摘要： 【目的】探究從禿杉Taiwania flousiana 中提取得到的除草活性物質(zhì)禿杉素（4-O-α-thevetopyranosyldiphyllin，TSC-3） 對水生植物水綿Spirogyra communis 的抑制活性和對其葉綠體的影響?！痉椒ā坎捎靡掖驾腿?分光光度法測定禿杉素對水綿葉綠素和類胡蘿卜素的IC50。采用顯微鏡以及透射電鏡技術(shù)觀察不同質(zhì)量濃度禿杉素對水綿顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的影響?！窘Y(jié)果】經(jīng)禿杉素處理7 d 后，水綿的類胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b 及總色素的IC50 分別為3.41、31.50、47.34 和29.30 mg·L?1。禿杉素能破壞水綿細(xì)胞的細(xì)胞壁，引起細(xì)胞膜消失、葉綠體解體、類囊體完全消失、淀粉粒分散以及蛋白核降解和碎片化?！窘Y(jié)論】禿杉素可降低水綿葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素的含量，對類胡蘿卜素的抑制較其他色素更強(qiáng)；禿杉素主要作用于葉綠體和細(xì)胞壁。本研究為解釋植物源除草化合物禿杉素的除草機(jī)理提供了基礎(chǔ)的理論依據(jù)，也為水生藻類的防控提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 植物源除草劑；禿杉素；水綿；葉綠體；類囊體

中圖分類號： S482.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 1001-411X（2024）03-0371-10

天然源農(nóng)藥作為可持續(xù)綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要組成部分，具有綠色、安全和高效等特點(diǎn)。近年來由于對綠色食品和無公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)需求迫切，大量高毒高殘留化學(xué)農(nóng)藥被逐步淘汰出市場，天然源農(nóng)藥研究開發(fā)成為熱點(diǎn)。從自然界尋找具除草活性的先導(dǎo)化合物是新型除草劑創(chuàng)制的一個重要途徑，也是本領(lǐng)域的熱點(diǎn)，開展安全和高效的綠色農(nóng)藥研究也是國家重大需求。隨著化學(xué)合成除草劑的大量使用，雜草抗藥性愈發(fā)嚴(yán)重，截至2023 年6 月，已有267 種雜草（包括154 種雙子葉和113 種單子葉） 對目前3 1 個除草劑靶標(biāo)中的2 1 個（涉及165 種除草劑） 產(chǎn)生了抗性[1]。因此，對新型除草劑，特別是對具有新靶標(biāo)的新型除草劑的需求越來越迫切。然而，在過去40 年中鮮見新作用靶標(biāo)的除草劑問世[2-3]。天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型多樣，在長期的進(jìn)化中，可能形成了獨(dú)特的作用機(jī)理，這一直是新型除草劑的研發(fā)熱點(diǎn)[4]。

禿杉Taiwania flousiana 屬于杉科臺灣杉屬，禿杉素（4-O-α-thevetopyranosyldiphyllin，TSC-3） 是華南農(nóng)業(yè)大學(xué)周利娟課題組從禿杉里面分離出來的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高除草活性的芳基萘內(nèi)酯類化合物[ 5 ]。研究發(fā)現(xiàn)，禿杉素對薇甘菊Mikaniamicrantha 、勝紅薊Ageratum conyzoides 和三葉鬼針草Bidens pilosa 等常見雜草的生長具有顯著抑制作用[6]。水綿Spirogyra communis 為綠藻門雙星藻科水綿屬的藻類，屬于低等水生植物，在淡水水域廣泛分布[7]。水綿為真核多細(xì)胞藻類，其形態(tài)結(jié)構(gòu)簡單，由長筒狀的細(xì)胞組成，形成一條單列絲狀體，常呈團(tuán)狀分布于透明度較高的水體中[8]。在光照充足、水流較為緩慢的水域中，水綿能充分進(jìn)行光合作用，并通過接合生殖產(chǎn)生孢子，從而繁殖新個體，并隨著水流傳播。然而，水綿在水體中大量暴發(fā)時，浮游態(tài)的水綿會附著在水面，阻隔光線，阻擋水下藻類及植物的光合作用，降低水體的溶氧含量，易引起水體污染，威脅水生生物的生存，引發(fā)水生態(tài)系統(tǒng)的失衡。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，光照能提高禿杉素活性，推測禿杉素可能對葉綠體有影響，由于水綿結(jié)構(gòu)相對簡單，其葉綠體便于觀察研究，且水綿的防治也是十分重要的，因此，本研究選擇水綿作為研究材料，探究禿杉素對其葉綠體的影響，旨在為研究禿杉素的除草分子機(jī)理提供理論參考，為新型植物源除草化合物禿杉素的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，同時為水綿的防治提供重要參考[9]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：水綿采于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)濕地公園。主要試劑、藥品：禿杉素由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)周利娟課題組提供。主要儀器：ZEISS Axio Imager M2 熒光顯微鏡，ZEISS Microscopy，德國；FEI Tecnai 12 透射電鏡（TEM），荷蘭。

