胞團(tuán)塊充分吹打后移至10 mL 的尖底玻璃離心管中，放入37 ℃ 恒溫水浴箱（鍋） 中低滲20 ～30 min。

2. 4. 1. 2 預(yù)固定和固定

取出低滲完畢的離心管，每管加入5～10 滴新配制的固定液（甲醇∶ 冰醋酸= 3 ∶ 1），用吸管吹打混勻，水平離心機(jī)中200～250 g 離心8～10 min。取出離心管，用吸管吸去上清液，沿管壁每離心管中加入8 mL 固定液，用吸管快速吹打細(xì)胞團(tuán)塊，常溫下固定20 ～ 30 min，在水平離心機(jī)中200 ～250 g 離心8～10 min，再重復(fù)固定1～2 次。

2. 4. 1. 3 制片

取出離心管，吸去上清液，根據(jù)細(xì)胞團(tuán)塊的大小每離心管中加入3 ～ 5 滴固定液以調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度。然后以一定高度（10 ～ 30 cm） 將細(xì)胞懸液滴在經(jīng)37 ℃ 水浴預(yù)熱或在4 ℃ 冰箱預(yù)冷的潔凈載玻片上，每張玻片滴2～3 滴，自然空氣干燥。

2. 4. 1. 4 編號(hào)和染色

對(duì)每一張染色體標(biāo)本片進(jìn)行編號(hào)，并按照編號(hào)做好記錄。將用pH 6. 8 的磷酸緩沖液配制的10% Giemsa 染液均勻涂于染色體標(biāo)本片上或置于染缸中，室溫下染色8 ～ 10 min，以一定傾角（ 約45°）用自來水輕輕沖洗，洗掉染液后置于玻片架上室溫自然晾干。

2. 4. 2 自動(dòng)化制備

配備有自動(dòng)化細(xì)胞收獲儀、自動(dòng)化制片/ 滴片機(jī)和自動(dòng)化染片機(jī)的實(shí)驗(yàn)室，可按照生產(chǎn)商提供的操作指南自動(dòng)化制備染色體標(biāo)本。自動(dòng)化制備出的染色體標(biāo)本相比人工有一定優(yōu)勢(shì)，如自動(dòng)化細(xì)胞收獲儀制備的細(xì)胞懸液細(xì)胞丟失少、質(zhì)量穩(wěn)定，且不需要經(jīng)驗(yàn)積累;自動(dòng)化制片機(jī)滴片較為均勻、不受溫濕度影響，制備的標(biāo)本質(zhì)量穩(wěn)定，亦不需要經(jīng)驗(yàn)積累等。

2. 5 dic 的半自動(dòng)化分析

2. 5. 1 分析方法

按照生產(chǎn)商提供的高通量染色體自動(dòng)化掃描系統(tǒng)操作指南對(duì)制備出的染色體標(biāo)本片進(jìn)行全玻片自動(dòng)化中期相尋找及高倍圖像采集，對(duì)采集到的高倍圖像使用相應(yīng)的DCScore 軟件進(jìn)行dic 自動(dòng)化分析，對(duì)軟件檢測(cè)到的所有dic 由人工根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確認(rèn)，剔除假陽(yáng)性dic 后，再導(dǎo)出軟件給出經(jīng)過人工確認(rèn)的dic 數(shù)和分析細(xì)胞數(shù)。

2. 5. 2 分析計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)要求

每例樣本應(yīng)分析計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)n = （1-p） ×96. 04/ p，其中p 為每細(xì)胞dic 數(shù)，p 可在計(jì)數(shù)分析一定數(shù)量的細(xì)胞后求得。

2. 6 劑量-效應(yīng)曲線的擬合

2. 6. 1 人工擬合

對(duì)X 或γ 射線誘導(dǎo)的dic 與受照射劑量之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系以擬合二次多項(xiàng)式為宜，Y = C +αD +βD2 ，其中Y 為每細(xì)胞dic 數(shù)，D 為照射劑量（Gy），C 為本底畸變率，α 為線性系數(shù)，β 為線性平方系數(shù)。利用已知的Y 和D 值計(jì)算出公式中的各項(xiàng)回歸系數(shù)，擬合出相應(yīng)的回歸方程式（劑量-效應(yīng)曲線），同時(shí)計(jì)算出回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)的P 值和檢驗(yàn)擬合度的相關(guān)性系數(shù) R2 值。

2. 6. 2 軟件擬合

按照得到國(guó)際學(xué)界公認(rèn)的免費(fèi)專業(yè)劑量-曲線刻度與劑量估算軟件CABAS 指南[11] ，將半自動(dòng)化分析得到的每細(xì)胞dic 數(shù)和對(duì)應(yīng)的照射劑量，分別輸入至該軟件，擬合出相應(yīng)的劑量-效應(yīng)曲線，其公式亦為Y = C +αD +βD2 ，同時(shí)軟件還給出了回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)的P 值和檢驗(yàn)擬合度的相關(guān)性系數(shù)R2 值。

2. 7 劑量估算

2. 7. 1 每細(xì)胞dic 數(shù)和95%置信限的計(jì)算

dic 符合泊松分布，計(jì)算出每細(xì)胞dic 數(shù)p、每細(xì)胞dic 數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤Sp 和每細(xì)胞dic 數(shù)的95%置信限95%CI：

2. 7. 2 估算受照劑量

將所要估算劑量的標(biāo)本中得到的每細(xì)胞dic及95%置信限的上、下限分別代入已建立的劑量-效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，估算出受照劑量，并出具劑量估算報(bào)告。事故受照人員生物劑量估算示例參見下文2. 10 節(jié)。

2. 8 質(zhì)量控制要求

2. 8. 1 進(jìn)行染色體畸變分析的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有2 名（含）以上專業(yè)技術(shù)人員，掌握電離輻射生物效應(yīng)和細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)，能識(shí)別包括dic 在內(nèi)的各類型染色體畸變。

2. 8. 2 染色體標(biāo)本應(yīng)有唯一性編號(hào)，標(biāo)本分析完畢后，應(yīng)置于玻片盒內(nèi)長(zhǎng)期保存，并做好記錄。

2. 8. 3 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期參加國(guó)家或省市組織的實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)。

2. 8. 4 實(shí)驗(yàn)室化學(xué)和生物安全符合國(guó)家法律法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的要求。

2. 9 dic 半自動(dòng)化分析估算劑量的注意事項(xiàng)

2. 9. 1 dic 半自動(dòng)化分析比較準(zhǔn)確估算劑量的范圍是0. 25～5. 0 Gy 之間。

2. 9. 2 事故后應(yīng)盡早取血，不宜超過8 周。

2. 9. 3 培養(yǎng)條件、制片方法和染色體畸變的判斷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)與建立劑量-效應(yīng)曲線時(shí)相同。

2. 9. 4 對(duì)估算劑量的個(gè)體，至少應(yīng)自動(dòng)化分析500 個(gè)中期相細(xì)胞或自動(dòng)化檢測(cè)到100 個(gè)dic。

以應(yīng)急為目的進(jìn)行分類診斷時(shí)，自動(dòng)化分析150 個(gè)細(xì)胞或計(jì)數(shù)30 個(gè)dic 估算的劑量可以滿足早期分類診斷的需要，而且估算劑量的誤差在1 Gy 內(nèi)[12] 。

2. 9. 5 應(yīng)選擇與事故條件接近，通過本實(shí)驗(yàn)室dic 自動(dòng)化分析系統(tǒng)或軟件擬合的刻度曲線進(jìn)行劑量估算， 在曲線劑量范圍內(nèi)應(yīng)用， 一般不得外推。

2. 9. 6 估算劑量時(shí)，除給出平均值以外，同時(shí)給出劑量范圍的95% 置信限。在計(jì)算95% 置信限時(shí)，可以忽略回歸方程式中由于不確定性的dic 率的標(biāo)準(zhǔn)誤，只計(jì)算dic 率的標(biāo)準(zhǔn)誤即可。

2. 10 dic 半自動(dòng)化分析估算生物劑量技術(shù)共識(shí)的應(yīng)用示例

某人受60 Co γ 射線一次全身照射，照后48 h內(nèi)取血，采用微量全血培養(yǎng)法制備染色體標(biāo)本，自動(dòng)化分析500 個(gè)中期相細(xì)胞，半自動(dòng)化檢測(cè)出dic184 個(gè)，估算其生物劑量。

將分析細(xì)胞數(shù)（500） 和檢測(cè)得到的dic 數(shù)（184）分別代入2. 7. 1 節(jié)公式（1）、（2） 和（3），計(jì)算出的每細(xì)胞dic 數(shù)為0. 368 0， 標(biāo)準(zhǔn)誤Sp 為0. 027 1，每細(xì)胞dic 數(shù)的95%置信限為0. 314 9 ～0. 421 1。