1.2 試驗(yàn)方法

藻類依賴于葉綠體進(jìn)行光合作用為其生長發(fā)育提供能量，測定禿杉素對水綿的葉綠素含量的影響，可反映禿杉素對水綿生長活性的抑制程度。取相同質(zhì)量的水綿，以不同質(zhì)量濃度禿杉素處理，每隔24 h 分別在470、663 和645 nm 采用乙醇萃取?分光光度法測定吸光度[10]，得到葉綠素和類胡蘿卜素的含量。通過與空白組比較，得到禿杉素對葉綠素和類胡蘿卜素的抑制率。

1.2.1 水綿培養(yǎng)

稱量水綿20 g（鮮質(zhì)量），放入盛有500 mL BG11 培養(yǎng)液的1 000 mL 錐形瓶中，置于光照強(qiáng)度4 000 lx、溫度（25±2） ℃、16 h 光照/8 h 黑暗的光照培養(yǎng)箱中，每日定時換水，進(jìn)行5 d以上的適應(yīng)性培養(yǎng)。

1.2.2 溶液配制

將禿杉素用DMSO 溶解稀釋成質(zhì)量濃度為40.0、20.0、10.0、5.0 和2.5 mg·L?1 的溶液，有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)控制在5/1 000，以清水為對照。

1.2.3 禿杉素對水綿的抑制活性測定

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定濃度梯度，設(shè)置5 個處理組和1 個空白對照組，每組3 個重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3 次。用吸水紙吸干水綿后放入勻漿器中，加入2 mL 體積分?jǐn)?shù)為95% 的乙醇溶液，研磨3 min，待水綿細(xì)胞完全勻漿后，將研磨液轉(zhuǎn)移至10 mL 避光離心管中，加入乙醇定容至10 mL。靜置24 h 后，充分搖勻，4 000r/min 離心10 min，取上清液5 mL，通過分光光度計測定在470、663 和645 nm 處吸光度。

根據(jù)以下公式計算葉綠素和類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度：

ρ（葉綠素a）=12.21D663 nm?2.81D646 nm，

ρ（葉綠素b）=20.13D646 nm?5.03D663 nm，

ρ（葉綠素） =ρ（葉綠素a）+ρ（葉綠素b）=17.32D646 nm?7.18D663 nm，

ρ（類胡蘿卜素）=[1 000D470 nm?3.27ρ（葉綠素a）?10.04ρ（葉綠素b）]/229，

ρ（總色素）= ρ（葉綠素a）+ρ（葉綠素b）+ρ（類胡蘿卜素） = ρ（葉綠素）×Vn/m（V=0.01 L ，n=1，m=0.06 g），

式中，V 為色素提取浸提混合液的體積， n 為測定葉綠素稀釋倍數(shù)， m 為樣品的質(zhì)量。

水綿抑制率計算公式為：

抑制率=[ρ對照（葉綠素）–ρ處理（葉綠素）]/ρ對照（葉綠素）×100%。

.2.4 禿杉素對水綿纖維結(jié)構(gòu)的影響

用刀片將水綿切成邊長為2 mm 的正方形，置于載玻片上，蓋上蓋玻片，制成臨時裝片，置于顯微鏡下觀察。

1.2.5 禿杉素對葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

以含2.5mg·L?1 禿杉素的霍格蘭營養(yǎng)液處理水綿7 d，以清水作為對照。參考Nicolas 等[11] 的方法，并稍作修改， 水綿以蒸餾水洗凈， 迅速取下根尖放入4%（φ） 戊二醛固定液中1 d 后，用磷酸緩沖液漂洗次，每次10 min。以鋨酸固定2 h 后，磷酸緩沖溶液漂洗4 次，每次1 0 m i n。依次以體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、85% 和95% 的乙醇溶液梯度脫水，每次10 min。無水乙醇脫水2 次，每次30 min，分別用體積比為3∶1、1∶1 和1∶3 的無水乙醇與樹脂以及純樹脂進(jìn)行包埋，然后65 ℃ 聚合24 h 后，收集并清洗切片，到透射電鏡下觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計與分析