選擇河南省輻射生物與流行病學(xué)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（以下簡(jiǎn)稱“省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”）所建立的60 Co γ射線照射離體人外周血建立的dic 半自動(dòng)化分析的劑量-效應(yīng)曲線（該曲線的劑量范圍為0. 5～5. 0Gy，劑量率為0. 27 Gy/ min）：

Y = 0. 0001954+0. 044228D+0. 024628D2 （4）式中，Y 為每細(xì)胞dic 數(shù)，D 為劑量（Gy）。

將0. 368 0、0. 314 9 和0. 421 1 分別代入公式（4）中的Y 項(xiàng)，解方程后求出平均劑量為3. 07 Gy，95%置信限下限為2. 79 Gy、上限為3. 33 Gy。

亦可以將分析細(xì)胞數(shù)（500）、檢測(cè)得到的dic數(shù)（184）和公式（4） 的各項(xiàng)回歸系數(shù)輸入到劑量估算軟件CABAS 中，估算的平均劑量為3. 07 Gy，95%置信限下限為2. 80 Gy、上限為3. 35 Gy。

3 影響dic 半自動(dòng)化分析估算生物劑量的主要因素

自從2009 年法國(guó)學(xué)者Vaurijoux 等[13] 首次報(bào)道借助圖像分析系統(tǒng)半自動(dòng)化檢測(cè)dic 估算達(dá)喀爾輻射事故受照者的生物劑量以來，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者利用高通量染色體自動(dòng)化掃描分析系統(tǒng)分析dic，并刻度基于每細(xì)胞dic 數(shù)的劑量-效應(yīng)曲線，系統(tǒng)研究了dic 半自動(dòng)化分析估算生物劑量的影響因素和將其應(yīng)用于發(fā)生大規(guī)模核與輻射事故時(shí)快速、高通量劑量估算的可行性。

3. 1 不同實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置對(duì)dic 半自動(dòng)化分析構(gòu)建劑量曲線的影響

在MULTIBIODOSE EU FP7 [ The EuropeanUnion’s Seventh Framework Program （FP7/ 2007—2013）]計(jì)劃項(xiàng)目支持下，Romm 等[6] 報(bào)道了6 家歐盟生物劑量實(shí)驗(yàn)室建立了基于半自動(dòng)化dic 分析的劑量-效應(yīng)曲線，并分析了不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)劑量曲線的影響。在這6 家實(shí)驗(yàn)室中有2 家實(shí)驗(yàn)室用收獲前2 ～ 3 h 加秋水酰胺的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)方法，用熒光加Giemsa 染色制備染色體標(biāo)本;另4 家實(shí)驗(yàn)室是在收獲前24 h 加秋水酰胺，用Giemsa 染色制備標(biāo)本。dic 自動(dòng)化分析軟件（ DCScore V.3. 6. 7）分類器的參數(shù)分別按照法國(guó)輻射防護(hù)與核設(shè)施研究院（ Institut de Radioprotection et deSurete′ Nucle′aire， IRSN） 和德國(guó)聯(lián)邦輻射防護(hù)局（Bundesamt fuer Strahlenschutz， Bfs）推薦的方法設(shè)置。這6 家實(shí)驗(yàn)室采用3 種不同的分類器參數(shù)（IRSN-Class、Bsf-Class 和Bsf-First-Class）檢測(cè)dic，構(gòu)建了9 條γ 射線離體照射的劑量-效應(yīng)曲線。統(tǒng)計(jì)分析顯示，建立的這些劑量-效應(yīng)曲線間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所以可以將9 條曲線合并為一條總的曲線（Pooled;圖2）。表明不同實(shí)驗(yàn)室間、加秋水酰胺的時(shí)間以及采用不同的分類器參數(shù)對(duì)構(gòu)建劑量-效應(yīng)曲線沒有明顯影響?？傊@種半自動(dòng)化的dic 計(jì)數(shù)方法是應(yīng)對(duì)大規(guī)模核事故時(shí)快速和高通量的分類潛在受照者的有用工具，而且參加該項(xiàng)研究的6 家實(shí)驗(yàn)室所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可比性，說明可通過建立實(shí)驗(yàn)室間的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行快速劑量估算，以提高核與輻射醫(yī)學(xué)應(yīng)急響應(yīng)能力。

3. 2 自動(dòng)化分析檢測(cè)到的dic 假陽(yáng)性率與照射劑量的關(guān)系分析

上述跨實(shí)驗(yàn)室的研究還對(duì)dic 假陽(yáng)性率與照射劑量進(jìn)行了分析[6] ，發(fā)現(xiàn)隨著照射劑量的升高，每細(xì)胞dic 數(shù)升高，真陽(yáng)性dic 的比率亦升高，也就是說劑量越低，dic 的假陽(yáng)性率越高，如在照射劑量低于0. 5 Gy 時(shí)dic 假陽(yáng)性率在90%以上，而大于2 Gy 條件下dic 假陽(yáng)性率不超過20%。采用不同的DCScore 軟件分類器參數(shù)設(shè)置對(duì)檢測(cè)到dic真陽(yáng)性率沒有影響，無論是采用德國(guó)的Bsf-Class還是法國(guó)的IRSN-Class 分類器參數(shù)，檢測(cè)到的真陽(yáng)性率無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

“省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”在對(duì)dic 假陽(yáng)性率與照射劑量的關(guān)系分析中得到類似結(jié)果，DCScore 軟件自動(dòng)化檢測(cè)到的dic 假陽(yáng)性率有隨照射劑量的增加而降低的趨勢(shì)（99. 67% ～ 4. 18%），且照射劑量大于2 Gy 和3 Gy 時(shí)，假陽(yáng)性率分別小于30% 與20%（圖3）。這些研究結(jié)果再次說明，當(dāng)受照劑量大于2 Gy 時(shí)，基于dic 自動(dòng)化分析估算的劑量用于臨床分類診斷是可行的[14] 。

3. 3 dic 半自動(dòng)化和人工分析用時(shí)比較

國(guó)外有報(bào)道顯示，半自動(dòng)化分析可明顯提高人工分析的工作效率。如人工分析50 個(gè)核型和自動(dòng)化分析計(jì)數(shù)150 個(gè)核型可以對(duì)受照者或懷疑受照者進(jìn)行初步分類診斷，但熟練和有經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)技術(shù)人員計(jì)數(shù)50 個(gè)核型至少需要60 min，自動(dòng)化分析計(jì)數(shù)150 個(gè)核型僅需20 min，且人工確認(rèn)dic 平均只需2 min，自動(dòng)化分析可將人工分析的工作效率提高30 倍[6] 。

“省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”用Metafer 4 系統(tǒng)采集200 個(gè)高倍圖像，分別用DCScore 和Ikaros 軟件進(jìn)行dic半自動(dòng)化和人工分析，比較兩種計(jì)數(shù)方法所用時(shí)間（見表1）[14] 。由于兩種分析均需要借助染色體掃描系統(tǒng)進(jìn)行全玻片自動(dòng)化中期相捕獲及高倍圖像采集，所需時(shí)間同為25 min。對(duì)系統(tǒng)采集的200個(gè)高倍圖像平均按150 個(gè)圖像可供人工分析，依據(jù)每個(gè)圖像包含dic 數(shù)（0～ n 個(gè)）不同，“省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”分析1 個(gè)圖像所用時(shí)間一般在0. 5～1. 5 min之間，每個(gè)圖像平均按1 min 計(jì)算，人工分析平均需要用時(shí)150 min，而自動(dòng)化分析和候選dic 的人工確認(rèn)只需要用時(shí)3 min，人工分析所用時(shí)間是半自動(dòng)化分析的6. 25 倍。同時(shí)，根據(jù)自動(dòng)化分析所得候選dic 的多少，對(duì)其人工確認(rèn)用時(shí)在1 ～ 3 min之間，平均為2 min，所以半自動(dòng)化分析可將人工工作效率提高75 倍。因此，相較于人工分析，dic半自動(dòng)化分析使劑量估算效率和人工工作效率兩方面均得到明顯提高。

3. 4 自動(dòng)化分析需計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)