所有生物活性測定結(jié)果的數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用EXCEL 2007和SPSS 20.0 統(tǒng)計，方差分析采用Duncan’s 新復(fù)極差多重比較法，用Excel 2007 和Origin 2021 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 禿杉素對水綿的抑制活性

用禿杉素處理7 d 后，在2.5～40.0 mg.L?1 質(zhì)量濃度下，禿杉素對類胡蘿卜素的抑制率為46.25%～94.98%，顯著高于水綿的其他色素組分（表1 ）；處理7 d 后，禿杉素對水綿類胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b 及總色素的I C 5 0 分別為3 . 4 1 、3 1 . 5 0 、47.34 和29.30 mg·L?1（表2）?？偟膩砜?，禿杉素對水綿類胡蘿卜素的抑制較其他色素更強(qiáng)。

2.2 禿杉素對水綿顯微結(jié)構(gòu)的影響

水綿細(xì)胞為長條形，有細(xì)胞壁，細(xì)胞橫壁為平直型，顏色呈淡綠色；具有葉綠體，葉綠體呈絲狀螺旋結(jié)構(gòu)圍繞于細(xì)胞腔中，緊貼細(xì)胞壁內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)，均勻分布[ 1 2 ]。經(jīng)禿杉素處理3 d 后， 1 0 . 0 、20.0 和40.0 mg·L?1 處理后，單位面積內(nèi)葉綠體數(shù)量銳減（圖1）。禿杉素處理水綿7 d 后，對照組水綿螺旋結(jié)構(gòu)緊密，所有處理組均沒有完整且連續(xù)的水綿細(xì)胞，大部分細(xì)胞壁破裂。其中，2.5 mg·L?1處理組葉綠體碎片化，部分葉綠體堆積；5.0 mg·L?1處理組葉綠體解旋堆積成一片，部分葉綠體斷裂；10.0 mg·L?1 處理組葉綠體螺旋結(jié)構(gòu)解旋并斷裂，細(xì)胞壁破裂；20.0 mg·L?1 處理組葉綠體螺旋結(jié)構(gòu)松散，分散式分布；40.0 mg·L?1 處理組的葉綠體基本只剩破碎片段，單位面積內(nèi)只剩少量葉綠體。隨著處理濃度增大，葉綠體數(shù)量減少明顯（圖2）?？傮w來看，禿杉素對水綿細(xì)胞與細(xì)胞間的連接有明顯的破壞作用，導(dǎo)致細(xì)胞間斷裂；破壞葉綠體的螺旋結(jié)構(gòu)，造成螺旋結(jié)構(gòu)解體并分散，使帶狀葉綠體斷裂。

2.3 禿杉素對水綿細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 禿杉素對水綿細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的影響

水綿是由許多圓筒狀細(xì)胞連接而成。細(xì)胞壁外有很厚的果膠質(zhì)，手感滑膩。細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，通過原生質(zhì)絲與貼近細(xì)胞壁的細(xì)胞質(zhì)相連。細(xì)胞內(nèi)有1 個大液泡和1 至多條帶狀螺旋環(huán)繞于胞質(zhì)的葉綠體，且有多個淀粉粒[13]。處理7 d 后，水綿對照組細(xì)胞的縱切面細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞壁中纖維素層次分布均勻，排列整齊；細(xì)胞膜和細(xì)胞壁緊密相連，清晰可見；細(xì)胞質(zhì)分布均勻 （圖3A1、3A2 和3A3）。2.5 mg·L?1 處理組細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)已表現(xiàn)出受傷害癥狀，其細(xì)胞壁內(nèi)陷皺褶，細(xì)胞膜消失，核膜破裂，核質(zhì)外滲。細(xì)胞破裂導(dǎo)致其內(nèi)容物流出，導(dǎo)致無法觀察到細(xì)胞內(nèi)容物（圖3B1）。其次細(xì)胞壁中纖維素層次分布不均、黑化和紊亂，出現(xiàn)黑色小顆粒（圖3B2 和3B3）。

2.3.2 禿杉素對水綿細(xì)胞葉綠體的影響

水綿的每個細(xì)胞中有1 至多條帶狀葉綠體，含有葉綠素，可進(jìn)行光合作用，呈雙螺旋筒狀繞生于緊貼細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)的細(xì)胞質(zhì)中[14]。處理7 d 后，水綿對照組內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，具有類囊體、淀粉粒、蛋白核和嗜鋨顆粒 （圖4A1、4A2）。經(jīng)2.5 mg·L?1 禿杉素處理后，處理組葉綠體已經(jīng)不能維持其基本形狀，葉綠體外膜嚴(yán)重破裂，類囊體受到破壞。葉綠體碎片化，嗜鋨顆粒明顯增多（圖4B1）；可見剩下淀粉粒和蛋白核被破壞后的組織碎片（圖4B2）。

2.3.3 禿杉素對水綿細(xì)胞類囊體、淀粉粒的影響

類囊體被稱為光合反應(yīng)器，利用水作為光合作用反應(yīng)物，通過光合作用釋放氧氣。淀粉粒與淀粉的形成和貯藏有關(guān)。它是存在于葉綠體基質(zhì)中的大塊蛋白質(zhì)[15]。經(jīng)2.5 mg·L?1 禿杉素處理7 d 后，水綿的類囊體結(jié)構(gòu)被破壞，淀粉粒形狀改變，淀粉粒彼此之間變分散不再集中（圖5A）。而對照組葉綠體類囊體結(jié)構(gòu)完整，類囊體片層結(jié)構(gòu)與葉綠體表面呈平行方向排列，稠密而整齊，且片層結(jié)構(gòu)間的基質(zhì)清晰透明（圖5B2、5B3）。葉綠體中央的蛋白核外有淀粉粒，淀粉粒為腎型，4～5 個淀粉粒緊密聚合在一起（圖5B1）。

2.3.4 禿杉素對水綿細(xì)胞蛋白核的影響

蛋白核是一類存在于許多藻類的載色體中和陸生的角蘚門Anthocerotophyta 的葉綠體內(nèi)的一類亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[ 1 6 ] 。蛋白核與二氧化碳濃縮機(jī)制（ C O 2concentrating mechanism， CCM） 有關(guān)[17]。該結(jié)構(gòu)主要作用是作為CO2 固定的中心，它能在與光合作用相關(guān)的加氧酶周圍創(chuàng)造和維持一個高CO2 濃度環(huán)境[18]。

處理7 d 后，水綿的對照組蛋白核飽滿，均勻分布在淀粉粒中央，呈半流動狀（圖6A1、6A2）。經(jīng)2.5 mg·L?1 禿杉素處理組的蛋白核結(jié)構(gòu)被破壞降解，形成大量碎片，雜亂無章地分布在淀粉粒中央（圖6B1、6B2）。

2.3.5 禿杉素對水綿細(xì)胞其他結(jié)構(gòu)的影響

水綿為絲狀多細(xì)胞個體，色素體呈螺旋帶狀，每個細(xì)胞內(nèi)有1～16 條，可進(jìn)行光合作用，細(xì)胞中央有1 個大液泡，具有1 個細(xì)胞核，核周圍的細(xì)胞質(zhì)和四周緊貼細(xì)胞壁的細(xì)胞質(zhì)之間有多條呈放射狀的胞質(zhì)絲相連[19]。處理7 d 后，水綿對照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，核質(zhì)分布均勻，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器清晰可見，不存在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖7A）。經(jīng)2.5 mg·L?1 禿杉素處理7 d 后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，葉綠體周圍出現(xiàn)大量網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可能由于葉綠體膜被嚴(yán)重破壞，使其內(nèi)部的類囊體被破壞流出并與其他碎片混合在一起難以辨別，細(xì)胞基本成為空腔（圖7B1、7B2 和7B3）

以上結(jié)果表明，2.5 mg·L?1 禿杉素處理7 d 后，水綿細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和葉綠體受到破壞；細(xì)胞壁變薄，并且出現(xiàn)斷裂和破碎現(xiàn)象，導(dǎo)致細(xì)胞之間連接處的細(xì)胞壁已經(jīng)無法辨別；而細(xì)胞膜從緊貼細(xì)胞壁到質(zhì)壁分離，最終消失；葉綠體結(jié)構(gòu)解體，類囊體片層結(jié)構(gòu)完全消失；淀粉粒變得分散，結(jié)構(gòu)飽滿的蛋白核則被降解碎片化。這些結(jié)果說明禿杉素對水綿的作用主要集中在葉綠體和細(xì)胞壁上，與通過顯微鏡觀察得到的結(jié)果相一致。