為了解dic 半自動(dòng)化分析在核與輻射應(yīng)急響應(yīng)分類診斷中應(yīng)計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)，法國(guó)學(xué)者Gruel等[15] 在一次應(yīng)急演練中模擬了不同輻射場(chǎng)景的50 例受害者，模擬的全身照射外周血樣品的照射劑量為0 ～ 4. 7 Gy，模擬的局部照射是將照射與未照射血液樣品按照不同的比例混合，然后進(jìn)行dic自動(dòng)化檢測(cè)和估算劑量。結(jié)果顯示，在34 個(gè)模擬全身照射的血液樣品中，有32 個(gè)樣品從第一張染色體標(biāo)本上自動(dòng)化檢測(cè)300～400 個(gè)細(xì)胞估算的劑量與照射劑量基本一致，可以給出較為可靠的分類診斷，但對(duì)于局部照射，只在較高的照射劑量點(diǎn)（3. 7 Gy）才能做出較為正確的分類。此外，無論是模擬的全身或是局部照射，每增加一張分析的標(biāo)本，均可對(duì)分類做出校正。所以，以自動(dòng)化檢測(cè)300～400 個(gè)細(xì)胞估算劑量進(jìn)行初步分類診斷是可行的。對(duì)于最終的劑量估算需要自動(dòng)化分析的細(xì)胞數(shù)則主要取決于初始估計(jì)劑量以及物理劑量和受照者臨床癥狀等的信息。該文作者建議，劑量大于1 Gy 時(shí)應(yīng)自動(dòng)化分析1 500 個(gè)細(xì)胞，劑量較低或懷疑受到局部照射時(shí)分析細(xì)胞數(shù)應(yīng)增加到3 000 個(gè)。

美國(guó)學(xué)者Ryan 等[16] 關(guān)于dic 自動(dòng)化分析估算劑量在輻射應(yīng)急響應(yīng)分類診斷中應(yīng)計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)研究中，通過調(diào)整Metafer 系統(tǒng)中期相捕獲算法和提高DCScore 軟件自動(dòng)化檢測(cè)dic 的靈敏度，在不需要人工干預(yù)去除假陽(yáng)性dic 的情況下，自動(dòng)化檢測(cè)150 個(gè)左右的細(xì)胞估算的劑量就能較好的區(qū)分出照射劑量為0. 5 ～ 3. 0 Gy 的模擬X 或γ 射線照射，認(rèn)為dic 自動(dòng)化分析可有效的應(yīng)用于發(fā)生大規(guī)模核與輻射事故時(shí)快速的臨床分類診斷。筆者的研究得到類似結(jié)果，當(dāng)照射劑量大于2 Gy 時(shí)，自動(dòng)化檢測(cè)100～200 個(gè)細(xì)胞估算的劑量可用于臨床分類診斷。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，以分類診斷為目的人工計(jì)數(shù)50 個(gè)細(xì)胞與自動(dòng)化分析150 個(gè)細(xì)胞的分類效率是類似的[12] 。因此，當(dāng)大規(guī)模人群受到照射且以分類診斷為目的時(shí)，自動(dòng)化分析150 個(gè)細(xì)胞可用于事故受照者早期快速的臨床分類診斷。

4 dic 半自動(dòng)化分析估算生物劑量的應(yīng)用實(shí)踐

4. 1 非洲達(dá)喀爾輻射事故受照者的生物劑量估算

法國(guó)學(xué)者Vaurijoux 等[13] 首次在國(guó)際上將基于dic 半自動(dòng)化分析構(gòu)建的劑量曲線，應(yīng)用于達(dá)喀爾（Dakar）192 Ir 源輻射事故受照者的生物劑量估算。他們利用實(shí)驗(yàn)室留存的46 例受照者的染色體標(biāo)本片進(jìn)行了dic 半自動(dòng)化分析，將dic 半自動(dòng)化分析和早先dic 人工分析得到的46 例事故受照者的每細(xì)胞dic 數(shù)， 分別代入人工分析方程式Y(jié)MS =（0. 001 3±0. 001 0） +（0. 049 1± 0. 010 0）D +（0. 045 2 ± 0. 007 7） D2 和半自動(dòng)化分析方程式Y(jié)ADS =（0. 000 8±0. 000 4）+（0. 007 0± 0. 002 6）D+（0. 021 7±0. 001 6）D2 估算劑量。結(jié)果顯示，人工計(jì)數(shù)50 個(gè)細(xì)胞與計(jì)數(shù)500 個(gè)細(xì)胞估算的劑量?jī)烧叻诸愂苷照咴斐傻恼`差達(dá)到50%，而人工計(jì)數(shù)500 個(gè)細(xì)胞與半自動(dòng)化分析500 個(gè)以上細(xì)胞估算的劑量?jī)烧叻诸愂苷照咴斐傻恼`差僅為4. 35%。而且半自動(dòng)化分析比人工分析要快20 倍，如每位分析者半自動(dòng)化分析1 000 個(gè)細(xì)胞與用人工分析50 個(gè)細(xì)胞所用時(shí)間一樣。所以，用dic 自動(dòng)化分析軟件半自動(dòng)化檢測(cè)dic 估算劑量可以代替常規(guī)的人工分析估算劑量，而且與人工分析相比，自動(dòng)化分析速度更快、估算劑量更準(zhǔn)確，是發(fā)生大規(guī)模核與輻射事故時(shí)較為理想的生物劑量估算方法。