3 討論與結(jié)論

從天然產(chǎn)物（例如植物、微生物等） 中得到具有生物活性的化合物一直是開發(fā)新農(nóng)藥的熱點(diǎn)。由于植物中含有許多具有除草、殺蟲以及殺菌等活性的化合物，因此利用天然產(chǎn)物作為先導(dǎo)物，通過化學(xué)合成或生物轉(zhuǎn)化方法獲得其有效組分成為目前研究熱點(diǎn)。目前已發(fā)現(xiàn)近百種具有除草活性的化合物，有些已開發(fā)為除草劑[20]?；钚愿叩幕衔锟芍苯娱_發(fā)成新型植物源除草劑，例如：壬酸是從牻牛兒苗科植物中得到的天然產(chǎn)物，具有廣譜、速效、觸殺和非選擇性的作用特點(diǎn)，可有效防除各種闊葉雜草和禾本科雜草，并且毒性低、對環(huán)境友好，已在多國推廣使用[21]。桃金娘科植物紅千層Callislemoncitrinus 中分離出的纖精酮（Leptosermone） 是一種4?羥基苯基丙酮酸雙氧酶（Hydroxyphenylpyruvatedehydrogenase） 抑制劑，在此基礎(chǔ)上衍生合成了一大類商品化的三酮類除草劑，例如磺草酮和硝磺草酮[22]。

在前期研究中發(fā)現(xiàn)禿杉素對植物光合系統(tǒng)有影響。葉綠體在光合作用過程中起重要作用[23]。葉綠體中的色素（如葉綠素和類胡蘿卜素） 在光合作用過程中具有重要作用，在不良條件下，植物細(xì)胞內(nèi)的色素含量會下降，從而導(dǎo)致光合效率下降，阻礙植物生長發(fā)育，因此色素含量在一定程度上可以反映植物的光合作用效率[24]。本研究發(fā)現(xiàn)禿杉素對水綿的葉綠素和類胡蘿卜素有顯著的抑制效果，其中對水綿類胡蘿卜素的抑制效果最好，其次是葉綠素a 和葉綠素b，這說明禿杉素可能抑制水綿色素的合成，從而影響水綿的光合作用，最終導(dǎo)致水綿的生理代謝無法正常進(jìn)行，影響了水綿的生長發(fā)育。

對水綿細(xì)胞的光學(xué)顯微分析結(jié)果表明，禿杉素會導(dǎo)致水綿細(xì)胞壁破碎，葉綠體螺旋解開。而細(xì)胞壁是保護(hù)水綿細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的重要器官。細(xì)胞壁可以抵御有害物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，一旦細(xì)胞壁受到破壞，各個細(xì)胞器功能會出現(xiàn)紊亂。葉綠體螺旋結(jié)構(gòu)解體，會使葉綠體彼此間失去聯(lián)系，減少了葉綠體與陽光接觸的面積，不利于其光合作用。通過透射電鏡超微分析結(jié)果可知，在禿杉素的作用下，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，葉綠體分解，蛋白核降解，僅剩淀粉粒。細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，導(dǎo)致其正常功能紊亂；葉綠體是水綿光合產(chǎn)能的場所，葉綠體的解體使水綿無法進(jìn)行光合作用，缺少能量而死亡；類囊體上有光合色素和電子傳遞鏈組分，類囊體結(jié)構(gòu)破環(huán)，只剩下淀粉粒，從而使得水綿無法進(jìn)行光合作用和呼吸等生理生命代謝活動，無法維持細(xì)胞的生命活動[25]；蛋白核是藻類蛋白質(zhì)與淀粉的一種貯藏形態(tài)，同時也與二氧化碳濃縮機(jī)制有關(guān)，蛋白核的降解使葉綠體無法固定高濃度的二氧化碳，無法進(jìn)行光合作用，最終使細(xì)胞缺少能量死亡。因此，禿杉素可通過破壞水綿的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使水綿無法進(jìn)行光合作用，缺少能量死亡，作用部位主要在類囊體、蛋白核和細(xì)胞壁。

綜上，新型芳基萘內(nèi)酯類除草劑禿杉素有良好的除草活性，其作用位點(diǎn)主要在葉綠體和細(xì)胞壁，通過直接破壞水綿葉綠體中的類囊體和蛋白核，使其喪失光合作用。此外，還能破環(huán)細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器破損流出，使水綿細(xì)胞出現(xiàn)空泡化。后續(xù)還需通過進(jìn)一步的研究來確定禿杉素對水綿的初始作用靶標(biāo)位點(diǎn)，明確具體的結(jié)合蛋白，提高其分子機(jī)理的認(rèn)識，為實(shí)現(xiàn)禿杉素除草化合物的產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

致謝：感謝華南農(nóng)業(yè)大學(xué)測試中心老師給予的支持和幫助！

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【責(zé)任編輯 莊 延】

基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金（2023A1515012306）