4. 2 dic 半自動(dòng)化分析用于不同輻射場(chǎng)景估算劑量的可行性

電離輻射誘發(fā)的dic 率為泊松分布，可以準(zhǔn)確估算急性均勻照射場(chǎng)景下的受照劑量，但也可以根據(jù)dic 的分布情況和一些數(shù)學(xué)模型如Dolphin’s模型估算局部和遷延性照射輻射暴露場(chǎng)景下的受照劑量。由于半自動(dòng)化分析檢出的dic 率屬于泊松分布，是否也可以用于不同輻射場(chǎng)景條件下的劑量估算？ 為此，來自歐盟的學(xué)者Romm 等[17] 利用6 家網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室已建立的基于dic 半自動(dòng)化分析構(gòu)建的劑量曲線，采集33 例健康人的血液樣品用60 Co γ 射線離體照射，分別模擬急性全身、局部和遷延性照射3 種輻射暴露場(chǎng)景，每個(gè)暴露場(chǎng)景分別選用3 個(gè)不同的照射劑量。照射后的血液樣品雙盲編號(hào)后運(yùn)送到參加該項(xiàng)研究的不同實(shí)驗(yàn)室。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室按照各自實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)與制片，標(biāo)本片用半自動(dòng)化分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)dic，每例樣品計(jì)數(shù)300 個(gè)中期細(xì)胞，將半自動(dòng)化分析得到的每細(xì)胞dic 數(shù)代入前期基于dic 半自動(dòng)化分析構(gòu)建的劑量-效應(yīng)曲線估算劑量。結(jié)果顯示在模擬的均勻照射條件下，所有實(shí)驗(yàn)室均能將0、0. 5、2. 0 和4. 0 Gy 劑量點(diǎn)區(qū)分開，而且在大多數(shù)樣品中估算的劑量與實(shí)際照射劑量的誤差在±0. 5Gy 范圍內(nèi);在模擬的遷延性照射條件下，所有實(shí)驗(yàn)室均能將1. 0、2. 0 和4. 0 Gy 劑量點(diǎn)區(qū)分開，大多數(shù)樣品中估算的劑量與實(shí)際照射劑量的誤差亦在±0. 5 Gy 范圍內(nèi);在模擬的局部照射條件下，所有實(shí)驗(yàn)室均能將2. 0、4. 0 和6. 0 Gy 劑量點(diǎn)區(qū)分開，僅在幾個(gè)樣品中估算的劑量與實(shí)際照射劑量的誤差在±0. 5 Gy 范圍內(nèi)，這可通過增加自動(dòng)化檢測(cè)細(xì)胞數(shù)來降低誤差率。

該項(xiàng)由6 家國(guó)際實(shí)驗(yàn)室參加的研究結(jié)果提示，dic 半自動(dòng)化檢測(cè)方法與人工分析一樣，亦有用于受不同輻射場(chǎng)景照射后較為準(zhǔn)確地對(duì)受照者進(jìn)行分類的潛能。在發(fā)生大規(guī)模核與輻射事故時(shí)，該方法是對(duì)受照人群進(jìn)行高通量篩查分類的有用工具。

4. 3 dic 半自動(dòng)化分析估算劑量用于臨床分類診斷的可行性

鑒于dic 自動(dòng)化分析檢出的dic 真陽(yáng)性率與照射劑量呈正相關(guān)，“省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室” 探討了利用自動(dòng)化或半自動(dòng)分析檢出的dic 率估算劑量用于臨床分類診斷可行性[14] 。利用DCScore 軟件（德國(guó)CARL ZEISS 公司）半自動(dòng)化分析dic，擬合基于每細(xì)胞dic 的劑量-效應(yīng)曲線，并用“省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”參加全國(guó)生物劑量估算比對(duì)的12 份考核樣品（0. 7～4. 5 Gy）估算劑量進(jìn)行驗(yàn)證。將自動(dòng)化分析檢測(cè)到的12 份考核樣品人工確認(rèn)前后的每細(xì)胞dic 數(shù)，代入基于γ 射線照射的dic 半自動(dòng)化分析構(gòu)建的回歸方程Y = 0. 024 628 D2 +0. 044 228 D +0. 000 195 4 估算劑量。結(jié)果顯示dic 人工確認(rèn)前，照射劑量大于2 Gy 時(shí)估算的劑量與實(shí)際照射劑量的相對(duì)偏差均≤20. 48%，大于3 Gy 時(shí)估算劑量的相對(duì)偏差均≤11. 11%;dic 人工確認(rèn)后估算的劑量與實(shí)際照射劑量的相對(duì)偏差均≤10%，接近于真實(shí)照射劑量。而且除0. 7 Gy 外，照射劑量為1. 4、1. 7、1. 9 Gy 用dic 自動(dòng)化分析估算的劑量分別為1. 97、2. 33 和2. 44 Gy，分別可分類為輕度、中度偏輕骨髓型放射病。因此，dic 自動(dòng)化分析用于輕度、中度和重度骨髓型急性放射病的初步分類是可行的。這表明dic 半自動(dòng)化分析可以用于核與輻射事故受照者的劑量估算和臨床分類診斷，特別是在發(fā)生大規(guī)模核與輻射事故，受照人員較多時(shí)，可用人工確認(rèn)前檢測(cè)的dic 數(shù)估算劑量，對(duì)受照者區(qū)分出不同的受照劑量區(qū)間，做出更快速的初步分類診斷。

4. 4 延遲采樣和局部照射受照者的生物劑量估算

在生物劑量估算實(shí)踐中，大多數(shù)是照后短時(shí)間內(nèi)因及時(shí)發(fā)現(xiàn)事故而進(jìn)行生物劑量估算，但也有一些事故在照后幾個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間，患者因健康出現(xiàn)問題就醫(yī)時(shí)通過染色體畸變分析估算劑量才被發(fā)現(xiàn)，此類案例因采血延遲、非穩(wěn)定性染色體畸變丟失而造成估算劑量偏低。因此，IAEA 推薦可用不同數(shù)學(xué)模型對(duì)受照者進(jìn)行回顧性生物劑量的重建， 修正因延遲采血而造成的估算劑量誤差[3] 。

“省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”利用dic 人工和半自動(dòng)化分析估算劑量確診了一例介入術(shù)后7 個(gè)月疑似因X射線介入手術(shù)致背部皮膚大面積放射性皮膚損傷的患者，并依據(jù)dic 的分布重建了該患者的生物劑量[18] 。術(shù)后203 d 采集患者肝素抗凝靜脈血進(jìn)行微量全血培養(yǎng)，采用國(guó)際學(xué)界公認(rèn)的免費(fèi)生物劑量估算軟件CABAS，利用“省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”基于dic半自動(dòng)化與人工分析、dic+r 人工分析構(gòu)建60 Co γ射線離體照射人外周血的劑量-效應(yīng)曲線及GB / T28236—2011 標(biāo)準(zhǔn)[5] 推薦曲線，估算患者的受照劑量、泊松分布u 檢驗(yàn)值和身體受照份額等。結(jié)果顯示患者術(shù)后7 個(gè)月，基于每細(xì)胞dic 或dic+r 估算的一次全身等效吸收劑量在0. 68 ～ 0. 95 Gy 之間，dic 半自動(dòng)化分析估算的劑量低于dic 或dic+r人工分析估算劑量，包括國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)推薦曲線在內(nèi)的3 條不同劑量率的人工分析曲線估算的劑量非常接近，半自動(dòng)化與人工分析估算劑量的相對(duì)偏差為27% ～28%，均表明該患者受到過量照射或?yàn)檩p度骨髓型急性放射病。泊松分布u 檢驗(yàn)和身體受照份額的估算結(jié)果顯示的u 值均大于| 1. 96 |，σ2 / y 均大于1. 00，dic 或dic+r 不符合泊松分布，為過離散分布，患者受到局部不均勻照射，身體受照份額為37. 02%?？梢奷ic 半自動(dòng)化分析對(duì)于局部照射估算劑量以及對(duì)于事故受照者臨床分類診斷都是可行的， 有推廣應(yīng)用價(jià)值。此外， 利用IAEA 推薦的Dolphin’s 模型來修正因延遲采血而造成的估算劑量誤差方面，dic 半自動(dòng)化和人工分析估算的該患者劑量分別為2. 15 Gy（CI，1. 98 ～2. 32 Gy）和2. 48 Gy（CI，2. 33 ～ 2. 64 Gy），估算的劑量相當(dāng)于照后短時(shí)間內(nèi)的全身平均吸收劑量，2種分析方法重建的劑量基本一致，說明dic 半自動(dòng)化分析亦可重建和修正因延遲采血而造成的估算劑量誤差。

5 結(jié)論和展望

dic 半自動(dòng)化分析估算生物劑量已在國(guó)際上推廣應(yīng)用10 余年，技術(shù)成熟度高，不但能明顯提升生物劑量估算的效率，還降低了對(duì)專業(yè)人員技術(shù)熟練程度的門檻要求，更有利于推廣應(yīng)用。相比而言，我國(guó)dic 半自動(dòng)化分析估算生物劑量起步較晚，但進(jìn)展迅速。本專家共識(shí)從dic 半自動(dòng)化分析原理、主要技術(shù)內(nèi)容、影響因素分析和應(yīng)用實(shí)踐等方面給出了dic 半自動(dòng)化分析估算生物劑量的技術(shù)共識(shí)，其主要技術(shù)內(nèi)容與現(xiàn)有GB / T 28236 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[5] 相比有一定特色和優(yōu)勢(shì)。一是引入了染色體標(biāo)本的自動(dòng)化制備技術(shù)，不需要專業(yè)人員制備標(biāo)本的經(jīng)驗(yàn)積累，能確保制備出的標(biāo)本質(zhì)量穩(wěn)定可靠，提高生物劑量估算的成功率;二是dic 半自動(dòng)化分析不但能明顯提高檢測(cè)效率，還由于降低了專業(yè)人員識(shí)別畸變的技術(shù)要求，可更好推廣應(yīng)用;三是引入了軟件擬合曲線和估算劑量，省去了復(fù)雜的計(jì)算過程。通過對(duì)影響因素的分析和實(shí)用舉例可見，dic 半自動(dòng)化分析與人工分析一樣，除可用于急性均勻照射估算劑量外，同樣可用于局部、遷延性照射和延遲采樣等輻射暴露場(chǎng)景下的受照劑量估算與重建，而且在一定照射劑量范圍內(nèi)，自動(dòng)化而非人工干預(yù)檢測(cè)dic 估算的劑量用于臨床分類診斷是可行的。因此，dic 半自動(dòng)化分析估算生物劑量，完全可以代替常規(guī)的人工分析估算劑量，而且與人工分析相比，半自動(dòng)化分析速度更快、估算劑量更準(zhǔn)確，是發(fā)生大規(guī)模核與輻射事故時(shí)較為理想的生物劑量估算方法。

展望未來，為了有效應(yīng)對(duì)大規(guī)模核與輻射事故，生物劑量估算應(yīng)該滿足自動(dòng)化、快速和高通量的要求，且需要與臨床指標(biāo)、物理劑量估算相互佐證。具體操作層面，國(guó)際上已有較為成熟的實(shí)踐，通過建立全流程細(xì)胞遺傳指標(biāo)的全自動(dòng)化分析技術(shù)，明顯提高了生物劑量估算的通量和效率[19] 。但國(guó)內(nèi)有關(guān)高通量估算生物劑量的研究相對(duì)滯后，目前僅建立了dic 半自動(dòng)化分析估算生物劑量方法。利用人工智能技術(shù)自動(dòng)化檢測(cè)dic 等指標(biāo)，研發(fā)出從細(xì)胞接種、收獲、制片/ 滴片、圖像采集和遺傳指標(biāo)分析全流程自動(dòng)化的高通量生物劑量估算平臺(tái)，是未來提升國(guó)內(nèi)生物劑量估算效率和通量的主要目標(biāo)，也是國(guó)內(nèi)同行值得關(guān)注和重點(diǎn)研發(fā)的發(fā)展方向，以便更好地為我國(guó)核與輻射事業(yè)的發(fā)展保駕護(hù)航。

利益沖突：所有作者宣稱沒有任何利益沖突， 未接受任何不當(dāng)利益。

參考文獻(xiàn)：

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